肝素钠提取原料中牛羊源成分的分子检测方法
肝素钠的提取技术
肝素钠的提取技术
肝素钠是一种广泛应用的抗凝血药物，它的抗凝作用可以显著抑制血液凝固，可以有效预防和治疗血栓形成。
目前，肝素钠的生产已经从纯化动物肝细胞中提取肝素钠改为采用全合成的方法，但是全合成的肝素钠的效果不如纯化的肝素钠。
因此，提取高质量的肝素钠仍然是一项重要的工作。
肝素钠的提取一般采用蒸馏、萃取、沉淀等方法，并配合各种溶剂进行提取。
首先，将动物肝细胞细胞质经过碾磨、离心、沉淀等步骤提取出肝素钠，然后采用乙醇溶液或甲醇溶液进行提取，最后将溶液冷却过滤，即可得到肝素钠溶液。
此外，还可以采用膜分离技术提取肝素钠，其原理是通过膜分离技术，将肝素钠与其他溶质分离，再采用沉淀法进行纯化。
此外，还可以采用高压溶剂萃取技术提取肝素钠，将肝素钠与其他溶质分离，然后采用沉淀法进行纯化。
综上所述，肝素钠的提取技术涉及到蒸馏、萃取、沉淀等方法，以及高压溶剂萃取技术和膜分离技术等。
这些技术都可以有效提取高质量的肝素钠，为抗凝药物的生产提供可靠的原料。
牛肺肝素提取新工艺(中试实验)
牛肺肝素提取新工艺
⑴原料处理：取新鲜的牛肺（或冷冻牛肺自然解冻之后），清洗去污，剥离气管，绞碎成肉糜状。
匀浆处理，进入下一道工序。
如匀浆料不能迅速处理完毕，则需要加入防腐剂贮存或低温存放。
⑵超声处理：将匀浆料置于超声处理器中，按照超声功率300 W、超声40 min、超声温度40℃进行超声处理。
⑶酶解提取：超声结束后，将匀浆料用少量稀碱液（4%NaOH）调至pH，然后加入蛋白酶水解，连续搅拌，并保持稳定的pH，酶解2 h以上。
⑷分级盐析：酶水解后的浆料，用4%和5%比例的NaCl进行分级，保持液温、料液pH的稳定。
⑸去除蛋白：盐析去除沉淀物后的浆料，添加蛋白沉淀剂，过滤除去杂质，离心收集上清液，进入分离纯化工序。
⑹模拟移动床离子交换系统分离纯化肝素：脱盐浓缩后的肝素粗提液用SMB分离纯化，其工艺参数采用进料速度20 mL/min，洗脱液浓度为2 mol/L NaCl，洗脱速度为20 mL/min，温度45℃，pH 8.0，切换时间12 min。
收集SMB的2 mol/L NaCl洗脱液，将其脱盐、浓缩、沉淀，沉淀物进行真空干燥，即得到肝素产品。
对制备的牛肺肝素进行检测，其得率为189±0.6 mg/kg，所得产品纯度可达98%以上，效价为160 U/mg，符合中国药典（2005第二部）中肝素钠的质量指标。
肝素钠效价方法
肝素钠效价方法2. 1 羊血浆的制备取冷冻贮藏的绵羊血浆,置于不超过37 ℃的水浴融化,以脱脂棉过滤至清洁干燥的玻瓶中备用。
取血浆1 mL 置试管内,加入0. 25 %氯化钙溶液0. 8mL ,混匀,在(37 ±1) ℃水浴中保温,若在5 min 内凝结,则血浆可用于实验。
2. 2 标准品溶液的制备取肝素钠标准品(204 u/ mL) 适量,用煮沸放冷的纯化水稀释至100 u/ mL ,置4 ℃冷藏备用。
临用前用生理盐水精确稀释至7 u/ mL 。
2. 3 供试品溶液的制备称取肝素钠原料或量取肝素钠注射液适量,按估计效价用生理盐水稀释至与标准溶液相当的效价浓度。
2. 4 血浆半凝固度剂量(V1/ 2) 的测定取具塞试管3 支,分别于各试管中加入梯度剂量(170 ,200 ,230μL) 的标准溶液,再按顺序准确加入血浆1. 0 mL ,0. 25 %氯化钙溶液0. 8 mL ,立即加塞,倒置混合3 次,置(37 ±0. 5) ℃恒温水浴中保温,准确记录1 min ,判断每管凝结程度,结果判定V1/ 2在200μL 左右。
以此为中点,左右各以10μL 为一级,同法操作,测定V1/ 2为190μL 。
2. 5 肝素钠及其制剂的效价测定取具塞试管若干支,分别于各试管中加入梯度剂量的标准溶液和供试品溶液,以190μL 为中点,每隔10μL 为一级,同2. 3 项下方法操作,记录每管凝结程度,按式(1) 计算。
供试品的效价单位= V std ×C std ×VV sam ×W sam(1)式中:V std. 标准品1/ 2 凝固度的肝素加入体积(μL) ;C std. 标准品溶液的浓度(u/ mL) ; V sam. 供试品1/ 2 凝固度时的加入体积(μL) ;W sam. 供试品称取的重量(mg) ; V. 测定样品的总体积(mL)。
HPLC法测定肝素钠原料中EDTA―2Na的残留共5页文档
HPLC法测定肝素钠原料中EDTA―2Na的残留肝素钠是从猪小肠黏膜中提取精制的含有硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属于不均一的多糖分子，通常分子量在3000～30000道尔顿，临床常作为注射剂使用。
肝素钠本身带负电荷，能干扰血凝过程的许多环节，其作用机制比较复杂，主要通过与抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）结合，而增强后者对活化的Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ和Ⅻ凝血因子的抑制作用。
具体涉及阻止血小板凝集和破坏，妨碍凝血激活酶的形成；阻止凝血酶原变为凝血酶；抑制凝血酶，从而妨碍纤维蛋白原变成纤维蛋白。
肝素钠作为原料药，中国药典中明确规定了其重金属限度的检测，但由于其来源于动物组织提取，实际生产工艺中均要增加去除重金属的工艺。
目前多采用添加EDTA-2Na来螯合重金属，形成水溶物后，经分级沉淀步骤去除螯合物。
EDTA-2Na收载于FDA《非活性组分指南》，可用于非注射和注射给药制剂，会与人体内的钙离子形成螯合物，引起低血钙等症状。
由于肝素钠生产过程中使用EDTA-2Na去除重金属，所以在终产品中可能残留EDTA-2Na，对其进行检测有重要的意义。
1仪器与材料11仪器TG332A型分析天平（湘仪天平仪器设备有限公司）；LC-15C 型高效液相色谱仪（日本岛津）；LC-20AD型紫外检测器（日本岛津）；1.2材料硫酸铜（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；EDTA-2Na （分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；肝素钠（注射级，批号：HM120401、HM120402、HM120403，石家庄市协和药业有限公司）。
水为自制纯化水（二级反渗透法）。
2方法与结果2.1色谱条件色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填料WondaSilC18（200mm×46mm×5μm）；流动相：0025mol/l硫酸铜溶液（用稀硫酸调节pH至30）；检测波长：254nm；流速：10ml/min；检测温度：室温；进样量：20μl。
2.2溶液的制备2.2.1空白溶液的制备精密量取004mol/l硫酸铜溶液10ml，置50ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
肝素
低分子量肝素的活性/抗凝血活性的比值为1.5～4.0，而普通的肝素为1，保持了肝素的抗血栓作用而降低了 出血的危险。具有半衰期长，生物利用度高等优点，正广泛应用于血栓栓塞性疾病的预防及治疗，其有效性和安 全性均优于普通肝素，量效关系明确，可用固定剂量无需实验室监测调整剂量，应用方便。有实验证明:来自水蛭 素的Hiru-log多肽比肝素抗凝安全。低分子量肝素可以降低鼠移植肾脏免疫活性。方法:异体移植受体皮下注射 低分子量肝素2mg/（kg·d），每周5天，持续24周。结果:低分子量肝素治疗后移植肾单核吞噬细胞，T细胞的浸 润减少，主要组织相容性抗原M HC-Ⅱ的表达降低。实验结果表明:低分子量肝素可以降低鼠移植肾脏免疫活性从 而减轻移植肾脏慢性排斥反应。
外观与性状：白色或类白色结晶粉末 密度：2.18 g/cm3 沸点：644.9ºC at 760mmHg 闪 点 ： 3 4 3 . 8 ºC 折射率：1.711 稳定性：吸湿性，可以在室温下保存至少12个月的钠盐。 储存条件：保存在阴凉、干燥、密封和避光的容器中。远离火源。保护容器/钢瓶免受物理伤害。
肝素（肝素）是一种粘多糖硫酸酯，其相对分子量为6000～20 000。低分子肝素是普通肝素经过物理分离法， 化学裂解法与合成法等使标准肝素解聚而成。主要用于防治血栓形成和栓塞，治疗各种原因的弥散性血管内凝血 （DIC）以及其他体内外抗凝血，如心肌梗死及肺、脑、外周血管栓塞，体外循环等。
海关编码： WGK Germany：2 安全说明：S24/25 RTECS号：MI0850000
方法一、酶解-树脂法酶解取100kg新鲜肠黏膜(总固体5%-7%),加苯酚200ml (0.2%),如气温低时可不加。在 搅拌下加入绞碎胰0.5-1kg(0.5%-1%),用 300-400g/L(30%-40%)NaOH溶液调节pH8.5-9,升温至40-45℃,保温23h。pH8,再加5kg粗食盐(5%)升温至90℃左右,用6mol/L HCl调节pH 6.5左右,停止搅拌,保温20min,以布袋过滤, 得酶解滤液。肠黏膜[胰浆,NaOH]→[pH8.5-9, 40-45℃,保温2-3h]肠黏膜液[NaCl, 6mol/L HCl]→[pH8; 90℃, pH6.5]滤液吸附、洗涤、洗脱取上述滤液冷至50℃以下,用6mol/L NaOH调节pH7,加入5kgD-254强碱性阴 离子交换树脂,搅拌5h左右,交换完毕,弃去液体,用自来水漂洗树脂至水清,用与树脂等体积的2mol/L NaCl,搅拌 洗涤15min,弃去洗涤液,再加2倍树脂体积的1.2mol/L NaCl洗涤2次。用约树脂体积一半的5mol/L NaCl洗脱1h, 收集洗脱液,然后用约树脂体积的1/3的3mol/L NaCl洗脱2次,合并洗脱液。滤液[D-254树脂, NaOH]→[pH7, 5h] 吸附[NaCl]→[2mol/L→1.2mol/L, →5mol/L, →3mol/L]洗脱液沉淀、脱水、干燥将洗脱液用滤纸浆助滤,过 滤1次,澄清滤液以体积计加入用活性炭处理过的0.9倍的95%乙醇,冷处沉淀8-12h。虹吸上清液弃去,按100kg黏 膜加300ml的比例向沉淀中补加蒸馏水,再加入4倍量95%乙醇,冷处放置6h,收集沉淀,用无水乙醇脱水1次,丙酮脱 水2次,置P2O5干燥器中真空干燥,得肝素钠粗品。洗脱液 →沉淀物[无水乙醇;丙酮]→[P2O5]肝素钠粗品脱色、 沉淀、干燥用20g/L(2%)氯化钠溶液配成100 g/L(10%)的肝素钠溶液,以40g/L(4%)高锰酸钾溶液进行氧化脱色, 每亿单位估计加入0.65mol高锰酸钾。先将药液调至pH8,预热80℃,在搅拌下加入高锰酸钾,保温2.5h,以滑石粉 作助滤剂,过滤,收集滤液。将滤液调节pH6.4,用0.
不同种属来源肝素组成与结构分析方法研究进展
不同种属来源肝素组成与结构分析方法研究进展刘晋仙１ꎬ李玮涛１ꎬ２ꎬ柳晓芳２ꎬ王秀萍２ꎬ张中志２(１.东营市食品药品检验研究院ꎬ山东东营２５７０９１ꎻ２.东营天东制药有限公司ꎬ山东东营２５７０００)摘要:肝素是临床上广泛应用的一种抗凝药物ꎬ除抗凝活性外ꎬ肝素同时具有抗炎㊁抗病毒㊁抗肿瘤㊁抗疟疾等功能ꎮ目前«欧洲药典»㊁«美国药典»和«中国药典»明确要求肝素及低分子肝素仅限来源自猪肠黏膜ꎬ不得混有其他来源肝素ꎮ本文简要总结了近年来不同种属来源肝素组成与结构分析方法的研究进展ꎮ关键词:肝素ꎻ种属来源ꎻ鉴别ꎻ研究进展中图分类号:Ｒ９７３＋.２㊀文献标志码:Ａ㊀文章编号:２０９５－５３７５(２０２３)０９－０７１９－００５ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０２３.０９.０１４ＲｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎｔｈｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｈｅｐａｒｉｎｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｐｅｃｉｅｓＬＩＵＪｉｎｘｉａｎ１ꎬＬＩＷｅｉｔａｏ１ꎬ２ꎬＬＩＵＸｉａｏｆａｎｇ２ꎬＷＡＮＧＸｉｕｐｉｎｇ２ꎬＺＨＡＮＧＺｈｏｎｇｚｈｉ２(１.ＤｏｎｇｙｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌꎬＤｏｎｇｙｉｎｇ２５７０９１ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＤｏｎｇｙｉｎｇＴｉａｎｄｏｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ.ꎬＬｔｄ.ꎬＤｏｎｇｙｉｎｇ２５７０００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｈｅｐａｒｉｎｉｓａｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｃｌｉｎｉｃａｌａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ.Ｂｅｓｉｄｅｓｉｔｓａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙꎬｈｅｐａｒｉｎｅｘｈｉｂｉｔｓｍａｎｙｏｔｈｅｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓꎬｓｕｃｈａｓａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎꎬａｎｔｉ－ｖｉｒｕｓꎬａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒａｎｄａｎｔｉ－ｍａｌａｒｉａ.Ｃｕｒｒｅｎｔｌｙꎬｏｎｌｙｐｏｒｃｉｎｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａｈｅｐａｒｉｎ/ＬＭＷＨｉｓａｕｔｈｏｒｉｚｅｄｔｏｂｅｕｓｅｄｉｎＥＵ㊁ＵＳＡａｎｄＣｈｉｎａ.ＨｅｐａｒｉｎｆｒｏｍｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓｉｓｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄａｓＦａｋｅＤｒｕｇ.Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒꎬｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎｔｈｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｈｅｐａｒｉｎｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｐｅｃｉｅｓｉｓｂｒｉｅｆｌｙｓｕｍｍａ￣ｒｉｚｅｄ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＨｅｐａｒｉｎꎻＳｐｅｃｉｅｓｏｒｉｇｉｎꎻＩｄｅｎｔｉｆｙꎻＰｒｏｇｒｅｓｓ㊀㊀肝素(Ｈｅｐａｒｉｎ)是一种带有高密度负电荷的糖胺聚糖类化合物ꎬ产自动物结缔组织型肥大细胞ꎮ肝素蛋白聚糖是由一条独特的核心蛋白(丝甘蛋白)和与其共价连接的多条肝素多糖链组成ꎮ最终ꎬ肝素链在水解作用下断裂形成分子量不同的较小肝素多糖(相对分子质量５０００~２５０００)多分散混合物ꎬ储存在肥大细胞的胞质分泌颗粒中[１]ꎮ临床上主要用于预防和治疗深静脉血栓或肺栓塞(尤其与某些手术有关的栓塞)㊁防止血液透析等体外循环中血栓形成等ꎮ除抗凝活性外ꎬ肝素同时具有抗炎㊁抗病毒㊁抗肿瘤㊁抗疟疾等功能ꎮ肝素分子结构极其复杂ꎬ是由不同分子量的线性多糖糖链组成的多分散性混合物ꎮ其活性成分肝素是由α－Ｄ－氨基葡萄糖(Ｎ－硫酸化ꎬＯ－硫酸化或Ｎ－乙酰化)和Ｏ－硫酸化糖醛酸(α－Ｌ－艾杜糖醛酸或β－Ｄ－葡萄糖醛酸)组成的二糖重复单位以１－４糖苷键连接形成的线性多糖ꎮ迄今为止ꎬ人们仍未能对肝素的结构进行完全解析ꎬ更遑论人工合成ꎮ肝素可以从猪㊁牛㊁羊等动物的小肠黏膜和牛肺等组织中提取ꎬ但是不同来源的肝素化学结构和生物活性存在明显的差异[２]ꎬ其不良反应程度也不同ꎮ例如ꎬ相较于猪源肝素ꎬ牛源肝素引起血小板减少不良反应(ｈｅｐａｒｉｎｉｎｄｕｃｅｄｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａꎬＨＩＴ)的概率升高了１倍[３]ꎮ２０世纪９０年代源自欧洲的由朊病毒引起的牛海绵状脑病(疯牛病)以及同样由朊病毒引起的羊痒病加剧了世界各国及其药品监管机构对牛㊁羊来源肝素的担忧ꎮ目前ꎬ在肝素产品的主要市场ꎬ如欧㊁美㊁中等ꎬ其药典明确要求肝素及低分子肝素仅限来源自猪肠黏膜ꎬ不得混有其他来源肝素ꎮ中国是世界上第一大肝素供应国ꎬ占比超过５０％ꎮ近年ꎬ特别是新冠肺炎疫情发生以来ꎬ由于肝素类产品作为抗凝药物在新冠肺炎重症患者的对症治疗中起㊀作者简介:刘晋仙ꎬ女ꎬ研究方向:药品检验ꎬＥ－ｍａｉｌ:１１９４６８２８０６＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:李玮涛ꎬ男ꎬ博士ꎬ主管药师ꎬ研究方向:天然产物提取和质量研究ꎬＴｅｌ:０５４６－７７９１１１８ꎬＥ－ｍａｉｌ:１８３９１０２３２＠ｑｑ.ｃｏｍ到了一定作用ꎬ进一步使肝素价格飙升ꎬ甚至于肝素产业在一定程度上具有了资源类产业属性ꎮ猪源粗品肝素的短缺和价格飙升造成了市场上粗品肝素良莠不齐ꎬ对于不同种属来源的有效区分已经成为目前肝素产品质量控制的重要考量ꎮ因此ꎬ有必要对鉴别不同种属来源肝素检测方法的研究进展进行梳理ꎬ以便于保障广大人民群众的用药安全ꎮ１㊀肝素种属来源的鉴别方法目前ꎬ鉴别肝素不同种属来源的方法主要分为两类:一类是基于残留核酸(ＤＮＡ)㊁残留蛋白的生化检测方法ꎬ另一类是基于肝素结构的理化检测方法ꎮ其中ꎬ生化检测方法易受实验环境㊁熟练程度㊁异物污染等影响ꎮ如肝素的提取㊁纯化过程中使用的强碱㊁高温等条件会导致ＤＮＡ严重破坏ꎬ另外一些不良厂家会有意去除牛羊肝素中的ＤＮＡꎬ同时肝素对聚合酶链式反应(ＰＣＲ)有较强的抑制作用[４]ꎬ导致ＰＣＲ易出现假阴性ꎬ使针对核酸的ＰＣＲ法失去效用ꎻ蛋白质释放后很容易失活ꎬ特别是肝素的提取㊁纯化过程中使用的强碱㊁高温等条件更易导致蛋白质的破坏和变性ꎬ因此基于物种特异性蛋白的检测方法也有很大的局限性ꎮ近年来ꎬ基于肝素特征化学结构的检测方法日益增多[５]ꎬ相关检测方法从肝素结构本身入手ꎬ不易受到干扰ꎬ重现性㊁稳定性都得到了保证ꎮ此类检测方法的一个问题是使用的仪器一般较为昂贵ꎬ但随着国内科学研究仪器的日益完备ꎬ这一问题也逐步得到了解决ꎮ肝素糖链是由艾杜糖醛酸/葡萄糖醛酸与葡萄糖胺组成的二糖重复单位以１－４糖苷键连接形成的线性多糖ꎮ其中ꎬ糖醛酸Ｃ２位可发生硫酸化ꎻ葡萄糖胺的氨基位置可被乙酰化或硫酸化ꎬＣ３和Ｃ６位可发生硫酸化ꎮ不同的硫酸化程度㊁不同的取代基位置形成了肝素复杂的不均一结构[６](见图１)ꎮ对肝素进行结构解析主要有两种策略(见图２):自上而下(Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ)㊁自下而上(Ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ)ꎮＴｏｐ－ｄｏｗｎ方法中ꎬ肝素糖链不经过进一步降解ꎬ而直接进行检测分析ꎬ如核磁(ＮＭＲ)㊁红外(ＩＲ)㊁分子排阻色谱法(ＳＥＣ)㊁液质联用法(ＬＣ－ＭＳ)等方法ꎬ从而获得肝素中原始寡糖㊁单糖㊁特征结构等信息ꎮＢｏｔｔｏｍ－ｕｐ方法中ꎬ肝素糖链首先经肝素酶(Ⅰａｎｄ/ｏｒⅡａｎｄ/ｏｒⅢ)或亚硝酸降解ꎬ然后经强阴离子交换高效液相色谱法(ＳＡＸ－ＨＰＬＣ)㊁反相离子对液相色谱法(ＲＰＩＰ)㊁毛细管电泳法(ＣＥ)㊁聚丙烯酰胺凝胶电泳(ＰＡＧＥ)㊁液质联用法(ＬＣ－ＭＳ)等ꎬ对降解后的二糖㊁寡糖进行结构和含量分析ꎬ从而投射出肝素糖链的宏观结构信息ꎮＸ＝ｓｕｌｆｏ或ＨꎬＹ＝ｓｕｌｆｏꎬＡｃ或Ｈ图１㊀肝素结构示意图图２㊀自上而下㊁自下而上分析策略２㊀Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ方法Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ分析方法以完整肝素糖链为直接分析对象ꎬ因此保留了糖链完整的信息ꎬ例如糖醛酸Ｃ５位差向异构信息ꎮ与Ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ方法相比ꎬ此种分析方法可以提供的肝素钠糖链结构信息更为完整㊁丰富㊁精准ꎮＬｉｕ等[７]的工作报道了采用亲水相互作用色谱－质谱法(ＨＩＬＩＣ－ＭＳ)ꎬ在线分析对比依诺肝素钠原研及仿制药的全糖链结构信息ꎮＨＩＬＩＣ－ＭＳ方法可对糖链的Ｎ－乙酰化程度㊁还原端结构㊁非还原端结构等进行深度解析ꎮＣｈｅｎ等[８]的工作中ꎬ使用类似的方法ꎬ在线分析对比依诺肝素钠原研与羊来源肝素钠制备的依诺肝素钠之差异ꎬ发现羊来源肝素制备的依诺肝素钠含有２２７种寡糖ꎬ而在原研Ｌｏｖｅｎｏｘ中鉴定出２２５种寡糖ꎬ两者存在１３０种相同的寡糖ꎬ种类上有明显差异ꎮ且这１３０种寡糖的具体含量也有明显差异ꎬ如羊来源肝素制备的依诺肝素钠ꎬ其硫酸化程度较高的寡糖[１ꎬ２ꎬ３ꎬ０ꎬ８]ꎬ[１ꎬ４ꎬ５ꎬ０ꎬ１２]ꎬ[１ꎬ５ꎬ６ꎬ０ꎬ１６]ꎬ[１ꎬ５ꎬ６ꎬ０ꎬ１７]和[１ꎬ６ꎬ７ꎬ０ꎬ１７]含量较原研Ｌｏｖｅｎｏｘ多ꎻ其硫酸化程度较低的Ｎ－乙酰化寡糖[１ꎬ４ꎬ５ꎬ１ꎬ１０]ꎬ[１ꎬ４ꎬ５ꎬ１ꎬ１１]和[１ꎬ４ꎬ５ꎬ１ꎬ１２]含量较原研Ｌｏｖｅｎｏｘ多(寡糖组成信息通常采用[ΔＨｅｘＡ㊁ＨｅｘＡ㊁ＧｌｃＮ㊁Ａｃ㊁ＳＯ３]方式描述ꎬ其中ΔＨｅｘＡ代表寡糖链中不饱和糖醛酸㊁ＨｅｘＡ代表糖醛酸㊁ＧｌｃＮ代表葡萄糖胺㊁Ａｃ代表乙酰基㊁ＳＯ３代表磺酸基ꎬ数字代表各种结构的数量)ꎮＨＩＬＩＣ－ＭＳ方法以其良好的质谱兼容性ꎬ可对肝素类产品中含量极低的寡糖进行㊁发现和解析ꎬ近年来成为寡糖序列分析的重要手段ꎮＬｉａｎｇ等[９]的工作中ꎬ介绍了一种对首先对糖链结构中醇羟基㊁胺基进行保护ꎬ然后使用ＬＣ－ＭＳ/ＭＳ方法ꎬ分析肝素/硫酸乙酰肝素中寡糖结构的方法ꎮ糖链羟基㊁胺基上硫酸取代基团在电离过程中易发生破坏ꎬ导致结构损失ꎬ限制了质谱方法在寡糖结构解析中的使用ꎮ该工作中ꎬ用氘代乙酸酐/丙酸酐取代糖链上不稳定的硫酸基团ꎬ得到的衍生化寡糖经Ｃ１８色谱柱分离ꎬ联用ＭＳ分析ꎬ可分析至十二糖ꎬ为鉴别不同来源肝素提供了一种可能的方法ꎮＧｕｅｒｒｉｎｉ等[１０]的工作报道了通过结合１Ｈ和１３Ｃ核磁共振谱图ꎬ表征肝素生产㊁组成㊁硫酸基取代等信息ꎬ猪来源肝素与牛肺肝素在葡萄糖胺６位硫酸化取代程度(猪:８１％~８４％ꎬ牛５９.３％~６１.４％)㊁葡萄糖胺３位硫酸化取代程度(猪:５.１％~７.２％ꎬ牛１.４％~２.４％)㊁Ｎ－硫酸化(猪:７８.２％ꎬ牛:８９.６％)和Ｎ－乙酰化(猪:１５.９％ꎬ牛８.７％)组分含量等方面有明显差异ꎮＡｎｇｅ等[１１]的工作报道了使用１Ｈ㊁１３Ｃ㊁ＨＳＱＣ核磁共振谱图ꎬ对来源自猪肠黏膜㊁牛肠黏膜㊁牛肺的肝素进行了对比ꎬ结果表明与猪肠黏膜肝素相比ꎬ牛肠黏膜肝素核磁氢谱中ＧｌｃＮＳ的Ｈ１峰(５.２３ｐｐｍ)明显偏高ꎬＩｄｏＡ的Ｈ１峰(４.９４ｐｐｍ)明显偏低ꎬＧｌｃＮＹ的Ｈ６峰(３.７８ｐｐｍ)明显偏高ꎮ牛肺肝素核磁氢谱中ＧｌｃＮＡｃ的甲基氢信号峰(１.９５ｐｐｍ)明显较低ꎮＭａｕｒｉ等[１２]的工作中对于核磁氢谱的分析部分报道了类似于Ａｎｇｅ工作的结论ꎮ该研究同时表明猪肠黏膜肝素与羊肠黏膜肝素核磁氢谱更为相似ꎬ两者之间一个较为明显的区别是羊肠黏膜肝素的ＧｌｃＮＡｃ的甲基氢信号峰低于猪肠黏膜肝素ꎮ该研究还根据核磁氢谱中ＧｌｃＮＹ的Ｈ６峰(３.８７ｐｐｍ)㊁ＧｌｃＮＳ６Ｘ的Ｈ２峰(３.２８ｐｐｍ)㊁ＧｌｃＮＡｃ的甲基氢信号峰(２.０５ｐｐｍ)相互之间的比值关系给出了一种判断肝素种属来源的方法ꎮＬｕｃｉｏＭａｕｒｉ的工作中对于ＨＳＱＣ谱图的分析部分表明ꎬ来源自牛肠黏膜㊁猪肠黏膜㊁羊肠黏膜㊁牛肺的肝素在单糖组成上有较为明显的差异ꎬ例如ＧｌｃＮｙ６Ｓ(牛肠黏膜<其他来源)ꎬＧｌｃＡ(猪肠黏膜>羊肠黏膜>牛肺)ꎬＩｄｏＡ(猪肠黏膜>羊肠黏膜>牛肺)ꎮＭｏｎａｋｈｏｖａ等[１３]的一项工作中通过核磁共振扩散排序谱(ＤＯＳＹ)可对粗品肝素中不同来源的不同分子量糖胺聚糖进行分析ꎮＭｏｎａｋｈｏｖａ等[１４]的另一项工作中通过化学计量学方法对不同来源肝素核磁氢谱数据进行统计分析ꎬ进而鉴别其来源ꎮ应用主成分分析法(ＰＣＡ)ꎬ因子判别分析法(ＦＤＡ)等可鉴别猪肠黏膜肝素中２％含量的羊肠黏膜肝素掺杂ꎮ该方法同样适用于鉴别不同来源肝素制备的依诺肝素钠ꎮＯｕｙａｎｇ等[１５]的工作中使用主成分分析法(ＰＣＡ)对猪肠黏膜㊁牛肠黏膜㊁羊肠黏膜的核磁氢谱数据进行了统计分析ꎬ该方法可鉴别猪肠黏膜肝素中１０％含量的牛肠黏膜或羊肠黏膜肝素ꎮ３㊀Ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ方法Ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ分析方法是首先将完整的肝素糖链降解为二糖㊁短链寡糖ꎬ以降解后二糖㊁短链寡糖的组分含量和结构为直接研究对象ꎬ得到二糖㊁短链寡糖的指纹图谱ꎬ最后通过对降解后组分的鉴别分析㊁拼接ꎬ实现对糖链完整结构信息的分析㊁推测ꎮＷａｔｔ等[１６]的工作中对不同来源肝素降解后二糖含量百分比进行了分析ꎮ使用强阴离子交换树脂柱对降解后样品进行了分离㊁分析ꎬ结果表明ꎬ不同来源肝素具有不同的二糖组成ꎮ例如牛肝素әＩＩＩＳ含量明显高于羊肝素和猪肝素(见表１)ꎬ与Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ方法ꎬ核磁氢谱分析中ＧｌｃＮＹ的Ｈ６峰(３.７８ｐｐｍ)明显偏高结果相对应ꎮ表１㊀猪㊁羊㊁牛肝素二糖组成(％)әＩＶＡәＩＶＳәＩＩＡәＩＩＳәＩＩＩＳәＩＳ猪２.４１.４３.２１０.７５.５６３.０羊１.１０.３１.０７.５２.０６０.０牛２.１１.３０.９７.７１２.５６４.２㊀㊀Ｏｕｙａｎｇ等[１５]的工作中对猪㊁牛㊁羊肝素及不同程度掺杂牛㊁羊肝素的猪肝素样品ꎬ经肝素酶Ⅰ㊁Ⅱ和Ⅲ完全酶解后ꎬ通过反相离子对液相色谱法联用质谱(ＲＰＩＰＬＣ－ＭＳ)检测二糖ꎻ经肝素酶Ⅱ酶解后ꎬ通过ＲＰＩＰＬＣ－ＭＳ检测不被肝素酶Ⅱ降解的四糖ꎮＲＰＩＰ使用挥发性的流动相ꎬ因而与ＭＳ有较好的兼容性ꎬ可以对经色谱法分离的二糖㊁寡糖组分进行更加灵敏的检测和鉴别ꎮ应用主成分分析法(ＰＣＡ)对检测数据进行统计分析ꎬ结果表明该方法可有效区分不同来源肝素ꎬ用于猪肝素中牛㊁羊肝素掺杂的检测ꎮ例如以不被肝素酶Ⅱ降解的四糖为对象分析ꎬ可鉴别猪肝素中１０％含量的牛或羊肝素ꎮ马志华等[１７]的工作中采用ＳＡＸ－ＨＰＬＣ法对经肝素酶Ⅰ㊁Ⅱ和Ⅲ完全酶解后的猪㊁牛㊁羊粗品肝素的二糖组成进行了定量分析ꎬ并对掺杂有５％~２５％牛或羊粗品肝素的猪来源粗品肝素进行了二糖定量分析ꎮ研究结果表明该方法可检测出猪源粗品肝素中５％羊源粗品肝素掺杂ꎬ而对牛源粗品肝素掺杂不能很好地鉴别ꎮ迟连利等[１８－２０]的工作中公开了一类通过分析待测样品经肝素酶Ⅰ㊁Ⅱ和Ⅲ完全酶解后二糖㊁三糖组分ꎬ进而分析待测样品中是否掺杂有反刍类动物肝素的方法ꎮ通过分析肝素待测样品中全硫酸化三糖和әＩＡ的比值ꎬ与猪源肝素标准品相应的数据对比ꎬ可以分析待测肝素样品中是否掺杂有反刍类动物肝素ꎻ通过分析依诺肝素钠待测样品中单硫酸化三糖和还原端әＩＶＳ的比值ꎬ与猪源依诺肝素钠标准品相应的数据对比ꎬ可以分析待测依诺肝素钠样品中是否掺杂有羊源依诺肝素钠ꎮ该方法可以鉴别出猪肝素中１０％羊肝素掺杂比例和５％牛肝素掺杂比例ꎮ李玮涛等[２１]的工作中公开了一种通过分析待测样品经肝素酶Ⅰ㊁Ⅱ和Ⅲ完全酶解后二糖组分ꎬ进而分析待测样品中羊肝素掺杂比例的方法ꎮ通过分析肝素待测样品中әＩＳ和әＩＩＩＡ的比值ꎬ可回归计算出待测样品中羊肝素掺杂比例ꎮ该方法可以鉴别出猪肝素中５％羊肝素掺杂比例ꎮＣｈｅｎ等[２２]的工作中ꎬ经肝素酶Ⅰ㊁Ⅱ和Ⅲ完全酶解后的肝素样品ꎬ使用二维液相与质谱联用方法ꎬ先经强阴离子交换柱分离再经分子排阻色谱柱脱盐ꎬ脱盐后的组分可通过ＭＳ进行定性分析ꎮ通过此种方法ꎬ可以分离㊁定性酶解后样品中存在的二糖㊁肝素酶耐受四糖㊁链接区等结构ꎬ并进行定量分析ꎮＥＰ肝素钠标准品的ＩＩＳ结构较ＣｈＰ㊁ＵＳＰ高ꎻ对于链接区结构的含量各标准品又各有差异(ＣｈＰ>ＵＳＰ>ＥＰ)ꎮＺｈｕ等[２３]的工作中ꎬ肝素经肝素酶Ⅰ㊁Ⅱ和Ⅲ完全酶解后ꎬ经ＳＡＸ－ＨＰＬＣ㊁ＳＥＣ－ＭＳ方法ꎬ同样大大提高了对肝素钠糖链更为细致的分离和结构鉴定ꎬ例如对还原末端进行了较为充分的结构解析ꎮ这种组合策略结合了ＳＡＸ方法的可靠性㊁分辨率和质谱的灵敏度㊁定性分析能力ꎬ为研究肝素质量和结构提供了强有力的工具ꎬ有望在区分肝素不同种属来源和辨别猪肝素掺杂方面ꎬ发挥重要作用ꎮ４㊀结语肝素是临床上广泛应用的一种抗凝药物ꎬ受限于猪肠黏膜来源肝素供应的紧张ꎬ市场上一直存在不法商家以其它来源肝素掺杂入猪肠黏膜肝素的行为ꎬ此举一会损害正常合法的市场经济运行规律ꎬ劣币驱逐良币ꎻ二会损害我国肝素产品㊁肝素生产厂家在国际上的信誉度[２４]ꎻ三最为严重的是掺杂肝素无充分的临床应用经验ꎬ若临床上医生按照猪肠黏膜来源肝素的使用方案使用的却是掺杂肝素ꎬ可能引发严重的临床事故ꎬ严重影响人民群众的生命安全ꎮ本文简要总结了近年来不同种属来源肝素组成与结构分析方法的研究进展ꎬ期望能为肝素市场的规范性和保护人民群众的健康做出点滴贡献ꎮ参考文献:[１]㊀ＲＡＢＥＮＳＴＥＩＮＤＬ.Ｈｅｐａｒｉｎａｎｄｈｅｐａｒａｎｓｕｌｆａｔｅ:ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＮａｔＰｒｏｄＲｅｐꎬ２００２ꎬ１９(３):３１２－３３１. 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[１５]ＯＵＹＡＮＧＹＬꎬＨＡＮＸＲꎬＹＵＹＬꎬｅｔａｌ.Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃａ￣ｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｒｃｉｎｅꎬｂｏｖｉｎｅａｎｄｏｖｉｎｅｈｅｐａｒｉｎｓ[Ｊ].ＪＰｈａｒｍＢｉｏｍｅｄＡｎａｌꎬ２０１９(１６４):３４５－３５２.[１６]ＷＡＴＴＤＫꎬＹＯＲＫＥＳＣꎬＳＬＩＭＧＣ.Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｏｖｉｎｅꎬｂｏｖｉｎｅａｎｄｐｏｒｃｉｎｅｍｕｃｏｓａｌｈｅｐａｒｉｎｓａｎｄｌｏｗｍｏ￣ｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｈｅｐａｒｉｎｓｂｙｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅａｎａｌｙｓｅｓａｎｄ１３ＣＮＭＲ[Ｊ].ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＰｏｌｙｍｅｒｓꎬ１９９７(３３):５－１１. [１７]马志华ꎬ李志敏ꎬ姬胜利ꎬ等.一种鉴别粗品肝素钠不同种属来源的简便方法[Ｊ].食品与药品ꎬ２０１５ꎬ１７(５):３１８－３２３.[１８]迟连利ꎬ张彬ꎬ石峰ꎬ等.一种鉴别猪来源肝素是否掺反刍类动物肝素的方法:１１４２６４７４１Ａ[Ｐ].２０２２－０４－０１. [１９]迟连利ꎬ李蒙蒙ꎬ张彬ꎬ等.一种利用依诺肝素钠还原端鉴别猪来源依诺肝素钠是否掺有羊来源依诺肝素钠的方法:１１５７９２０４４Ａ[Ｐ].２０２３－０３－１４.[２０]ＺＨＡＮＧＢꎬＳＨＩＤＬꎬＬＩＭＭꎬｅｔａｌ.Ａｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｍｅｔｈｏｄｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｂｏｖｉｎｅａｎｄｏｖｉｎｅｈｅｐ￣ａｒｉｎｓｆｒｏｍｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｐｏｒｃｉｎｅｈｅｐａｒｉｎ[Ｊ].ＣａｒｂｏｈｙｄｒＰｏｌｙｍꎬ２０２３ꎬ３０１(ＰｔＡ):１２０３０３.[２１]李玮涛ꎬ赵丽丽ꎬ王娟娟ꎬ等.一种鉴别猪肠粘膜肝素中羊来源肝素掺杂比例的方法:１１５４３６５４２Ａ[Ｐ].２０２２－１２－０６.[２２]ＣＨＥＮＬꎬＯＵＹＡＮＧＹＬꎬＹＡＮＮꎬｅｔａｌ.Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅａ￣ｎａｌｙｓｉｓｏｆｈｅｐａｒｉｎａｓｅｄｅｒｉｖｅｄｈｅｐａｒｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｔｓｕｓｉｎｇｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ[Ｊ].ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＡꎬ２０２１(１６４３):４６２０４９. [２３]ＺＨＵＷꎬＣＨＥＮＬꎬＹＡＮＮꎬｅｔａｌ.Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｏｆｈｅｐ￣ａｒｉｎｒｅｄｕｃｉｎｇｔｅｒｍｉｎａｌｓｗｉｔｈｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃａｐ￣ｐｒｏａｃｈｅｓ[Ｊ].ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＡꎬ２０２２(１６７７):４６３３１８－４６３３２６. [２４]ＴＲＥＭＢＬＡＹＪ.Ｄｒｕｇｆｉｒｍｍａｙｈａｖｅｕｓｅｄｔａｉｎｔｅｄｈｅｐａｒｉｎ[Ｊ].ＣｈｅｍＥｎｇＮｅｗｓꎬ２０１６ꎬ９４(４８):１４－１５.(收稿日期:２０２３－０７－０５)(上接第７０２页)[５５]ＳＣＨＯＬＺＧꎬＪＡＮＤＵＳＣꎬＺＨＡＮＧＬꎬｅｔａｌ.ＭｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆｍＴＯＲＳｉｇｎａｌｌｉｎｇＴｒｉｇｇｅｒｓｔｈｅＦｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＳｔｅｍＣｅｌｌ－ｌｉｋｅＭｅｍｏｒｙＴＣｅｌｌｓ[Ｊ].ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅꎬ２０１６(４):５０－６１. [５６]ＭＡＥＨꎬＰＯＦＦＥＮＢＥＲＧＥＲＭＣꎬＷＯＮＧＡＨꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｒｏｌｅｏｆＡＭＰＫｉｎＴｃｅｌｌｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＣｕｒｒＯｐｉｎＩｍｍｕｎｏｌꎬ２０１７(４６):４５－５２.[５７]ＰＯＬＬＩＺＺＩＫＮꎬＰＡＴＥＬＣＨꎬＳＵＮＩＨꎬｅｔａｌ.ｍＴＯＲＣ１ａｎｄｍＴＯＲＣ２ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅＣＤ８＋Ｔｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ￣ｔｉｏｎ[Ｊ].ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔꎬ２０１５ꎬ１２５(５):２０９０－２１０８.[５８]ＡＢＵＥＩＤＲꎬＡＨＭＡＤＳꎬＬＩＮＹꎬｅｔａｌ.ＥｎｈａｎｃｅｄＴｈｅｒａ￣ｐｅｕｔｉｃＥｆｆｉｃａｃｙａｎｄＭｅｍｏｒｙｏｆＴｕｍｏｒ－ＳｐｅｃｉｆｉｃＣＤ８ＴＣｅｌｌｓｂｙＥｘＶｉｖｏＰＩ３Ｋ－ｄｅｌｔａＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎ[Ｊ].ＣａｎｃｅｒＲｅｓꎬ２０１７ꎬ７７(１５):４１３５－４１４５.[５９]ＨＥＲＭＡＮＳＤꎬＧＡＵＴＡＭＳꎬＧＡＲＣＩＡ－ＣＡＮＡＶＥＲＡＳＪＣꎬｅｔａｌ.ＬａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓｗｉｔｈＩＬ－２１ｔｏｐｒｏｍｏｔｅＣＤ８＋Ｔｃｅｌｌｓｔｅｍｎｅｓｓａｎｄａｎｔｉｔｕｍｏｒｉｍｍｕｎｉｔｙ[Ｊ].ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡꎬ２０２０ꎬ１１７(１１):６０４７－６０５５. [６０]ＨＥＮＮＩＮＧＡＮꎬＲＯＹＣＨＯＵＤＨＵＲＩＲꎬＲＥＳＴＩＦＯＮＰ.ＥｐｉｇｅｎｅｔｉｃｃｏｎｔｒｏｌｏｆＣＤ８＋Ｔｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ[Ｊ].ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌꎬ２０１８ꎬ１８(５):３４０－３５６.[６１]ＲＯＤＲＩＧＵＥＺＲＭꎬＳＵＡＲＥＺ－ＡＬＶＡＲＥＺＢꎬＬＡＶＩＮＪＬꎬｅｔａｌ.ＥｐｉｇｅｎｅｔｉｃＮｅｔｗｏｒｋｓＲｅｇｕｌａｔｅｔｈｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌＰｒｏｇｒａｍｉｎＭｅｍｏｒｙａｎｄＴｅｒｍｉｎａｌｌｙＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄＣＤ８＋ＴＣｅｌｌｓ[Ｊ].ＪＩｍｍｕｎｏｌꎬ２０１７ꎬ１９８(２):９３７－９４９.[６２]ＰＡＣＥＬꎬＧＯＵＤＯＴＣꎬＺＵＥＶＡＥꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｃｏｎｔｒｏｌｏｆｓｔｅｍｎｅｓｓｉｎＣＤ８＋Ｔｃｅｌｌｆａｔｅｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１８ꎬ３５９(６３７２):１７７－１８６.[６３]ＧＲＡＹＳＭꎬＡＭＥＺＱＵＩＴＡＲＡꎬＧＵＡＮＴꎬｅｔａｌ.ＰｏｌｙｃｏｍｂＲｅｐｒｅｓｓｉｖｅＣｏｍｐｌｅｘ２－ＭｅｄｉａｔｅｄＣｈｒｏｍａｔｉｎＲｅｐｒｅｓｓｉｏｎＧｕｉｄｅｓＥｆｆｅｃｔｏｒＣＤ８＋ＴＣｅｌｌＴｅｒｍｉｎａｌＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄＬｏｓｓｏｆＭｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ[Ｊ].Ｉｍｍｕｎｉｔｙꎬ２０１７ꎬ４６(４):５９６－６０８. [６４]ＡＢＤＥＬＳＡＭＥＤＨＡꎬＭＯＵＳＴＡＫＩＡꎬＦＡＮＹＰꎬｅｔａｌ.Ｈｕ￣ｍａｎｍｅｍｏｒｙＣＤ８Ｔｃｅｌｌｅｆｆｅｃｔｏｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｓｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｐｒｅｓｅｒｖｅｄｄｕｒｉｎｇｉｎｖｉｖｏｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ[Ｊ].ＪＥｘｐＭｅｄꎬ２０１７ꎬ２１４(６):１５９３－１６０６.[６５]ＡＢＤＥＬＳＡＭＥＤＨＡꎬＺＥＢＬＥＹＣＣꎬＮＧＵＹＥＮＨꎬｅｔａｌ.Ｂｅｔａｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃＣＤ８＋Ｔｃｅｌｌｓｍａｉｎｔａｉｎｓｔｅｍｃｅｌｌｍｅｍｏｒｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｇｒａｍｓｄｕｒｉｎｇｔｙｐｅ１ｄｉ￣ａｂｅｔｅｓ[Ｊ].ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌꎬ２０２０ꎬ２１(５):５７８－５８７.[６６]ＢＩＡＳＣＯＬꎬＳＣＡＬＡＳꎬＢＡＳＳＯＲＩＣＣＩＬꎬｅｔａｌ.ＩｎｖｉｖｏｔｒａｃｋｉｎｇｏｆＴｃｅｌｌｓｉｎｈｕｍａｎｓｕｎｖｅｉｌｓｄｅｃａｄｅ－ｌｏｎｇｓｕｒｖｉｖａｌａｎｄａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄＴｍｅｍｏｒｙｓｔｅｍｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄꎬ２０１５ꎬ７(２７３):２７３ｒａ１３. [６７]ＸＵＹꎬＺＨＡＮＧＭꎬＲＡＭＯＳＣＡꎬｅｔａｌ.ＣｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄＴ－ｍｅｍｏｒｙｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏｒｒｅｌａｔｅｗｉｔｈｉｎｖｉｖｏｅｘｐａｎｓｉｏｎｏｆＣＡＲ.ＣＤ１９－ＴｃｅｌｌｓａｎｄａｒｅｐｒｅｓｅｒｖｅｄｂｙＩＬ－７ａｎｄＩＬ－１５[Ｊ].Ｂｌｏｏｄꎬ２０１４ꎬ１２３(２４):３７５０－３７５９.[６８]ＳＴＥＭＢＥＲＧＥＲＣꎬＧＲＡＥＦＰꎬＯＤＥＮＤＡＨＬＭꎬｅｔａｌ.ＬｏｗｅｓｔｎｕｍｂｅｒｓｏｆｐｒｉｍａｒｙＣＤ８＋Ｔｃｅｌｌｓｃａｎｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｉｍｍｕｎｉｔｙｕｐｏｎａｄｏｐｔｉｖｅｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ[Ｊ].Ｂｌｏｏｄꎬ２０１４ꎬ１２４(４):６２８－６３７.[６９]ＡＬＶＡＲＥＺ－ＦＥＲＮＡＮＤＥＺＣꎬＥＳＣＲＩＢＡ－ＧＡＲＣＩＡＬꎬＣＡ￣ＢＡＬＬＥＲＯＡＣꎬｅｔａｌ.ＭｅｍｏｒｙｓｔｅｍＴｃｅｌｌｓｍｏｄｉｆｉｅｄｗｉｔｈａｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄＣＤ３０－ｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓｈｏｗａｎｅｎ￣ｈａｎｃｅｄａｎｔｉｔｕｍｏｒｅｆｆｅｃｔｉｎＨｏｄｇｋｉｎｌｙｍｐｈｏｍａ[Ｊ].ＣｌｉｎＴｒａｎｓｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙꎬ２０２１ꎬ１０(４):ｅ１２６８.[７０]ＳＡＢＡＴＩＮＯＭꎬＨＵＪꎬＳＯＭＭＡＲＩＶＡＭꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｌｉｎｉｃａｌ－ｇｒａｄｅＣＤ１９－ｓｐｅｃｉｆｉｃＣＡＲ－ｍｏｄｉｆｉｅｄＣＤ８＋ｍｅｍｏｒｙｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎＢ－ｃｅｌｌｍａ￣ｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ[Ｊ].Ｂｌｏｏｄꎬ２０１６ꎬ１２８(４):５１９－５２８.(收稿日期:２０２３－０３－０２)。
肝素钠生产工艺综述
一、肝素分类肝素是哺乳动物体内含的一种粘多糖，它与蛋白质联合在一同存在于肠粘膜、肺、肝等器官内，肝素与蛋白质分别提取后，拥有抗凝血、抗血栓、降血脂等多种生理活性，是防备动脉粥样硬化，心脑血管疾病的显效药物。
(1)一般 ( 标准 ) 肝素是由猪或羊黏膜提取，均匀分子量为 15000，相当稳固。
(2)往常把分子量小于 6000 的称为低分子肝素。
低分子肝素与一般肝素比较，其半衰期较长，抗血栓成效好，而抗凝出血偏向较弱，有代替一般肝素的趋向。
最近几年临床常用的有：达肝素钠( 法安明 ) 、依诺肝素钠( 克赛 ) 、低分子肝素钙 ( 速避凝、那屈肝素钙) 。
(3)当前正在深入研究的肝素制剂中还有低抗凝活性肝素、改构型肝素、类肝素等 , 这些药物特色是拥有低抗凝、高抗栓、作用时间长和出血作用少的优点，很有开发前程。
二、肝素钠简介拼音名： Gansuna 英文名： Heparin Sodium本品系自猪的肠黏膜中提取的硫酸氨基葡萄糖的钠盐，属粘多糖类物质，经过激活抗凝血酶Ⅲ(AT- Ⅲ) 而发挥抗凝作用。
它对凝血过程的三个阶段均有影响，在体内外均有抗凝作用，可延伸凝血时间、凝血酶原时间和凝血酶时间。
口服不汲取，皮下、肌肉或静脉给药均汲取优秀。
三、肝素钠检测（药典版）拼音名： Gansuna 英文名： Heparin Sodium本品系自猪或牛的肠黏膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属黏多糖类物质，拥有延伸血凝时间的作用。
按干燥品计算，每 1mg 的效价不得少于 150 单位。
【性状】本品为白色或类白色的粉末；有引湿性。
本品在水中易溶。
【比旋度】取本品，精细称定，加水溶解并稀释制成每1ml 中含 40mg 的溶液，依法测定（附录Ⅵ E），比旋度应不小于＋35°。
【鉴识】 (1)取本品与肝素标准品，分别加水制成每1ml中含的溶液，照电泳法（附录Ⅴ F第三法）试验，供试品和标准品所显斑点的迁徙距离之比应为～。
肝素的提取与鉴定设计实验报告
肝素的提取与鉴定设计实验报告一、实验目的本实验旨在了解肝素的提取方法和鉴定方法，掌握肝素的提取技术和纯化方法，并能够利用凝胶过滤层析法进行肝素的鉴定。
二、实验原理1. 肝素的提取：肝素是一种聚糖类物质，可从动物组织中提取。
常用的提取方法有碱水解法、酸水解法和酶解法。
本实验采用酶解法进行肝素的提取。
将动物组织经过清洗、切碎后加入适量的蛋白酶进行酶解，然后经过离心分离得到上清液，再经过乙醇沉淀得到粗品。
2. 肝素的纯化：通过凝胶层析法对粗品进行纯化。
将粗品溶于缓冲液中，然后加入凝胶柱中，利用凝胶柱中不同孔径大小的孔隙分离出不同分子量大小的肝素，并收集相应分子量大小范围内的肝素。
3. 肝素含量测定：利用显色反应测定肝素含量。
将样品与显色剂混合，经过显色反应后测定吸光度，根据标准曲线计算出肝素含量。
三、实验步骤1. 肝素的提取（1）清洗组织：将动物组织用生理盐水清洗干净。
（2）切碎组织：将清洗干净的组织切成小块。
（3）加入蛋白酶：将切碎后的组织加入适量的蛋白酶中进行酶解。
（4）离心分离：将酶解后的混合液进行离心分离，得到上清液。
（5）乙醇沉淀：将上清液加入等体积的乙醇中进行沉淀，得到粗品。
2. 肝素的纯化（1）制备缓冲液：配制0.1mol/L pH7.4磷缓冲液。
（2）柱层析：将粗品溶于缓冲液中，然后加入凝胶柱中进行层析。
收集不同分子量大小范围内的肝素。
3. 肝素含量测定（1）制备标准曲线：取一系列不同浓度的肝素标准品，加入显色剂后测定吸光度，绘制标准曲线。
（2）测定样品：将纯化后的肝素样品加入显色剂中，经过显色反应后测定吸光度，根据标准曲线计算出肝素含量。
四、实验结果经过酶解和乙醇沉淀得到的粗品经过凝胶层析法进行纯化，得到了不同分子量大小范围内的肝素。
利用显色反应测定肝素含量，计算出不同分子量范围内的肝素含量。
五、实验结论本实验通过酶解法提取动物组织中的肝素，并通过凝胶层析法进行纯化。
最后利用显色反应测定肝素含量。
22151191_食品及饲料中动物源性成分检测方法及标准概述
随着人们生活水平的不断提高，越来越多的肉类制品被摆上了餐桌。
为了利益最大化，有不发商贩掺假销售，更有甚者把不可食用动物的肉添加到商品中出售，严重损害消费者利益。
同时，动物源性饲料中违规掺杂禁用成分的情况也很严重。
如果动物源性饲料细菌超标或者违法添加了禁用物质，就有可能使饲养的禽畜生病，甚至导致食用者患病。
为了保障人们的食品安全，保障动物源性饲料的质量安全，对肉类食品及饲料进行动物源性鉴定是非常必要的。
1 动物源性成分检测技术研究进展有资料表明20世纪80年代，国外学者开始研究肉的种属鉴定检测，到目前为止国内外均由很多相关报道。
其中国内外动物源性成分检验方法主要有两种：核酸检测和蛋白质检测。
核酸检测方法主要包括普通PCR、实时荧光PCR、数字PCR、环介导等温扩增（LAMP）、重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA法）、试纸片法、基因芯片检测、膜芯片法、液相芯片法、显微镜法与二代测序等。
每一种检测方法都有各自的特点及优势，可以从不同方面反映材料的真实情况。
在实际检测工作中，由于食品或原材料的加工方法不同，还应根据样品的不同加工方式选择适用的检测方法进行检测。
众多的研究资料表明最为快速准确的方法是PCR方法[1]，其中探针法实时荧光PCR检测的准确性和便捷性在所有的检测方法中最为突出，对检测设备和检测人员的要求也不高，容易掌握。
目前现行有效的检测方法中以实时荧光PCR方法最多。
2 现行动物源性成分检测标准方法目前，我国已发布的现行有效的动物源性成分检测方法主要有：国家标准18项（表1），行业标准35项（表2），地方标准及其他标准20项（表3）。
其中以PCR和实时荧光PCR检测方法为主。
这些标准方法可以检测出不同种类的动物源性成分，适用范围也各不相同，检测人员可以根据需求自主选择。
目前颁布的这些标准方法基本涵盖了常见的动物源性成分，可以检测日常食品及饲料中可能会遇到的肉源性种类。
食品及饲料中动物源性成分检测方法及标准概述□ 刘彦泓 大连市检验检测认证技术服务中心摘 要：本文分析列举目前食品及饲料中动物源性成分的检测方法，探讨目前动物源性检测的研究进展。
肝素钠溶液(1%,1250Uml,无菌)
北京雷根生物技术有限公司
肝素钠溶液(1%,1250U/ml,无菌)
简介：
肝素钠(Heparin Sodium) 是从猪或牛等的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属于粘多糖硫酸酯类抗凝血药，相对分子量为15000。
肝素钠能与抗凝血酶Ⅲ结合，促进其对凝血因子Ⅻ、Ⅺ、Ⅹ、Ⅸ和凝血酶活性的抑制，抑制血小板聚集从而达到抗凝的作用。
肝素钠溶液(1%,1250U/ml,无菌)经无菌处理，适用于红细胞比容测定，但不适用凝血象和血液学一般检查，因为其可使白细胞聚集，并使血液涂片染色后产生蓝色背景。
本试剂仅适用于科研领域，不适用于临床。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 根据实验具体要求操作。
2、 一般情况下应100倍稀释后使用，即1ml 的肝素钠溶液(1%)可抗凝99～100ml 血液。
注意事项：
1、注意无菌操作，避免反复冻融。
2、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期： 12个月有效。
相关：
编号 名称 R10119 R10119 Storage 肝素钠溶液(1%,1250U/ml,无菌) 10ml 10×10ml -20℃ 使用说明书 1份 编号 名称
DC0032 Masson 三色染色液
NH0043 SSC 缓冲液(20×,pH7.0)
NH0053 变性鲑鱼精DNA(10mg/ml)
NR0001 DEPC 处理水(0.1%)
NR0042 RNase A(10mg/ml,DNase free)
PE0025 SDS-PAGE 蛋白加样缓冲液(5×)
TC0699 植物总糖和还原糖检测试剂盒(硝基水杨酸法)。
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各样本扩增ＤＮＡ扩增结果如图ｌ所示。可见，样本１、２能被猪特异引物扩增不能 被牛羊通用引物扩增，样本３、４、５既能被猪特异引物扩增又能被牛羊通用引物扩 增。说明１、２号肝素钠提取原材料样本中只含猪源成分不含牛羊源成分；３、４、５号 肝素钠提取原材料样本中掺有牛羊源成分，为不合格原料；该检测结果与己知样本 成分完全吻合。
分的分子方法。
十通讯作者
图１肝素钠原料样品检测图
图中，Ｍ为ＤＬ
ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ２０００
Ｐｌｕｓ；卜５特意引物扩增结果；Ｍ右侧为牛羊通用引物扩增结果
讨论
通过设计猪特异引物和牛羊通用引物，并引入纯化试剂盒纯化纯化获得的 ＤＮＡ消除抑制物，本实验建立了一种可行的检测肝素钠原材料中是否含有牛羊源成
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肝素钠提取原料中牛羊源成分的分子检测方法
向海１，陈晓勇１ ２，尹涛。，张有文。，于光辉。，ＯＨＤＢｒａｈｉｌ，张胜泉。，赵兴波” （１．中国农业大学动物科技学院，北京，１００１９３；
２．河北省畜牧兽医研究所，保定，０７１０００） 引言
肝素钠（Ｈｅｐａｆｉｎ Ｓｏｄｉｕｍ）是具有抗凝血和降血脂作用的粘多糖硫酸酯类药物。 肝素钠原料药主要从健康生猪小肠粘膜提取加工而成，我国生猪屠宰量占全球５０％以 上，拥有全球最丰富的肝素钠原料资源，是全球肝素粗品和肝素原料药的主要生产 国和出Ｅｌ国。但一些不法商家为降低成本，在原料中掺入与猪小肠绒毛外观近似的 牛羊源成分，使得肝素钠品质得不到保障，同时肝素钠是一种Ｔａｑ酶抑制物，严重影 响ＰＣＲ反应，因此有必要建立一种可行的分子方法检测肝素钠提取原料中的牛羊源成 分。 材料与方法 参考家猪Ｃｙｔｂ基因序列（ＧｅｎＢａｎｋ
Ｆ１：ＣＧＣＣＴＡＣＧＣＴＡＴＣＣＴＡＣＧＴＴＣＡ，ＲＩ： ＡＦ４８６８７１
１）设计猪特异引物，
ＧＧＣＡＴＴＧＡＣＴＴＡＧＴＧＧＴＣＧＡＡＡＴ：参
考牛羊Ｃｙｔｂ基因序列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ一００６８５３ １；ＮＣ ００５０４４ ２）设计牛羊通用引物， Ｆ２：ＧＴＡＣＴＡＧＣＣＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＴ，Ｒ２：ＣＣＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧＡＧＴＧＴＣＡＡＴ。从５个肝 素钠原料样本中提取ＤＮＡ，己知样本１、２仅含猪源成分，样本３、４、５含有牛羊源成 分，提取产物经ＰＣＲ产物纯化试剂盒纯化，消除原料中的抑制成分。获得的样本 ＤＮＡ经猪特异引物和牛羊通用引物ＰＣＲ扩增。