牡丹ISSR_PCR反应体系正交优化设计

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采用正交设计方法优化观赏桃ISSR-PCR反应体系

采用正交设计方法优化观赏桃ISSR-PCR反应体系肖琳;曾艳玲;刘卫东【摘要】In order to obtain the optimal ISSR-PCR reaction system of Prunus persica,and lay a foundation for studying genetic diversity of ornamental peach,concentrations of five factors (Taq DNA polymerase,Mg2 +,DNA template,dNTPs and primer) in P.persica ISSR-PCR amplification system were researched by using the method of orthogonal design,and data were analyzed by using software.The results showed that the optimal ISSR-PCR system was 0.4 U Taq DNA polymerase,1 mmol/L Mg2 +,10-80 ng DNA template,0.20 mmol/L dNPs and 0.3 μmol/L primer in 25 μL reaction system.The results of radient PCR showed the optimal annealing temperature for [SSR-PCR reaction was 49.3 ℃.The system was stable and reproducible,and could be used in the future researches on P.persica.%为了获得观赏桃ISSR-PCR最佳反应体系,并为观赏桃遗传多样性研究打下基础,采用正交设计的方法对观赏桃ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq DNA 聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物)的浓度进行研究,用SPSS软件处理分析数据.试验结果表明,观赏桃的最佳反应体系(25 μL)为Taq DNA聚合酶0.4 U,1 mmol/L Mg2+,模板DNA10～80 ng,dNTPs 0.20 mmol/L,引物浓度0.3 μmol/L,并且在梯度退火试验后发现49.3℃为最佳退火温度.这一体系反应稳定、重复性强,可以用于观赏桃基因研究.【期刊名称】《经济林研究》【年(卷),期】2017(035)004【总页数】5页(P136-140)【关键词】观赏桃;正交设计;ISSR-PCR【作者】肖琳;曾艳玲;刘卫东【作者单位】中南林业科技大学,湖南长沙410004;中南林业科技大学,湖南长沙410004;中南林业科技大学,湖南长沙410004【正文语种】中文【中图分类】S662.1ISSR分子标记技术是对品种进行鉴别和进行亲缘关系分析的有效工具，可以直接反映DNA基因组的变异水平[1]，具有操作简单、快速灵敏、重复性好的特点[2]，已被广泛用于多种植物的遗传多样性研究[3]。

定量PCR反应体系优化及实验实例

特异性的荧光探针法－Taqman探针法
利用荧光标记的特异性探针和引物来识别模版，优点是特异性更高，适用于序列专一扩增检测，不过增加了荧光探针的成本。
定量PCR实验基本流程
1. 2. 3. 4. 5. 准备模板(DNA或RNA，RNA反转录成cDNA) PCR反应(DNA/cDNA+引物探针+PCR mix) 样品编辑(样品名、样品类型) 设置参数(循环参数、反应体积、熔解曲线) 运行PCR，自动分析数据
2－4 mM
0.2-0.4uM 0.2-0.4uM 0.2uM 1－2U 补足总体积20ul
Taq酶
DDH2O
Tips：2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应：液作为cDNA(1-100 ngRNA反转录所得cDNA) 模板时的添加量不要超过 PCR反应液总体积的10%。
引物二聚体的解决（续）
4.软件操作、 4.软件操作、程序设置软件操作
用四步法可以去除引物二聚体，就是在PCR延伸之后加一个介于二聚体Tm与目片段Tm之间的温度,在这个温度采集信号即可，这样二聚体产生的荧光信号就检测不到
Cycle（40）Βιβλιοθήκη 94℃ 59℃ 72℃ 83℃
15s 20s 20s 采集信号
电泳条带
28S、18S条带应清晰锐利，并且28S条带的亮度在18S条带的两倍或者两倍以上，无DNA杂带 70℃条带和-20℃条带无明显差异。
这项指标是关键性指标
低温实验
如果内源性RNA酶的污染，两者间的条带差异是非常明显的。
引物的设计原则
1. 上下游引物要保守为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200bp 片段进行PCR扩增。上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62℃之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。确保引物中GC含量在30-80%。应避免引物中多个重复碱基的出现，尤其是要避免4个或超过4个G碱基出现。引物的3’端最好不为G或/和C。引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。跨外显子设计引物，用于区别或消除基因组DNA的扩增。

正交优化枣树ISSR-PCR反应体系的研究

ｌｖｌｅｅｄｓｎｄｂｒｏｏａｏｔｚｔｎｓｔｏｓｂｉｉｇＩＳＰＲｒａｔｎｓｓｅｉｈｎｓｕｕｅＴｅｅｅｓｗｒｅｉｅｙｏｔｇｎｌｐｉａｉｅｆｒｔｌｈｎＳＲ－ＣｅｃｉｙｔｍｎＣｉｅｅＪｊｂ．ｈｇｈｍｉｏｅａｓｏ
ＳＲ位点，且通过锚定引物的ＩＳ —Ｃ可以稳Ｓ并ＳＲＰＲ，定检测基因组ＳＲ位点差异的一种较为新型的分Ｓ
ｍｅｈｏｓｓｃｓｒｎｅ，ａｉｎｅａｄｍｕｔｌｏａｉｏｒｓｄｔｂａｎｔｅｂｓｐｉｚｄｓｓｅ．ｅｒｓｌｔｄｕｈａａｇｖｒａｃｎｌｉｅｃｍｐｒｓｎｗｅｅｕｅｏｏｔｉｈｅｔｏｔｍｉｅｙｔｍＴｈｅｕｔｐｓｓｏｄｔａｈｅｔｃｎｅｔａｉｎｆｔｓａｔｒｎｔｅ２ｘｅｃｉｎｓｓｅｗｅｅ２０ｍｍｏ／ＬＭｇｈｗｅｈｔｅｂｓｏｃｎｒｔｏｓｏｔｈｅｅｆｃｏｓｉｈ０ＩＬｒａｔｏｙｔｍｒ．ｌ ¨
，
０２ｍｍｏ／Ｌ．ｌ
ｄＰｓ００ＮＴ，．５Ｕ／ｐＬＴｑＤＮＡｏｙｒｓｎ６Ｉｍｏ／Ｌｐｍｅｓｒｓｅｔｖｌ．ｈｐｉｉｅｙｔｍｓａｐｉｄｔＬａｐｌｍｅａｅａｄ０．ｘｌｒｉｒｅｐｃｉｅｙＴｅｏｔｚｄｓｓｅｗａｐｌｅｏｍ
（山西农业大学农学院生物技术系，山西太谷０００）３８１

分子生物学实验中的PCR技术优化

分子生物学实验中的PCR技术优化PCR（聚合酶链式反应）是分子生物学实验中不可或缺的一项技术，它通过利用DNA聚合酶对DNA分子进行复制扩增，使得微小样品中的DNA能够得到快速而准确的扩增，为分子生物学实验提供了重要的手段。

但是，PCR技术的优化是十分重要的，最大限度地提高PCR反应的准确性和灵敏度，可以帮助科学家们有效地防止重复实验、掌握实验的关键环节等。

一、引言PCR技术由于其敏感性和准确性，已广泛应用于DNA分子检测、基因表达分析等各种分子生物学实验。

PCR反应的成功与否往往取决于核酸序列、反应物质的质量、浓度和反应条件（如温度、循环次数等），因此在实验前必须设法优化PCR反应条件，以实现最佳效果。

二、反应体系优化PCR反应体系主要包括DNA模板、引物、聚合酶、缓冲液、dNTP等多个组分。

因此，PCR反应体系的优化应围绕这些组分展开。

1. DNA模板PCR反应中DNA模板的质量对反应效果具有重要影响，一些常见的DNA污染物，如血液、红细胞、细菌、胺基酸等，都会对PCR反应产生干扰。

因此，在实验前应对DNA样品进行初步分离和提纯，以去除可能存在的污染物。

2. 引物设计引物是PCR反应的关键组分，它起着翻译DNA模板信息的作用。

引物设计的质量主要由两个因素决定：引物的长度和与模板特异性完整性。

通常情况下，引物的长度应保持在18至24个碱基对之间，以确保引物与目标DNA序列的匹配性及特异性；另外，引物对模板的特异性也是影响PCR反应效果的重要因素。

为了提高引物的特异性，应该避免引物序列中存在重复序列、末端含有不稳定的序列和其他的非特异性序列。

3. 聚合酶聚合酶是PCR反应中的另一个关键组分，它负责DNA模板的复制和扩增。

聚合酶的选择应根据目标DNA序列的长度及引物设计考虑，常用的PCR聚合酶包括Taq聚合酶、Pfu聚合酶等，它们的扩增特性和缺点有所不同，应根据实验需要加以考虑。

4. 缓冲液与核苷酸在优化PCR反应体系中，缓冲液和核苷酸的浓度选取也是重要的一环。

石榴ISSR-PCR反应体系的正交设计优化

科研课题资助项目（Ｓ６５。ＹＪＡＯ１）收稿日期：ＯＯ６Ｏ２１～Ｏ —１
［］ＣｃｉＭ，ｎｃＢｌｅｅｒｇｎｎｌｓｒｔｅｉｅｔｉｔｎ９ａｈＡＷｕｓｈＡｕｋｄｓｇｅａｔａａｉｆｈｎｉｃｉｙｓｏｄｆａｏ
ＥｘｒｃｉｎｏｔａｔｏｆＤＮＡｎｔｂｉｈｅｔｏｕｒｓｅｔＡＦａｄＥｓａｌｍｎｆＨｏｅｅｎ－ＬＰＴｃｎｑｅｎＬｅｖｓｏｒｃｔｓｅｈｉｕｓｉａｅｆＡｐｉｏ
ｏｌｃｌｒｍａｋｒｉｋｄｔｅｆｏａｉｉｔ ‘ ｉｔｂ／ａｗｅｔｈｆｆｍｏｅｕａｒｅｓｌｅＯｓｌｃｍｐｔｌｙｉＣｒｓｏａｉ ’ｓｅｅ — ｎ－ｂｉｎｎｃ
ｒＪ．ｃｒｃｌｒｅ２０，１（）３５４０ｙ［］ＡｔＨｏｔｕｕａ，０９８４１：９—０．ａｉｔＥｏ１］王永康，田建保，王永勤，枣树品种品系的ＡＦＰ分析ｌ］果树学等．ＬＪ．
摘
要：现利用正交设计Ｌ。４）１探讨ＤＡ模板、、ＮＰ、（ＮＭｄｄＴｓ引物、ａＮＡ聚合酶对石ＴｑＤ
榴ＩＳ－ＣＳＲＰＲ反应体系的影响，次应用加权平均法及百分制对正交实验结果进行评分，应用首并
ａｄｉｅｔｉａｉｎｆＴｎｓｎｐｉｔ（ｕｕｒｎａａｎｄｎｉｃｔｏｕｉｉａｒｏＰｒｎｓａｍｅｉｃＬ）ｕｉｇｆｏａｃｓｎＡＦ２￣Ｉ

传统中药金钱草ISSR—PCR反应体系的正交优化研究

传统中药金钱草ISSR—PCR反应体系的正交优化研究建立稳定、可靠的金钱草ISSR-PCR反应体系，为金钱草遗传多样性分析、优良品种选育、药材分子鉴定奠定基础。

该研究在7水平单因素实验的基础上，采用L16（45）正交试验设计，应用SPSS 19.0进行方差分析，对影响反应体系的5个主要因素在4个水平上进行优化。

利用优化的反应体系，筛选引物最适退火温度，以23份不同产地金钱草材料检测体系稳定性。

结果显示模板DNA，引物，dNTP，Mg2+，Taq酶5个因素对金钱草ISSR-PCR反应结果均有极显著影响，影响大小依次为引物>Taq酶>模板DNA>Mg2+>dNTP，确定最优反应体系为总体积25 μL，模板DNA 60 ng，引物0.3 μmol·L-1，dNTP 0.2 mmol·L-1，Mg2+ 1.8 mmol·L-1，Taq酶1.25 U。

经不同产地样品检测，该优化体系稳定、可靠。

该研究为其他物种ISSR-PCR体系的优化提供参考。

标签：金钱草；正交设计；ISSR-PCR；体系优化中药金钱草为报春花科植物过路黄Lysimachia christinae Hance.的干燥全草[1]。

金钱草被1977年后历版《中国药典》收载[2]，在中医临床上广泛应用，并大量用于金钱草颗粒、肾石通颗粒等中成药的生产[3]。

一直以来，金钱草药材依赖野生资源供给，随着市场用量的快速增长，零星分布的野生资源已不能满足需求，迫切需要发掘优良种质、培育栽培品种发展人工种植。

运用分子标记分析种质材料的遗传多样性和亲缘关系，有助于提高育种效率[4]。

常用的分子标记技术有RFLP，RAPD，SSR，ISSR，AFLP，SNP等。

ISSR分子标记技术由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等[5]于1994年提出，利用锚定的SSR（微卫星）DNA为引物进行PCR扩增，检测2个SSR 之间DNA序列的差异。

珙桐基因组DNA的提取及ISSR-PCR体系的优化

关键词：珙桐；ＳＩＲ—ＰＲ；交试验；化ＳＣ正优
中图分类号：７１Ｑ８
文献标识码：Ａ
文章编号：０８— ４７２１】３— ２１４１００５（０１Ｏ０１一ｏ
ＥｔａｔｏｆＧｅｏｃＤＮＡｎｔｉａｉｎｏＳＲ —ＰＣＲａｔｎＳｓｅｉｖｄａｉｖ・ｘｒｃｉｎｏｎｍｉａｄＯｐｉｚｔｆＩＳ－ｍｏＲｅｃｉｙｔｍｎＤａｉｉｏ・ｏｎ
张玉晶，李牡丹，石旭，关萍
出
（贵州大学生命科学学院，贵州贵阳５０２）５０５
摘要：采用改良的ＣＡＴＢ法提取珙桐基因组ＤＡ，Ｎ并采用正交试验设计方法优化其ＩＳＰＲ反应体系。结果ＳＲ— Ｃ
表明：良ＣＡ改ＴＢ法提取基因组ＤＡ的质量符合ＩＳＰＲ扩增反应的要求。最佳反应体系为：Ｏ反应液中ＮＳＲ— Ｃ２含有２０１ｕｅ、．５ｔｌＬＭｇ０１５ｍｏＬｄＴｓ０７￣ＶＬ引物、．５ＵＴｑ酶和４ｇ模板；．０Ｘｂｆｒ２７ｏ／２．２ｍｌＮＰ、．ｍｏｅｒｏ、／Ｏ７ａ０ｎＰＲ反应参数为：４５ｉ；４３，３２４，２ｌｉ，４Ｃ９ ℃ ｍｎ９ ℃ ０５． ℃ ５７ ℃ ｍｎ共Ｏ个循环；２Ｃ７ｉ。ＳＳ７￣ｍｎ
Ｇｉｏ５０５Ｃｉ）ｕｈｕ０２，ｈａｚ５ｎ
ＡｂｔａｔＴｅｅｔａｔｏｆｇｎｍｉｓｒｃ：ｈｘｒｃｉｎｏｅｏｃＤＮＡｔｍｐｏｅＡＢｍｅｈｄ，ａｌａｐｉｚｔｎｏＳＲ — ｗｉｈｉｒｖｄＣＴｔｏｓｗｅｌｓｏｔｍｉａｉｆＩＳｏＰＣＲｅｃｉｎｓｓｅｕｉｇｏｔｇｎｌｅｐｒｍｅｔｅｉｎｗｅｅｃｒｉｄｏｔｉｖｄａｉｖｌｃａｅＢａｌ．ｈｒ — ｒａｔｙｔｍｓｎｒｏｈｏｏａｘｅｉｎａｄｓｇｒａｒｅｕｎＤａｉｉｎｏｕｒｔｉｌ１ｅｅｉｎ．ＴｈｅｕｔｈｗｅｈｔｔｅｉｒｖｄＣｅｒｓｌｓｏｄｔａｈｍｐｏｅＴＡＢｍｅｈｄｆｒｈｇ — ｕｌｔｅｏｉｓｔｏｏｉｈｑａｉｇｎｍｃＤＮＡｘｒｃｉｎｍｉｈｅｙｅｔａｔｏｇｔｍｅｔｔｅｄｍａｄｏＳＲ — ＰｈｅｎｆＩＳＣＲｅｃｉｎＡｏａｏｕｆ２ＬＩＳ — ＰＣｓｓｅ，ｃｎａｎｎ０Ｌ１ × ｒａｔ．ｏｔｔｖｌｍｅｏ０ｌＳＲＲｙｔｍｏｔｉｉｇ２．０ｂｆｅ，２．５ｍｍｏ／ＬＭｇ，０．２ｕｆｒ７ｌ１５ｍｍｏ／ＬｄＮｌＴＰｓ，０．ｍｏ／ｐｍｅ，０．５Ｕａｏｙｒｓｎ０ｎ７ＩｌＬｒｒ￣ｉ７Ｔｑｐｌｍｅａｅａｄ４ｇｔｍｐａｅＤＮＡａｅｔｅｂｓｆｅｔａｎｇｔｅｔｓｅｏｋａｌ．ＴｅｓｉａｌＣＲｒｃｄｒｓｉｔｔｄｔｅｌｔｇｖｅｔｅｆｃｍｏｈｅｔｄｃｃｔｉｓｈｕｔｂｅＰｈｐｏｅｕｅｗａｎｉａｅｈｉ

用正交设计法优化枣树ISSR—PCR反应体系

ｓｑｅｃｅｅｔ简单重复序列区间）子标记技术ｅｕｎｅｒｐａ，分
是由加拿大蒙特利尔大学的Ｚｅｋｅｃ等于１９ｉｔｉｚｗｉ９４年
创建【，技术具有多态性水平高，重复性好，３该］可
重要的经济和生态价值。利用分子标记技术进行枣树种质资源鉴定和分类、建遗传连锁图谱和基因定位构等ｌ已取得一定进展，多为ＲＤ和ＡＬ＿２但ＡＰＦＰ标记的利用，ＳＲ标记技术研究较少。ＩＳｉｔｒｓｍｐｅＩＳＳＲ（ｅｉｌｎ
中图分类号：￥６．６５１文献标志码：Ａ文章编号：１７２Ｘ（０００ — ０００６３９３２１）２０７ — ５
ＯｐｉｚｔｎｆｒＩＳｅｃｉｎｓｓｅｏｕｕｅｔｅｙｏｔｏｏａｅｉｎｒｅｂｒｈｇｎｌｓｏｏｄｇ
ＡｂｔａｔＵｓｎｈｒｈｇｎｌｄｓｇＯｏｔｚＳＲ— ＣＲａｌｉａｉｎｓｓｅｏｕｕｅｉｏｒｌｖｌｆｆｅｓｒｃ：ｉｇｔｅｏｔｏｏａｅｉｎｔｐｉｅＩＳＰｍｐｉｃｔｙｔｍｎｊｊｂｎｆｕｅｅｓｏｉｍｉｆｏｖ
Ｔａｑ酶１０Ｕ、１０ｍｍｏ／．Ｍｇ．ｌＬ模板Ｄ．ＬｄＰ．５ｍｍｏ／ＮＡ１０、ＮＴｓ０２ｔＩ物０３ｍｏ／。一引．￣ｌＬ
关键词：枣树；子标记；Ｓ分ＩＲ～ＰＲ；应体系；交设计ＳＣ反正

牛膝ISSR—PCR反应体系的优化

ＩＳＳＲ引物采
用加拿大哥伦比亚大学提供的序列（ｎｖｒｔｏｒｉｏＵｉｓｙｆｉｓＣ．ｅｉＢｔｈ１ｍｉ，ｅＮ．，ｏ８１９０，ｕｂａＳｔｏ９Ｎ．０ — ０）由上海生工生物工程公司合
成。原初ＩＳＳＲ扩增反应体系为：０１的ＰＲ反应体积中：Ｃ
苋科（ｍｒｎａｅｅ牛膝属（ｃｙａｔｅ）Ａａａｔｃａ）ｈＡｈｒｎｈｓ植物，可人药，补有
肝肾、强筋骨、活血通经、尿通淋的功效。其干燥根入药。利生用散淤血、消痈肿；用补肝肾、熟强筋骨。其主要成分为多糖、齐墩果酸、萜皂苷及蜕皮甾酮和牛膝甾酮等。本研三
个循环降低０５℃ ）７．，２℃延伸１５ｍｎ共１．ｉ，０个循环；４℃ ９
ＤＡ，０ｐｌＮ１ｍｏ引物，．ｍｏｌｄＴ２０ｍｌＬＭｇ。利用优化反应体系从１０个ＩＳ０５ｍＩＮＰ，．ｍｏ “ ／／０ＳＲ引物中筛选出１重复２个
性好、稳定性高的引物对２４个牛膝个体的ＤＡ进行扩增，Ｎ共得到８个位点，中７５其４个为多态位点，多态位点百分率为８．６，ｅ指数为０３０３Ｓａｎｎ７０％Ｎｉ．３，ｈｎｏ信息指数为０４０５表明牛膝的遗传多样性处于较高水平。．９，关键词：牛膝；ＳＲ；化；ＩＳ优遗传多样性
１２１ＤＡ提取与定量．．Ｎ
采用改进的ＳＳ法。ＤＡ经ＤＮ
０８．％琼脂糖凝胶电泳分析，ＧＳ凝胶成像分析系统（用Ｉ上海天能科技服务公司）照定量，释成终浓度２ｇ，拍稀０ｎ／

正交设计优化大豆SSR-PCR反应体系及引物筛选

Ａｂｓｒｃ：ｅＳＲｍｐｉｅｅｕｔｆｓｙｅｎｗａｔｄｅｏｏｔｍｉｅｓｖｒａｔｒｐｌｅｎＰＣＲｅｈｉｕｔａｔＴｈＳａｌｆｄｒｓｌｓｏｏｂａｓｓｕｉｄｔｐｉｚｅｅａｆｃｏｓａｐｉｄｉｉｌｔｃｎｑｅ
摘要：大豆（￣ｉａ．为材料，究了ＰＲ反应体系的主要成分对大豆ＳＲ扩增结果的影响，确定影响以ＧｃｅｍｘＬ）ｎ研ＣＳ并ＳＲ扩增结果的各因素的最佳用量。以ＣＡＳＴＢ法提取的大豆叶片ＤＡ为模板，用Ｌ（４正交设计对影响大豆ＳＲＮ应Ｊ４）６Ｓ－
ａｄｔｅＳＲｅｃｉｎｗａｎｌｐｉｚｄ．ｅｒｓｈｓｓｏｄｔａｈｒｒｉｎｆｃｎｆｅｔｎｔｅｒｓｌｆＳＳＰＣＲｎｈＳｒａｔｓｆａｌｏｔｏｉｙｍｉｅＴｅｕｈｗｅｈｔｔｅｅａｅｓｇｉａｔｅｆｃｓｏｈｅｕｔｏＲ－ｈｉｓｕｄｒｔｅｄｆｅｅｔｌｖｌｆｅｅｙｆｃｏ，ｎｈｐｉｚｄＳＲ— ｎｅｈｉｒｎｅｅｓｏｖｒａｔｒａｄｔｅｏｔｍｉｅＳＰＣＲｅｃｉｎｓｓｅｗａ２．Ｌ１ × ＰＣＲｕｆｒ３ｇｆｒａｔｙｔｍｓ：０ｏ０Ｂｆｅ，０ｎＤＮＡｅｌｔ１０／ｍｏ／ｄｔｍｐａｅ，５￣ｌＬＮＴＰ，４ｔｍｏ／ＬＳＲｒｍｅ，５０．￣ｌＳｐｉｒ１．ＵＤＮＡｏｙｒｓ２．ｐｌｍｅａｅ，０ｍｍｏ／ＬＭｇ，ｄｉｇｌ２ａｄｎ

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基金项目上海市绿化管理局科学技术项目（Ｆ０５０３０４）。

作者简介王佳（１９８２－），女，山东青岛人，硕士研究生，研究方向：园林植物遗传育种。

＊通讯作者。

收稿日期２００６!０９!２２牡丹（Ｐａｅｏｎｉａｓｕｆｆｒｕｔｉｃｏｓａ）为芍药科芍药属亚灌木，观赏价值高，园艺化程度高，大多为高度杂交的品种。

许多牡丹品种因亲缘关系较近，仅靠花型、花色、叶型等传统的形态指标难以区分，这样既影响品种正确识别，也给品种保护和利用等带来困难，而分子标记技术可有效地用于品种鉴定，同时也可以指导育种工作，特别是在杂交育种过程中，如果对选配亲本的亲缘关系不了解，盲目杂交，不利于保持品种的遗传多样性。

目前，分子标记技术应用在牡丹种及品种间亲缘关系研究、遗传多样性分析及杂交后代鉴定等多方面，主要标记有ＲＦＬＰ［１］、ＲＡＰＤ［２－４］、ＡＦＬＰ［５］、ＩＳＳＲ等［６，７］。

ＩＳＳＲ（ＩｎｔｅｒＳｉｍｐｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅｐｅａｔ，简单序列重复区间扩增）是Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ等于１９９４年在ＳＳＲ基础上创建的，基于ＰＣＲ扩增的一种新型分子标记技术。

目前已广泛用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、生物进化及分子生态学等研究中［８］。

ＩＳＳＲ技术也是基于ＰＣＲ的一种分子标记技术，其扩增结果易受Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰｓ、引物、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、模板ＤＮＡ等因子的影响。

因此，在将该技术应用于一种植物材料的研究之前，应先建立一个合适的ＩＳＳＲ!ＰＣＲ反应体系，以期获得可靠的结果。

正交试验设计具有均衡分散、综合可比及效应明确等特性，既减小了试验规模，又不使信息损失的太多，克服了单因素试验顾此失彼、试验规模巨大的缺点［９，１０］，从而最快找到最优水平组合［１１］。

为此，笔者利用正交试验设计对上述各因子反应条件进行优化，建立适合牡丹的ＩＳＳＲ反应体系，为牡丹品种的分子鉴定和遗传关系的分析等研究奠定了重要的技术基础，也为其他物种ＩＳＳＲ反应体系的建立提供参考。

１材料与方法１．１材料以“凤丹”（Ｐａｅｏｎｉａｏｓｔｉｉ）叶片总ＤＮＡ为材料。

１．２基因组ＤＮＡ模板的提取牡丹基因组总ＤＮＡ提取采用ＣＴＡＢ微量法（４％ＣＴＡＢ；１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ!ＨＣｌ（ｐＨ８．０）；５０ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ；１．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ；２％ＰＶＰ；４％β!巯基乙醇）。

所提模板ＤＮＡ的质量采用琼脂糖凝胶电泳法检测（图１）。

①将６５０μｌ（６５℃预热）４×ＣＴＡＢ提取液加入到研磨好的叶片粉末中（成熟叶片研磨时加少量ＰＶＰ）。

混匀，６５℃水浴３０ｍｉｎ。

②吸取上清至新管，加入６５０μｌ氯仿／异戊醇（２４∶１），离心１２０００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ。

③吸取上清至新管，加入６００μｌ氯仿／异戊醇（２４∶１），离心１２０００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ。

④吸取上清至新管，加入等体积异丙醇（或２倍体积无水乙醇和１／１０体积ＮａＡｃ），混匀，－２０℃沉淀３０ｍｉｎ。

⑤离心１２０００ｒ／ｍｉｎ，５ｍｉｎ。

⑥沉淀用８００μｌ７０％乙醇洗２～３次。

⑦在空气中风干或用烘箱烘干，加５０μｌＴＥ（含ＲＮａｓｅ）。

⑧６５℃消化３０ｍｉｎ，－２０℃冷冻保存待用。

１．３优化ＩＳＳＲ!ＰＣＲ反应体系的正交设计为确定牡丹ＩＳＳＲ!ＰＣＲ反应的最适扩增条件，经初步筛选，引物ＵＢＣ８５０［（ＧＴ）８ＹＣ，其中（Ｙ＝ＣＴ）］作为此次正交试验的引物。

分别对Ｍｇ２＋浓度、ＴａｑＤＮＡ聚合酶用量、引物浓度、ｄＮＴＰｓ浓度和模板ＤＮＡ用量等５个主要影响因子各４个水平作正交试验。

选用Ｌ１６（４５）正交表，设计ＰＣＲ扩增体系各成分的因素－水平正交设计试验（表１，表２）。

反应体系为１０μｌ，除表中所列因素外，每管还有１×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ，不足体积用无菌双蒸水补足［１２］。

１．４ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的扩增反应实验所用ＩＳＳＲ引物均由上海生物工程有限公司合成，引物序列参照加拿大哥伦比亚大学（ＵＢＣ）公布的第９套ＩＳＳＲ引物序列，ｄＮＴＰｓ、ｂｕｆｆｅｒ、牡丹ＩＳＳＲ!ＰＣＲ反应体系正交优化设计王佳１，胡永红２＊，张启翔１（１．北京林业大学，北京１０００８３；２．上海植物园，上海２００２３１）摘要以“凤丹”（Ｐａｅｏｎｉａｏｓｔｉｉ）基因组ＤＮＡ为模板，采用正交试验设计方法，研究牡丹ＩＳＳＲ反应体系的影响因素，建立了适合牡丹的ＩＳＳＲ反应体系及程序。

１０μｌ反应体系为：１×反应缓冲液，２．５ｍｍｏ１／ＬＭｇ２＋，０．４ｍｍｏ１／ＬｄＮＴＰｓ，１．０ＵＴａｑ聚合酶，０．７５μｍｏｌ／Ｌ引物，１０～２０ｎｇ模板ＤＮＡ。

反应程序为：９４℃预变性３ｍｉｎ；９４℃变性４５ｓ，４５～６０℃（不同引物退火温度各异）复性４５ｓ，７２℃延伸９０ｓ，３５个循环；７２℃延伸７ｍｉｎ；４℃保存。

通过梯度退火试验，确定不同引物的退火温度。

关键词牡丹；ＩＳＳＲ!ＰＣＲ；正交设计；反应体系中图分类号Ｑ９４６－３３文献标识码Ａ文章编号０５１７－６６１１（２００６）２４－６４６５－０２ＳｔｕｄｙｏｎＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｆｏｒＩＳＳＲＲｅａｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｏｆＰｅｏｎｙｗｉｔｈＯｒｔｈｏｇｏｎａｌＤｅｓｉｇｎＷＡＮＧＪｉａｅｔａｌ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬａｎｄｓｃａｐｅＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，ＢｅｉｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８３）ＡｂｓｔｒａｃｔＷｉｔｈＰａｅｏｎｉａｏｓｔｉｉｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡａｓａｔｅｍｐｌａｔｅ，ｔｈｅｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｗａｓｕｓｅｄｔｏｏｐｔｉｍｉｚｅＩＳＳＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆＰｅｏｎｙ．ＡｓｕｉｔａｂｌｅＩＳＳＲｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ｎａｍｅｌｙ１０μｌｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ，２．５ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋，０．４ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ，１ＵＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，０．７５μｍｏｌ／Ｌｐｒｉｍｅｒ，１０￣２０ｎｇＤＮＡｔｅｍｐｌｅｔ．ＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎｓｗｅｒｅｐｒｅ!ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇａｔ９４℃ｆｏｒ３ｍｉｎ，３５ｃｙｃｌｅｓｏｆｄｅ!ｎａｔｕｒａｔｉｏｎａｔ９４℃ｆｏｒ４５ｓ，ａｎｎｅａｌｉｎｇａｔ４５￣６０℃ｆｏｒ４５ｓａｎｄｅｘｔｅｎｓｉｏｎａｔ７２℃ｆｏｒ９０ｓ，ｗｉｔｈａ７ｍｉｎｆｉｎａｌｅｘｔｅｎｓｉｏｎａｔ７２℃，ａｎｄｔｈｅｎｓａｖｅｄａｔ４℃．ＴｈｅｏｐｔｉｍａｌａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｆｏｒＩＳＳＲ!ＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎｗａｓｐｒｏｐｏｓｅｄｂｙｇｒａｄｉｅｎｔＰＣＲ．Ｅａｃｈｐｒｉｍｅｒｈａｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．ＫｅｙｗｏｒｄｓＰｅｏｎｙ；ＩＳＳＲ!ＰＣＲ；Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎ；Ｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ安徽农业科学，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｈｕｉＡｇｒｉ．Ｓｃｉ．２００６，３４（２４）：６４６５－６４６６，６４８４责任编辑曹淑华责任校对胡剑胜Ｍｇ２＋ｍｍｏ１／ＬＴａｑＤＮＡ聚合酶∥Ｕ／１０μｌｄＮＴＰｓｍｍｏ１／Ｌ引物μｍｏ１／Ｌ模板ＤＮＡ用量∥ｎｇ／１０μｌ１１．５０．５０．１０．２５１０２２．０１．００．２０．５０２０３２．５１．５０．３０．７５３０４３．０２．００．４１．０４０浓度梯度表１ＩＳＳＲ反应的主要影响因子浓度梯度注：表中共有１６个处理，每个处理２个重复，共３２管，按表中的数据加样。

编号Ｍｇ２＋ｍｍｏｌ／ＬＴａｑＤＮＡ聚合酶∥Ｕ／１０μｌｄＮＴＰｓ浓度ｍｍｏｌ／Ｌ引物浓度μｌｍｏｌ／Ｌ模板ＤＮＡ用量∥ｎｇ／１０μｌ１１．５０．５０．１０．２５１０２１．５１．００．２０．５０２０３１．５１．５０．３０．７５３０４１．５２．００．４１．０４０５２．００．５０．２０．７５４０６２．０１．００．１１．０３０７２．０１．５０．４０．２５２０８２．０２．００．３０．５０１０９２．５０．５０．３１．０２０１０２．５１．００．４０．７５１０１１２．５１．５０．１０．５０４０１２２．５２．００．２０．２５３０１３３．００．５０．４０．５０３０１４３．０１．００．３０．２５４０１５３．０１．５０．２１．０１０１６３．０２．００．１０．７５２０表２ＰＣＲ扩增体系各成分因素———水平正交设计Ｌ１６（４５）引物序列（５＇－３＇）退火温度∥℃８０７（ＡＧ）８Ｔ６０８１１（ＧＡ）８Ｃ５８８１２（ＧＡ）８Ａ５８８２５（ＡＣ）８Ｔ５５８２７（ＡＣ）８Ｇ６０８４６（ＣＡ）８ＲＴ５８８５０（ＧＴ）８ＹＣ５８８５９（ＴＧ）８ＲＣ５３８６４（ＡＴＧ）６５５８９９ＣＡＴＧＧＴＧＴＴＧＧＴＣＡＴＴＧＴＴＣＣＡ４５８８１（ＧＧＧＴＧ）３６０８９５ＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣ５３注：其中Ｒ＝ＡＧ，Ｙ＝ＣＴ。

表３引物序列及最佳退火温度ＭｇＣｌ２和ＴａｑＤＮＡ聚合酶等购自ＴａＫａＲａ公司。

（Ｍａｒｋｅｒ）ＤＬ２０００为天为时代公司生产。

ＰＣＲ扩增反应用美国ＭＪＲｅ"ｓｅａｒｃｈ公司生产的ＰＴＣ"２２５型扩增仪。

扩增程序：９４℃预变性３ｍｉｎ；９４℃变性４５ｓ，４５～６０℃（不同引物退火温度各异）复性４５ｓ，７２℃延伸９０ｓ，３５个循环；７２℃延伸７ｍｉｎ；４℃保存。

扩增反应结束后，将扩增产物在含有溴化乙锭（ＥＢ）的１．５％～２．０％琼脂糖凝胶中电泳分离，ＤＮＡ分子量标记为ＤＬ２０００，以３～５Ｖ／ｃｍ的电压电泳１．５ｈ。

电泳结束后，在紫外分析仪上观察扩增条带，并用ＵＶＰ紫外自动成像仪采集图像。

１．５退火温度梯度筛选在正交试验结果分析的基础上，从４０个引物中筛选出适合牡丹ＩＳＳＲ"ＰＣＲ反应的引物１２个，再利用ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈＰＴＣ"２２５扩增仪进行退火温度梯度试验，设置退火温度在４２．０～６１．０℃，扩增仪自动生成１２个梯度。

选取其中６个梯度：４５．１、５０．０、５３．２、５５．９、５８．０、６０．６℃。

所用ＰＣＲ扩增体系为正交设计所得的最佳体系。

２结果与分析２．１正交试验结果分析（图２）依据琼脂糖电泳条带的强弱和杂带的多少做直观分析。

Ｍｇ２＋浓度较低时，会降低ＴａｑＤＮＡ聚合酶的活性，使反应产物减少（如１，２）；浓度过高时，反应特异性降低，出现非特异性扩增（如１３，１５，１６）。

由图２可见，Ｍｇ２＋浓度２．５ｍｍｏｌ／Ｌ，条带最清晰，亮度也最高。

处理１、２的Ｍｇ２＋和ｄＮＴＰ浓度较低，浓度过低会降低ＰＣＲ产物的产量，同时，ｄＮＴＰ能与Ｍｇ２＋结合，减少反应条带。

处理５，６背景弥散，其引物浓度和模板ＤＮＡ用量均较高，引物浓度过高会引起错配和非特异性扩增，ＤＮＡ用量过高其中所含杂质亦过高，影响ＰＣＲ结果。