005 淋球菌检验

[结果]
淋球菌发酵葡萄糖，不发酵其它糖。因此，只有葡萄糖管的PH下降，颜色由紫色变黄。其它糖管颜色不变。几种奈瑟菌的糖发酵反应情况见下表。
葡萄糖麦芽糖蔗糖乳糖
淋球菌+---
脑膜炎球菌++--
干燥球菌+++-
I型黄色球菌+++-
II型黄色球菌++--
III型黄色球菌++--
黏液球菌++++
卡他球菌----
6.1.4[注意事项]
6.1.4.1涂片厚薄要均匀，革兰氏染色正确，必要时做阴性和阳性对照。
6.1.4.2陈旧的培养物，涂片颜色结果不典型，应取新鲜培养物。
6.1.4[临床意义]
典型革兰氏阴性双球菌表明可能为淋球菌，但必须进一步做试验鉴定。
6.2氧化酶试验
6.2.1[原理]
淋球菌在生长过程中产生氧化酶。往培养基上生长了24小时—48小时的菌落上加氧化酶纸片(0.5％—1％新配制的盐酸四甲基对苯二胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液)，淋球菌菌落的颜色可变成紫红乃至黑色。
（2）.用5支70mm*10mm小试管，在1—4管中分别加入20％经过滤灭菌的葡萄糖，麦芽糖，蔗糖和乳糖溶液各0.05mL。第五管不加糖（对照管）。
（3）.每管加0.1mLBBS。
（4）.每管加0.05mL悬液，充分混匀。在37摄氏度水浴箱中孵育4小时，观察结果；
我室主要是用商品试剂盒糖管：直接用接种针挑取单一菌落接种于每支糖管，于规定时间内观察结果（紫色变成黄色为阳性）。
[注意事项]
（1）.用于糖发酵试验的糖纯度要高（尤其是麦芽糖中含葡萄糖必须<0.25％）。最好用分析纯试剂。麦芽糖中若混入葡萄糖，可产生使人误解的结果。
（2）.用作试验的菌要纯。如混有杂菌，会使结果杂乱无章。
（3）.应该使节用18—23小时的淋球菌培养物。如超过23小时的培养物，可能产生假阴性结果。
7.2仪器鉴定及药敏鉴定（详情参考微生物淋球菌sop操作文件）
8
8.1
某些淋球菌菌株获得耐药质粒后产生β-内酰胺酶。该酶能分解头孢硝噻吩分子结构中的β-内酰胺环，产生由黄色向红色转变的颜色反应，即为青霉素酶试验阳性。
8.2
β-内酰胺酶测定商品试剂盒
8.3
a.将待测菌株培养过夜。
b.将头孢硝噻吩纸片置于无菌平皿中无菌生理盐水湿润并设阴性对照。
5.2.3培养条件
淋球菌对外环境变化颇为敏感，对寒冷和干燥抵抗力很弱。因此，为了保证培养有足够的成功率，取材后应立即接种，标本离体时间越短越好。取材处离实验室距离较远时，应将标本接种于Stuart或Amies运送培养基，并注意在运送过程中保温。接种的培养基应先放在37℃温箱中预温。
培养最适温度为35℃-36℃，超过38.5℃或低于30℃便生长不良。因此，孵育的温度要恒定。
革兰染色：结晶紫染色1分钟。
碘媒染液染色1分钟。
乙醇丙酮脱色1分钟左右。
石碳酸复红复染1分钟。
晾干后油镜镜检。
4.3
在急性病人的尿道脓性分泌物革兰染色涂片中，常可见到大量红色多形核白细胞。在有些细胞中吞噬有淋球菌。淋球菌为革兰阴性，呈卵圆形或圆形常成对排列，接触面扁平或稍凹。菌体长约0.7um，宽约0.5um。但两菌大小可有差异。多数多形核细胞中并不含淋菌，但不少脓细胞中常含有1至数对，甚至20对—30对淋球菌，淋球菌常存在于细胞浆内。
④如需保留菌种，在菌落未完全变黑时可挑少许转种。菌落一旦变黑，多数菌即告死亡。
6.2.5[临床意义]
氧化酶试验操作简便，是淋球菌重要的初步诊断试验之—。
标本涂片菌体形态符合淋菌特征，培养长出淋菌菌落，加上氧化酶试验阳性，即可作出初步诊断，开始治疗。如某些性状不符，则应进一步作确诊试验。
7
7.1糖发酵试验
5.4.2对症状不典型的男病人取材，最好是在晨起排尿前或排尿后二三小时后。另外，采样者应熟练掌握前列腺按摩术，必要时作前列腺按摩取材。
5.4.3对女性淋病的检查主张用淋球菌培养。国内目前使用血液琼脂加入多粘菌素作抑菌剂效果尚可。但蛋白胨最好用进口的，并用肉浸液加酵母浸膏等为好。
5.4.4国内目前使用的血液琼脂或巧克力琼脂中加人多粘菌素和万古霉素以分别抑制革兰阴性和革兰阳性杂菌。但由于部分淋球菌(某些地区可高达5％)对万古霉素也敏感，因此，最好不用万古霉素。
4.5.4不推荐用涂片检查来诊断淋菌性直肠和咽部的感染，也不推荐用来作判愈。
4.6
涂片检查方法简便、有效、价格低廉且有一定的敏感性和特异性。但其特异性随着取材部位的不同而有所不同。例如，从男性尿道取材特异性高，而从女性宫颈取材特异性低，因女性宫颈分泌物中杂菌很多，有的在形态上很像淋球菌。因此，世界卫生组织不推荐用涂片法来检查女性病人。
c.挑取待测菌直接涂布于已湿润的头孢硝噻吩纸片上。
d.盖盖后于37℃孵箱培养10分钟，观察结果。
8.4
产酶菌株分解头孢硝噻吩分子结构中的β-内酰胺环，产生由黄色向红色转变的颜色。
8.5
用于检测淋球菌是否为产β—内酰胺酶菌株。
9.淋球菌的药敏感性测定方法（手工法）
当前，由于不规则用细菌变异的结果，我国已出现了淋球菌的而药株。检测淋球菌对抗生素等药物的敏感性，可以用来检查是否产生了耐药株及比率，为修订淋病治疗方案和制订防治对策提供重要的流行病学依据。
6.2.2[操作步骤]
①在混有杂菌的淋球菌分离平皿上用氧化酶纸片沾取菌落，如纸片变成紫红色的菌落为氧化酶试验阳性。
②也可先挑取可疑菌落涂于氧化酶纸片上，涂菌处变成红色者为阳性。
6.2.3 [结果]
淋球菌氧化酶试验阳性。但氧化酶试验阳性者并不一定是淋球菌。
6.2.4[注意事项]
①为了保证有良好的反应，所用氧化酶试剂不应过分陈旧。正常的氧化酶纸片(盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺)应为白色色。如果纸片买来时已成灰色或黑色，说明已失效而不应使用。
5
5.1原理
如果标本中有淋球菌，则在合适的培养基上经培养后可长成菌落。各种细菌在培养基上生长成的菌落形态各不相同。根据菌落的大小、表面高起或扁平、光泽、色素和边缘的情况等，作为细菌鉴定的标准。
5.2操作步骤
5.2.1培养基：分离培养基：淋球菌分离使用的商品巧克力或淋球菌专用培养基。
5.2.2接种：将棉拭子涂抹于平皿一端，再用无菌接种环划线再采用分区划线法。
6
6.1革兰染色
6.1.1[原理]
淋球菌有特定形态。用接种环挑取可疑菌落在玻片上制成盐水涂片，经革兰染色，若见到具淋菌特征形态的双球菌，可作出初步诊断。
6.1.2[操作步骤]
在载玻片上加盐水一滴，取可疑菌落制成涂片，干燥固定后作革兰染色。
6.1.3[结果]
可见革兰阴性球菌。菌体为0.7um X 0.5um大小，呈肾形或卵圆形。约1／4为双球菌，多数为单球菌，个别呈四联或八叠状。与分泌物涂片所见不同，此涂片中无白细胞。
淋球菌为需氧菌，但最初从人体分离时，为促进其生长，需用5-10％二氧化碳环境培养。为保持一定的湿度，可在培养缸中放些浸水棉球。
5.3结果
淋球菌在血平皿上经24小时—48小时的培养后，可形成圆形、凸起、湿润、光滑、半透明或灰白色菌落。边缘呈花瓣状，直径为0.5mm-1.0mm，用接种环接触之有粘性。涂片革兰染色可见典型的革兰阴性双球菌。如继续培养，菌落面积增大，表面变得粗糙，边缘出现皱缩。若从菌落上取材作涂片，可见到菌的大小及染色的深度有差异，排列也不一致，约有25％的菌为典型的双球菌，其他75％为单球菌、四联形或八叠形。淋球菌在液体培养基中生长于液体表面，或稍有轻度混浊和颗粒沉淀。
测定淋球菌对药物的敏感性的方法很多。我室主要用：纸片扩散法和仪器MIC.
[原理]
将含药纸片贴到涂有淋球菌的培养基上，药物即扩散到琼脂中，如果淋球菌对此药敏感，则生长被抑制，在纸片周围形成一个透明的抑菌圈。琼脂中药物浓度与纸片距离成反比，距纸片越远药物浓度越小。因此，可根据抑菌圈的大小判定细菌对该药物的敏感程度。
3.6
4
4.1
急性淋菌性尿道炎病人常有大量黄色脓性分泌物。在有些脓细胞内可有许多淋球菌。淋球菌革兰染色呈阴性反应，具有特殊的菌体形态。因此，取病人尿道
分泌物制成涂片后作革兰染色，检查有无典型细胞内革兰阴性双球菌，可作初步
诊断的依据。
4.2
先用灭菌等渗盐水的拭子揩洗尿道口，然后用手指由后向前挤出脓液，蘸取脓液后轻轻涂布于载玻片上。待自然干燥后加热固定，染色，镜检。
5.4注意事项
5.4.1培养要获得成功，取材是关键之一。取材的深度一定要够，因为淋球菌好发于柱状上皮细胞而不是复层鳞状上皮细胞。男性尿道前端包括舟状窝都为复层鳞状上皮细胞覆盖，所以要深入到尿道内2cm-4cm处，并蘸取少量粘膜，阳性率才高。女性病人取材时，要求将棉拭插入宫颈管，转动并停留10秒—30秒也是这个道理。有些人只在阴道口取少量分泌物作分离培养，阳性率当然会降低，因为有生活力的菌从宫颈随分泌物由阴道流出需一定时间，阴道内pH值低，又因各种杂菌的作用，到阴道口时淋菌的生活力较低，再加上培养过程中各种因素的影响，培养成功的机会就会减少。
4.5.2涂片厚薄要合适，一般以白细胞单个排列为标准。涂片过厚，加之染色过程中脱色时间不足，革兰阴性菌也会呈现紫色。因此，脱色时间要视涂片厚薄而定。在大量染片时，最好用一已知的革兰阳性菌(如葡萄球菌)和阴性菌(如大肠杆菌)作对照。
4.5.3固定涂片，只要将涂片迅速通过火焰二三次，避免加热过度使细胞变形扭曲。当把加热的涂片放到手背上时应不感到太烫。
1.1.方法
（1）.用无选择性培养基（如巧克力培养基）再次分离淋球菌，挑取符合标准
的淋球菌菌落转种，置36摄氏度烛缸培养18—23小时，以得到纯菌。
（2）.刮取菌苔洗于M—H肉汤中，振荡，获取均匀的菌液。用Mc Farland比浊管比浊成0.5麦氏浓度浓度。