石蜡切片免疫组化与免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
1、组织的采集、固定和保存：
采取组织后，
方法一： 4%多聚甲醛〔 4%PFA 〕 4 C 固定 1 小时〔根据组织大小和致密程度调整固定时间〕或过夜
方法二：采用
bouin’ s 固定RT 2h〔 6-8d tesis〕 or RT过夜〔成年tesis〕
PBS 缓冲液洗三次，每次5min ， 4 C 保存于
70%乙醇中。
2、组织的包埋、切片、展片及保存：：
固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54 C 石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10 m，贴于处理过的干净载玻片上，37 C 烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT 密封保存。
石蜡包埋：
保存于 4 C 70%乙醇中的组织样品
80%乙醇
15 min
95% 乙醇 15 min
100%乙醇 15min 2
1/2 乙醇 1/2 二甲苯15 min
二甲苯透明5-10 min
1/2 二甲苯 1/2 石蜡 30 min
石蜡〔 1〕1.5hr
石蜡〔 2〕1.5-2.5hr
石蜡〔 3〕包埋
RT 保存
3、石蜡组织切片的免疫组化方法：
密封保存于RT 的组织切片
二甲苯 (1)20 min
二甲苯 (2)20 min
100%乙醇20min
95%乙醇10 min
80%乙醇10 min
通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈
切片在 PBS 中浸泡 5 min*2
0.4%Tritonx RT 10 min
切片在 PBS 中浸泡 5 min*3
3%H2O2 RT 10min
切片在 PBS 中浸泡 5 min*3
0.25%胰酶 RT 10min
切片在 PBS 中浸泡 5 min*3
Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS)RT 60min
倾去 blocking buffer，勿洗
一抗 4 C overnight in blocking buffer
取出切片复温1h，切片在PBS 中浸泡5 min*3
二抗 in blocking buffer GAR1：200〔GAM1：100〕，RT 1h
切片在 PBS 中浸泡 5 min*3
DAB 显色 5-10min〔 50 微升 A+50 微升 B+900 微升 PBS+5 微升 3%H2O2 〕
如果是增强型DAB 只要 1min 即可。
切片浸入PBS 终止显色， HE 衬染 1s，
玻片架放入泡沫盒，流水冲洗15min，肉眼看到淡淡的紫色即可停顿。
假设颜色太深，可用0.1-0.5% 盐酸乙醇分色1～ 2 秒钟〔或更久〕
脱水 85% 乙醇 5 min
95%乙醇 5 min
无水乙醇5 min
无水乙醇5min
二甲苯 (1) 10min
二甲苯 (2) 10min
中性树胶封片，室温枯燥保存
4、石蜡组织切片的免疫荧光方法：
密封保存于RT 的组织切片
二甲苯 (1)20 min
二甲苯 (2)20 min
100%乙醇20min
95%乙醇10 min
80%乙醇10 min
通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈
切片在 PBS 中浸泡5 min*2
0.4%Tritonx RT10 min
切片在 PBS 中浸泡5 min*3
切片在PBS 中浸泡
5 min*3
0.25%
胰酶RT 10min
切片在
PBS 中浸泡
5 min*3
Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS)
倾去 blocking buffer，勿洗
RT 60min
一抗 4 C overnight in blocking buffer
取出切片复温1h，切片在PBS 中浸泡5 min*3
荧光二抗in blocking buffer GAR-cy3 1： 1000， GAM-4881：
1000RT 1h
DAPI 〔 1：1000 请根据二抗说明稀释二抗〕
切片在
PBS 中浸泡
5 min*3
moil
封片，避光
4C保存
免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法 一、原理及应用 免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。 二、操作步骤： （1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。 （2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。 （3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。 （4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。 （4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。 注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。微波法最为常用。（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。 （6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。 （8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。 （10）次日取出切片，室温下复温30min。 （11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。 （12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。 （13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。（14）苏木素染细胞核：苏木素染液5-10min（根据苏木素染液使用时间的长短，来调整染色时间）→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。（15）脱水：梯度酒精（由低到高）各5min → 二甲苯I 10min→ 二甲苯 II 10min。 （16）中性树胶封片。 三、免疫组化结果分析原则及具体方法 （1）必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。 （2）抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上; CK应定位在细胞浆内; PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内; EMA应定位在细胞膜上等等。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。
免疫荧光染色步骤
免疫组织化学染色步骤 1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20→二甲苯Ⅱ10）、入水（100%酒精Ⅰ5→100%酒精Ⅱ3→95%酒精2→80%酒精1→70%酒精1），蒸馏水冲洗后，0.01M 冲洗，5×3次； 2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15，自然冷却至室温，0.01M 冲洗，5×3次； 3．32O 2溶液，37℃，20 ，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M 冲洗，5×3次； 4．正常羊血清封闭，37℃，30 ； 5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M 冲洗，5×3次； 6．滴加二抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次； 7．滴加三抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次； 8．避光显色，显微镜下控制显色时间； 9．0.01M 终止显色； 10．梯度酒精脱水（70%酒精1→80%酒精1→95%酒精Ⅰ1→ 95%酒精Ⅱ1→无水酒精Ⅰ10→无水酒精Ⅱ10），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15→二甲苯Ⅱ10； 11．中性树胶封片。 免疫荧光染色步骤 (1)将组织切片脱蜡入水； (2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15，自然冷却至室温；
(3)正常羊血清封闭，37℃，60 ； (4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，冲洗，5×3次； (5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 ，0.01M 冲洗，5×3次； (6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。 (7)荧光显微镜观察拍照。 细胞免疫组化染色（培养板中染色） 1．培养的细胞，弃去培养基，冷的洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10，洗2次，每次5－10分钟。 2．在含0.1% 100（4孔板200μl）的中进行10的透膜处理，洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。 3．羊血清用配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。 4．吸尽液体，勿洗，添加一抗，于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，洗3次，每次5-10分钟。 5．去除一抗后，细胞用洗三次。 6．加入二抗，然后加入相对应的孔，在37℃下作用30-60。洗3次，每次5-10分钟。 7．吸尽液体，加入三抗，在室温条件下作用30-60。洗3次，每次5-10分钟。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗及三抗的细胞作为阴性对照组。
石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案
石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案 石蜡标本固定、脱水、包埋方法 大鼠自心脏灌注4%多聚甲醛内固定1-2h后取材：取脑出血血肿处脑组织（厚度约3mm），置于塑料盒中并浸泡在4%多聚甲醛中固定，室温中固定时间12-48h，固定好的组织脱水前应流水冲洗30min-1h左右除去固定液，取固定好的脑组织标本脱水、包埋。具体步骤按以下方法进行：此方法参考《组织病理学技术》周庚寅北京大学出版社 2006年 ?70%： 1h-2h ?80%： 1h-2h ?90%： 1h-2h ?95%： 1h-2h ?95%： 1h-2h ?无水Ⅰ：30min-60min ?无水Ⅱ：30min-60min ?二甲苯及水水酒精 1：1混合液 30min ?二甲苯Ⅰ：30min ?二甲苯Ⅱ：30min ?石蜡Ⅰ： 1h ?石蜡Ⅱ： 1h ?石蜡Ⅲ： 1h 包埋：在病理科包埋方法基础上灵活改进：在包埋铁模具上进行，融蜡-放置组织于中央-扣包埋盒4℃冷却10min-撬蜡。 注意事项： 1、固定液的种类：10%中性甲醛，4%的多聚甲醛最合适，在37°或室温中固定12-48h能很 好保存抗原和抗体的反应能力，实验室用的更多的是在4℃冰箱中固定24h-3d。有人建议中性甲醛40摄氏度固定2~3小时，流水冲洗20min-30min，这样可以缩短制片的时间。 2、熔蜡温度65 ℃左右； 3、严格按照预定实验步骤进行，保证脱水及透明完全，透明后见云雾状说明脱水不完全， 需退回无水酒精中返工。 4、经一级二甲苯透明后检查组织是否透明，二级二甲苯透明时间以具体时间而定。 5、注意及时更换梯度酒精及二甲苯（1月）。 组织石蜡切片摘自《免疫组织化学实验技术及应用》 P12 化学工业出版社2006 1.载玻片的处理：采用现成的APES处理过的硅化载玻片。 2.石蜡切片注意事项：1、用于免疫组化的蜡温应为56~58℃，切片水温为 40℃左右，应先置于冷水中（冷水中可参入酒精有利快速展片-见相关方 法），然后再移入热水中，这样可以使切片顺利展平；2、烤片时要注意：一般在62℃烤片30-60min，抗原较强的组织可在60摄氏度烤3~8h，抗 原较弱的组织可于37℃的恒温箱内过夜；3、切片如需长期保存，可置 于4℃或室温下，千万不可脱蜡后4℃保存，因脱蜡后失去了对抗原决定 族的保护。
免疫组化和荧光步骤修改版
免疫荧光染色（全程避光） （1）切片晾干后用0.01mol/L PBS（PH值7.2－7.4）漂洗10min×3次；（2）0. 3％Trion-100溶液37℃25min；0.01mol/LPBS漂洗10min×3次； （3）滴加5％BSA37℃封闭抗原25min，甩去多余液体，不洗；（4）滴加用1％封闭血清稀释的一抗50ul/张，置4℃冰箱40－48hr。 PBS洗10min×3次； （5）滴加1％封闭血清稀释的荧光二抗羊抗兔，室温下2h；PBS洗5min×2次；晾干，60％甘油封片。 荧光双标步骤同上，仅在滴加一抗和二抗时分别将两种一抗和二抗一起加入。但两种一抗需种属来源不同。 1.用0.01 mol/L PBS漂洗3×10 min 2. 3 mL/L Triton X-100漂洗10 min。 3.正常羊血清封闭30 min。 4.一标一抗兔抗GFAP (北京中杉)孵育液,稀释度为1∶50，37℃孵育1 h,室温过夜（室温24~48 h）。 5.用0.01 mol/L PBS漂洗3×10 min， 6.加入FITC标记的山羊抗兔IgG(北京中杉)荧光二抗,稀释度为1： 50,37℃孵育1 h，0.01 mol/LPBS洗10×3 min。 7.捞片,阴干,甘油封片。
冰冻切片免疫组化染色步骤：（SP试剂盒为例) 1.冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟， PBS洗，5分钟×3。 2.用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。 3.PBS洗，5分钟×2。 4.5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去 血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 5.PBS冲洗，5分钟×3次。 6.滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃ 孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 7.PBS冲洗，5分钟×3次。 8.滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵 育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 9.PBS冲洗，5分钟×3次。 10.显色剂显色（DAB或AEC）。 11.自来水充分冲洗，复染，封片。 另外是否做冰冻或者石蜡是有你所要检测的蛋白来决定的，买一抗的时候有要求。如果能做石蜡的话，虽然复杂点，但做出来的组织结构比冰冻的清晰，更好看。
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤 1 直接免疫荧光法的操作步骤 标本的处理： 石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次; • 2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min •抗体染色： C孵育30min；︒–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1：8或1：16稀释）,放在湿盒中，37 • 0.0lmol/L PBS（pH 7。4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。 •缓冲甘油封片 –分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2,0。2M碳酸盐缓冲液1份配制。 •镜检：在荧光显微镜下观察。 •优点:方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。 •缺点：敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体.若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。 直接免疫荧光法的注意事项μ •对荧光标记的抗体的稀释:要保证抗体的蛋白有一定的浓度； •一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 •染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化； –染色时间：从10 min到数小时，一般30 min； C的低温，延长染色时间。︒C可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0—2︒C)，高于37︒–染色温度:多采用室温(25 C 30 min效果好的多。︒–低温染色过夜较37 •试验时需设置下列对照: –自发荧光对照(空白对照)：标本加0。01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。 –阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 –特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体. •若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 •一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象； •经荧光染色的标本最好在当天观察,随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。 2 间接法又称为荧光抗—抗体法 需要两种抗体参与,即一抗和二抗（荧光素标记）.一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用,但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。ϕ –可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。 间接免疫荧光法操作步骤κ •标本的处理及非特异染色的封闭同直接法； •一抗染色： C过夜.︒C作用30min或4︒–加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释,用0.01MpH7。4的PBS稀释)，37 • 0.01M PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)； C湿盒避光作用30min.︒•加荧光标记的二抗抗体，37 • 0。01M PBST避光漂洗5min×3次（例如包上锡纸，在摇床上漂洗）； •甘油缓冲液封片 •镜检
免疫组化和免疫荧光染色
免疫组化和免疫荧光染色 免疫组化和免疫荧光染色是生物医学领域常用的实验技术，用于检测和定位特定抗原或蛋白质在细胞或组织中的表达情况。本文将分别介绍免疫组化和免疫荧光染色的原理、步骤和应用。 一、免疫组化 免疫组化是通过特异性抗体与特定抗原的特异性结合来检测和定位抗原或蛋白质的表达情况。其原理是利用抗体的高度特异性与抗原结合，然后通过酶标记与抗体结合的抗原-抗体复合物，通过酶的催化作用生成可见的染色产物，从而实现对抗原或蛋白质的检测和定位。 免疫组化的步骤包括：组织固定、抗原恢复、非特异性结合抑制、一抗和二抗结合、酶标记结合、染色和显色。首先，将待检组织固定在载玻片上，然后进行抗原恢复，以使抗原处于良好的检测状态。接着，通过非特异性结合抑制，阻断非特异性背景结合。然后，加入一抗和二抗，使其与特定抗原结合。随后，加入酶标记的二抗，形成抗原-一抗-二抗-酶标记的复合物。最后，通过染色和显色步骤，观察和记录抗原或蛋白质的表达情况。 免疫组化在病理诊断、生物学研究和药物研发等领域具有广泛应用。在病理诊断中，免疫组化可以帮助鉴别肿瘤类型、评估预后和指导治疗方案。在生物学研究中，免疫组化可以对细胞和组织中的蛋白质进行定位和表达分析，从而揭示生物学过程和疾病机制。在药物
研发中，免疫组化可以用于药物靶点的筛选和药效评价，从而加速新药的开发过程。 二、免疫荧光染色 免疫荧光染色是利用特异性抗体与特定抗原结合后，通过荧光标记的二抗来检测和定位抗原或蛋白质的表达情况。其原理是将抗原-抗体复合物与荧光标记的二抗结合，形成荧光标记的抗原-一抗-二抗复合物，通过荧光显微镜观察和记录。 免疫荧光染色的步骤与免疫组化类似，也包括组织固定、抗原恢复、非特异性结合抑制、一抗和二抗结合等步骤。不同之处在于，在免疫荧光染色中，二抗是标记有荧光染料的抗体。通过荧光显微镜观察，荧光信号可以直观地显示抗原或蛋白质的定位和表达情况。 免疫荧光染色在生物医学研究中广泛应用。它可以用于检测细胞中特定蛋白质的表达、定位和分布情况，从而揭示细胞功能和疾病机制。在免疫组化无法满足需求的情况下，免疫荧光染色可以提供更高的灵敏度和空间分辨率。 免疫组化和免疫荧光染色是生物医学领域中常用的实验技术。它们通过特异性抗体与特定抗原的结合，实现对抗原或蛋白质的检测和定位。免疫组化和免疫荧光染色在病理诊断、生物学研究和药物研发等领域具有广泛应用，为科学研究和临床诊断提供了重要的工具和方法。
石蜡切片和免疫组化 步骤整理
一：步骤 石蜡切片（骨组织） 1：PFA固定，4℃冰箱过夜后，用10%的EDTA脱钙，时间3-5周，鉴定脱钙完成的标志是：用细针可以刺进骨头。脱钙完成后开始做实验前需要把骨头放到70%的酒精24h。 2：脱水：70％酒精（1h）→ 80％酒精（30min）→ 95％酒精Ⅰ（20min）→无水乙醇Ⅰ（15min）→无水乙醇Ⅱ（15min）。 3：透明：二甲苯（15min）（如果组织小（例如小鼠和大鼠的组织）就15min，如果透明时间过长组织易脆，如果组织大（例如兔子、人、狗等)时间就可以稍微长一些。 4：浸蜡：恒温56℃～58℃（不超过60℃）。→石蜡Ⅰ（1-2h）→石蜡Ⅱ（1-2h）。（如果组织大浸蜡时间可以延长，可以达6-8h。） 5：包埋：待石蜡稍微凝固以后放到4℃冰箱过夜。 6：切片与展片：切片的时候要保持包埋好的蜡块的硬度，如果蜡块软的话切片的时候组织就会碎，所以要把蜡块放在冰上。在42℃温水中展片（如果组织太脆，就先把组织浸泡在甘油中，几分钟？后在把组织放在冰块上，一段时间后再取出来重新切片。） 7：捞片：捞片时，载玻片45°倾斜，然后将片置于载玻片2/3处。 8：收片子，37℃保存。 HE染色 1：脱蜡和脱水：二甲苯，10min×3（不常换，脱蜡用），酒精5min（100%Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ； 95%；70%），蒸馏水Ⅰ，Ⅱ5min（如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长） 2：染色：苏木精-2-3min 3：蒸馏水冲洗（起反蓝的作用）：大概1h-2h 4：伊红染色-2min 4:脱水 70%→80%→95%Ⅰ→100%ⅠⅡ、Ⅲ酒精各一分钟 5：二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各3min（脱水用，最好是用一次换一次，脱水用的二甲苯要透明干净，质量才好）
石蜡切片及免疫荧光
一、石蜡切片 1.固定： 将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。凝固组织中的物质成分，尽可能保持其活体时的结构。同时能使组织硬化，有利于切片的进行。 2.脱水： 为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。 3.透明： 常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。材料块在透明剂浸渍过程称透明。 4.浸蜡：先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。 先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。
5包埋: 以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。 6.切片: 切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。通常切片厚度为3-5um，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。 7.贴片与烤片: 般使用恒温水浴锅，温度控制在37-401左右，有利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60^恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。 8.切片脱蜡及水化: 干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化。 9染色: 经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。实验操作简单。 免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。
石蜡切片免疫荧光染色方法
对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l柠檬酸钠，pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏水 中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 PBS洗涤3次。每次5分钟。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织的采集、固定和保存： 采取组织后， 方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4 C固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固 定时间）或过夜 方法二：采用bouin '固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年tesis） PBS缓冲液洗三次，每次5min , 4 C保存于70%乙醇中。 2、组织的包埋、切片、展片及保存：： 固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54 C石蜡包埋，常规切片，切片厚 4 -10 ^m，贴于处理过的干净载玻片上，37 C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。 石蜡包埋： 保存于4C 70%乙醇中的组织样品 80% 乙醇15 min 95% 乙醇15 min 100% 乙醇15mi n 2 1/2乙醇1/2二甲苯15 min - 二甲苯透明5-10 min 1/2二甲苯1/2石蜡30 min
石蜡(1) 1.5hr 石蜡（2） 1.5-2.5hr 石蜡（3）包埋 RT保存 3、石蜡组织切片的免疫组化方法： 密封保存于RT的组织切片 二甲苯(1) 20 min 二甲苯（2）20 min 100% 乙醇20min 95% 乙醇10 min 80% 乙醇10 min 通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈 切片在PBS中浸泡5 min*2 0.4%Trit onx RT 10 min I 切片在PBS中浸泡5 min*3 3%H2O2 RT 10mi n 切片在PBS中浸泡5 min*3 0.25% 胰酶RT 10min
切片在PBS中浸泡 5 mi n*3 Blocki ng buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Trito nx-100 in PBS) RT 6 0min 倾去blocking buffer ，勿洗 一抗4 C overnight in blocking buffer 取出切片复温1h,切片在PBS中浸泡5 min*3 I 二抗in blocking buffer GAR1 : 200 (GAM1 100), RT 1h 切片在PBS中浸泡 5 min*3 DAB 显色5-10min（ 50 微升A+50 微升B+900 微升PBS+5 微升3%H2O2 ） 如果是增强型DAB只要1min即可。 切片浸入PBS终止显色，HE衬染1s, 玻片架放入泡沫盒，流水冲洗15min，肉眼看到淡淡的紫色即可停止。若颜色太深，可用0.1-0.5%盐酸乙 醇分色1?2秒钟（或更久） I 脱水85%乙醇5 min 95% 乙醇5 min 无水乙醇 5 min 无水乙醇5mi n
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步盟 石蜡切片免疫组化染色步骤 1.载玻片的处理：抗原修复过程屮，由于高温.高压.辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES. ZLI-9003 HistogripTM 或ZLI- 9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES+，停留20'30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馅水屮涮去未结合的APES,置通风橱屮晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液屮，停留广2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净.干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液屮，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验屮使用的器具均为非玻璃制品。 2.常用酶消化：
2.1胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%、0. 1%,消化时间为 37°C.10、40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2. 2胃蛋白酶：一般使用浓度为0. 4%,消化时间为 37°C. 30^180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin （层粘蛋白）,Collagen IV （IV型胶原）等。 2.3皂素（Saponin）: 一般使用浓度为2^10mg/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 3.抗原热修复：可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原 修复.高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS. PBS.重金属盐溶液等，但实验证明，以0. 01M 枸橡酸盐缓冲液（pH 6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064枸椽酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸憎水中，混匀，其pH值在 6.0 ± 0.1,如因蒸憎水本身造成的pH值偏差，请自行调整。 3.1石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后， 3%H202处理10分钟，蒸馅水洗2分钟X3。将切片放入盛有枸椽酸盐缓冲液（工作液）的容器屮，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92°C'98°CZ间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤屮对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液屮取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间
石蜡切片免疫组化操作步骤
石蜡切片免疫组织化学操作流程织获取（本实验室多做脑组织，所以以脑组织为例）一、组动物体重，常用麻醉药350mg/kg1.动物麻醉：所用麻醉药物（水合氯醛水溶剂）剂量为（麻醉浓度越大，动物进入麻醉时间越短，但麻醉致死率10%、6%、7%、物浓度为5%动物麻醉后，；若注射位置正确，约3min进入麻醉状态）相应较高，本人使用7%浓度，将其固定于灌流操作平台，仰卧位；动物灌流手术：以胸骨剑突为起点，沿左右两侧肋下缘剪开老鼠皮肤至腋下，再次以剑 2.突为起点，剪开皮下肌肉层，沿同样方向剪开肌肉至腋下，避免伤到内部脏器，剪破膈膜，沿左右两侧剪断胸骨，用止血钳夹住剑突向上翻转，充分暴露心脏；用弯镊分离心脏表面黏膜；左手持止血钳轻夹起心脏，倾斜一定角度，使心尖方向与升主动脉尽量位于同一直线上，右手持灌流针，沿直线所在所在角度由左心室进针，将灌流针直接插入升主动脉（可挑动灌流针于升主动脉内观察是否正确插入，此方法操作不熟练易插错血；固管或是直接刺穿心脏——或者直接将灌流针插入左心室，但前方法灌流效率较高）定器械（器械松动或是位置变化会严重影响灌流质量，有时会因为器械位置的变动直接将心脏牵扯下来导致灌流失败，应给与充分注意）左右，灌流开始，可见右心耳充盈，用剪刀剪开，便于血液动物灌流：C57小鼠25-30g3. （时50-100ml快速冲洗血液，持续最好不要超过5min流出：吊瓶灌流——以生理盐水多聚甲醛进行灌流，约间过长会导致脑组织降解），待无明显血迹流出后换用4%，固定液较充分的固定组织；注射器灌流——100-150ml，灌流速度不宜过快，约10min缓慢推注。灌流成功的标志——灌多聚甲醛50ml50ml生理盐水快速推注，后换用4%流开始，可见肝脏颜色迅速变浅，随着灌流进行，肝脏颜色逐渐变为乳黄色或是白色；4%多甲固定液后小鼠全身痉挛抽搐，组织僵硬。换用开颅取脑：根据实验取材位置的不同，分为不同的取脑方式：应注意需要的组织区域，4. 避免取脑过程中损坏，多从小脑后方依次向前剥离颅骨，获取脑组织（在颅骨剥开后，应注意脑膜的存在，因为会发生脑膜将皮层割裂损伤的情况） 5.脑组织修块：将多余脑组织去除，便于固定充分均匀，应留出试刀或找平的部分多余组织（本人实验中因需要海马组织，故修块时沿大脑皮层后边缘切除多余小脑，人字缝前约2.5-3mm切除前脑部分） 6.固定过夜：将修块完成的脑组织，浸泡于4%多聚甲醛中，固定过夜，通常不要超过18小时（固定时间越长，组织抗原损失越严重，呈数量级损失），一般控制在12小时以内为宜 二、组织石蜡包埋 7.组织梯度脱水透明：将过夜固定的脑组织取出置于包埋窗内，并用铅笔做好相应标记，自来水流水冲洗约10min，去除残留的杂质成分，进行梯度酒精脱水（注意：不同的组织类型，同组织类型不同组织块大小所需的每阶段脱水时间不同，需根据自身需要进行简单摸索；若盲目脱水透明，脱水透明过头，会使组织脆性增加，切片时全为粉末状，无法成形；脱水透明不够，会使组织与蜡块分离，无法获取平整组织切片） 本实验中，组织样本为脑组织，组织修块后所进行的脱水流程如下： 自来水冲洗完成→50%乙醇 25min→70%乙醇 25min→80%乙醇 25min→90%乙醇 25min→95%乙醇I 10min→95%乙醇II 15min→无水乙醇I 10min→无水乙醇II 15min→二甲苯I 15min→二甲苯II 15min 8.组织浸蜡：在进行二甲苯透明开始的时候，将石蜡用沸水融化，置于60度烘箱内备用（此过程中应注意将盛放石蜡的烧杯上口封闭，避免水分溅入；根据组织块的数目准备1 / 4 ；将透明完成的组织块，尽量沥干合适体积的石蜡液体，以组织块完全浸没其中为宜）号烧杯的石蜡液体内（避免包埋窗内产生气泡，气泡若围绕组多余二甲苯，迅速转入1，依次将所有组织
石蜡切片免疫组化步骤.
石蜡切片免疫组化步骤 1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。 2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(10min)→95%乙醇(10min)→90乙醇(10min)→80%(10min) 4.抗原修复：柠檬酸钠缓冲液95度，10分钟. (枸橼酸三钠3g 枸橼酸0.4g然后加水到950毫升左右，然后用NaOH或HCI调pH值6.0，最后定容在1000ml) 5. PBS浸洗2次各5min 6.加3%H2O2孵育5min(室温或37度，避光)。肝组织过氧化物酶含量高。需增加浓度或增长时间。蒸馏水洗2minx3次 8.pbs-曲拉通通透（pv法不需要） 9.与二抗种属一致的血清封闭非特异位点。（pv法不需要） 9.滴加一抗4℃过夜 10.PBS浸洗3次各5min 11.滴加二抗室温或37℃孵育30min 12.PBS洗3次各5min 15.DAB显色5~20min，自来水充分涮洗 16.苏木素复染2~3min，自来水充分涮洗 17.氨水反蓝，过蓝可用盐酸酒精分化2s，自来水充分涮洗.用稀氨水返蓝，自来水里加几滴稀氨水，就行了，返蓝时间5分钟左右，就很好看了;淡氨水有人用50ml自来水＋三四滴的氢氧化铵； 18.脱水、透明80%(5min)→90%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→ 100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min) 19.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干 二、操作流程 1、脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2h以上，然后按以下流程进行： 二甲苯Ⅰ（1h）、二甲苯Ⅱ（30min）、100%酒精（30min）、95%酒精（15min）、70%酒精（15min）、50%酒精（15min）、蒸馏水（15min） 2、3%H2O2，室温封闭5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。 3、甩去H2O2，蒸馏水洗2min×3次。 4、抗原热修复：将切片置于装有抗原修复液的玻璃容器中（耐高温），进入微波炉内，容器内液体温度达到95～100℃后断电，连续三次。 5、PBS冲洗5min×3次。 6、5%BSA封闭液20min，甩去。 7、用0.1mol/L PBS稀释一抗100倍，滴加后4℃过夜。 8、PBS冲洗2min×3次，滴加二抗37℃20min，PBS冲洗2min×3次，滴加SABC 37℃20min，PBS冲洗5min×4次，显色剂显色。 9、自来水冲洗，封片，观察。 注意：如果需要做双标记法，则在操作完步骤8后，重复步骤3～8即可