免疫荧光单标染色技术石蜡切片脱蜡至水的步骤
免疫荧光单标染色技术是一种用于检测特定抗原或蛋白质的方法，能
够在细胞或组织中定位这些分子。这种技术常常用于生物医学研究、
临床诊断和药物开发中。在进行免疫荧光染色之前，需要进行石蜡切
片脱蜡至水的步骤，以确保样品的质量和稳定性。
第一步：脱蜡
1.1 在进行免疫荧光染色前，首先需要将样品中的蜡质去除。通常使用挥发性有机溶剂（如二甲基苯）来溶解蜡质，以达到脱蜡的目的。
1.2 脱蜡过程需要严格控制时间和温度，以避免对样品中的细胞结构和蛋白质的影响。
1.3 脱蜡后，样品需要经过多次洗涤，以保证蜡质完全被去除。
第二步：水洗
2.1 脱蜡后的样品需要经过一系列的水洗步骤，以移除残留的有机溶剂，并保证细胞或组织的完整性。
2.2 水洗过程需要使用高纯度的蒸馏水，并频繁更换，以避免污染和离子残留。
2.3 水洗后，样品需要进行去离子处理，以避免水中离子对免疫荧光染色的干扰。
免疫荧光单标染色技术通过上述步骤，可以在细胞或组织中准确地检
测和定位特定抗原或蛋白质。在这个过程中，严格控制的脱蜡和水洗
步骤对于提高染色的敏感性和稳定性非常重要。
个人观点和理解：
免疫荧光单标染色技术是一种非常重要的生物医学研究工具，它可以帮助科研人员和临床医生更好地理解细胞和组织中的蛋白质定位和表达水平。而其中的石蜡切片脱蜡至水的步骤，是确保染色质量的关键一环。只有通过严格的处理和洗涤，才能保证样品的稳定性和免疫荧光染色的准确性。
总结回顾：
通过本文的阐述，我们深入探讨了免疫荧光单标染色技术中石蜡切片脱蜡至水的关键步骤。这些步骤不仅仅是简单的预处理，更是整个染色过程中样品质量的保证。在未来的研究和实践中，我们应该更加重视这些细节步骤的执行，以确保最终的实验结果的准确性和可靠性。
在中文文章的写作中，要求对于指定的主题或概念进行全面评估，包括深度和广度，并根据主题文字撰写一篇高质量的文章，其中包含了详细的步骤和个人观点以及总结回顾性的内容。文章的格式需要符合知识文章的要求，使用普通文本撰写，使用序号标注，总字数大于3000字。在免疫荧光单标染色技术中，正确的脱蜡和水洗步骤是非常重要的，因为这些步骤直接影响着后续的免疫荧光染色结果。脱蜡的过程需要严格控制温度和时间，以避免对样品中的细胞结构和蛋白质
的影响。脱蜡后的样品需要经过多次洗涤，以确保蜡质完全被去除。
这些严格的步骤保证了样品的稳定性和免疫荧光染色的准确性。
水洗过程同样非常重要。残留的有机溶剂会对样品的完整性造成影响，因此需要进行一系列的水洗步骤，以移除这些残留物质，并保证细胞
或组织的完整性。在水洗过程中，需要使用高纯度的蒸馏水，并频繁
更换，以避免污染和离子残留。水洗后需要进行去离子处理，以避免
水中离子对免疫荧光染色的干扰。
在进行免疫荧光染色时，这些严格的脱蜡和水洗步骤可以提高染色的
敏感性和稳定性。通过这些步骤的正确执行，可以确保最终的实验结
果准确无误，为生物医学研究和临床诊断提供可靠的数据支持。
免疫荧光单标染色技术是一种非常重要的生物医学研究工具，可以帮
助科研人员和临床医生更好地理解细胞和组织中的蛋白质定位和表达
水平。而在这个过程中，石蜡切片脱蜡至水的步骤是确保染色质量的
关键一环。只有通过严格的处理和洗涤，才能保证样品的稳定性和免
疫荧光染色的准确性。
在未来的研究和实践中，我们应该更加重视这些细节步骤的执行，以
确保最终的实验结果的准确性和可靠性。我们也应该不断探索新的技
术和方法，以提高免疫荧光染色的效率和精确度，为生物医学研究和
临床诊断提供更多更准确的数据支持。严格控制脱蜡和水洗步骤对于免疫荧光单标染色技术的发展和应用至关重要。
免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法 一、原理及应用 免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。 二、操作步骤： （1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。 （2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。 （3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。 （4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。 （4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。 注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。微波法最为常用。（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。 （6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。 （8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。 （10）次日取出切片，室温下复温30min。 （11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。 （12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。 （13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。（14）苏木素染细胞核：苏木素染液5-10min（根据苏木素染液使用时间的长短，来调整染色时间）→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。（15）脱水：梯度酒精（由低到高）各5min → 二甲苯I 10min→ 二甲苯 II 10min。 （16）中性树胶封片。 三、免疫组化结果分析原则及具体方法 （1）必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。 （2）抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上; CK应定位在细胞浆内; PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内; EMA应定位在细胞膜上等等。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。
石蜡切片免疫荧光实验步骤
石蜡切片免疫荧光实验步骤 1、脱蜡至水：将组织切片室温放置10min后，依次将石蜡切片放 入二甲苯3min→无水乙醇5min—85%酒精5min—75%酒精5min—ddH2O洗5min。 2、抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复液（50X稀释至 1X使用)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（中火8min—停火8min—中低火7min）。此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min（具体修复液和修复条件根据组织来确定）。 3、画阻水圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，防止液体 流失。 4、BSA封闭：在圈内滴加3%-5%浓度BSA孵育30min（或二抗 同源血清封闭）。 5、一抗孵育：轻轻甩干封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的 一抗（溶于血清：PBS=1:19的抗体稀释液体系中），切片平放于湿盒（内加少量水防止抗体蒸发），4°C过夜。 6、二抗孵育：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每 次5min。切片稍甩干后在圈内滴加相应的荧光二抗，覆盖组织，避光RT孵育50min。 7、DAPI染核：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每 次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光RT孵育3-5min。 8、树脂封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每 次5min。切片稍甩干后用树脂封片剂封片（其间可滴加少量抗荧光淬灭剂）。 9、镜检拍照：切片于荧光显微镜/confocal/活细胞工作站中观察并 采集图像（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光； CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发橙光；CY5发红光）。 10、结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳 性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光，图片处理需使用Image J 软件。
石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案
石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案 石蜡标本固定、脱水、包埋方法 大鼠自心脏灌注4%多聚甲醛内固定1-2h后取材：取脑出血血肿处脑组织（厚度约3mm），置于塑料盒中并浸泡在4%多聚甲醛中固定，室温中固定时间12-48h，固定好的组织脱水前应流水冲洗30min-1h左右除去固定液，取固定好的脑组织标本脱水、包埋。具体步骤按以下方法进行：此方法参考《组织病理学技术》周庚寅北京大学出版社 2006年 ?70%： 1h-2h ?80%： 1h-2h ?90%： 1h-2h ?95%： 1h-2h ?95%： 1h-2h ?无水Ⅰ：30min-60min ?无水Ⅱ：30min-60min ?二甲苯及水水酒精 1：1混合液 30min ?二甲苯Ⅰ：30min ?二甲苯Ⅱ：30min ?石蜡Ⅰ： 1h ?石蜡Ⅱ： 1h ?石蜡Ⅲ： 1h 包埋：在病理科包埋方法基础上灵活改进：在包埋铁模具上进行，融蜡-放置组织于中央-扣包埋盒4℃冷却10min-撬蜡。 注意事项： 1、固定液的种类：10%中性甲醛，4%的多聚甲醛最合适，在37°或室温中固定12-48h能很 好保存抗原和抗体的反应能力，实验室用的更多的是在4℃冰箱中固定24h-3d。有人建议中性甲醛40摄氏度固定2~3小时，流水冲洗20min-30min，这样可以缩短制片的时间。 2、熔蜡温度65 ℃左右； 3、严格按照预定实验步骤进行，保证脱水及透明完全，透明后见云雾状说明脱水不完全， 需退回无水酒精中返工。 4、经一级二甲苯透明后检查组织是否透明，二级二甲苯透明时间以具体时间而定。 5、注意及时更换梯度酒精及二甲苯（1月）。 组织石蜡切片摘自《免疫组织化学实验技术及应用》 P12 化学工业出版社2006 1.载玻片的处理：采用现成的APES处理过的硅化载玻片。 2.石蜡切片注意事项：1、用于免疫组化的蜡温应为56~58℃，切片水温为 40℃左右，应先置于冷水中（冷水中可参入酒精有利快速展片-见相关方 法），然后再移入热水中，这样可以使切片顺利展平；2、烤片时要注意：一般在62℃烤片30-60min，抗原较强的组织可在60摄氏度烤3~8h，抗 原较弱的组织可于37℃的恒温箱内过夜；3、切片如需长期保存，可置 于4℃或室温下，千万不可脱蜡后4℃保存，因脱蜡后失去了对抗原决定 族的保护。
免疫荧光单标染色技术石蜡切片脱蜡至水的步骤
免疫荧光单标染色技术是一种用于检测特定抗原或蛋白质的方法，能 够在细胞或组织中定位这些分子。这种技术常常用于生物医学研究、 临床诊断和药物开发中。在进行免疫荧光染色之前，需要进行石蜡切 片脱蜡至水的步骤，以确保样品的质量和稳定性。 第一步：脱蜡 1.1 在进行免疫荧光染色前，首先需要将样品中的蜡质去除。通常使用挥发性有机溶剂（如二甲基苯）来溶解蜡质，以达到脱蜡的目的。 1.2 脱蜡过程需要严格控制时间和温度，以避免对样品中的细胞结构和蛋白质的影响。 1.3 脱蜡后，样品需要经过多次洗涤，以保证蜡质完全被去除。 第二步：水洗 2.1 脱蜡后的样品需要经过一系列的水洗步骤，以移除残留的有机溶剂，并保证细胞或组织的完整性。 2.2 水洗过程需要使用高纯度的蒸馏水，并频繁更换，以避免污染和离子残留。 2.3 水洗后，样品需要进行去离子处理，以避免水中离子对免疫荧光染色的干扰。 免疫荧光单标染色技术通过上述步骤，可以在细胞或组织中准确地检 测和定位特定抗原或蛋白质。在这个过程中，严格控制的脱蜡和水洗 步骤对于提高染色的敏感性和稳定性非常重要。
个人观点和理解： 免疫荧光单标染色技术是一种非常重要的生物医学研究工具，它可以帮助科研人员和临床医生更好地理解细胞和组织中的蛋白质定位和表达水平。而其中的石蜡切片脱蜡至水的步骤，是确保染色质量的关键一环。只有通过严格的处理和洗涤，才能保证样品的稳定性和免疫荧光染色的准确性。 总结回顾： 通过本文的阐述，我们深入探讨了免疫荧光单标染色技术中石蜡切片脱蜡至水的关键步骤。这些步骤不仅仅是简单的预处理，更是整个染色过程中样品质量的保证。在未来的研究和实践中，我们应该更加重视这些细节步骤的执行，以确保最终的实验结果的准确性和可靠性。 在中文文章的写作中，要求对于指定的主题或概念进行全面评估，包括深度和广度，并根据主题文字撰写一篇高质量的文章，其中包含了详细的步骤和个人观点以及总结回顾性的内容。文章的格式需要符合知识文章的要求，使用普通文本撰写，使用序号标注，总字数大于3000字。在免疫荧光单标染色技术中，正确的脱蜡和水洗步骤是非常重要的，因为这些步骤直接影响着后续的免疫荧光染色结果。脱蜡的过程需要严格控制温度和时间，以避免对样品中的细胞结构和蛋白质
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤 1 直接免疫荧光法的操作步骤 标本的处理： 石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次; • 2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min •抗体染色： C孵育30min；︒–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1：8或1：16稀释）,放在湿盒中，37 • 0.0lmol/L PBS（pH 7。4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。 •缓冲甘油封片 –分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2,0。2M碳酸盐缓冲液1份配制。 •镜检：在荧光显微镜下观察。 •优点:方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。 •缺点：敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体.若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。 直接免疫荧光法的注意事项μ •对荧光标记的抗体的稀释:要保证抗体的蛋白有一定的浓度； •一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 •染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化； –染色时间：从10 min到数小时，一般30 min； C的低温，延长染色时间。︒C可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0—2︒C)，高于37︒–染色温度:多采用室温(25 C 30 min效果好的多。︒–低温染色过夜较37 •试验时需设置下列对照: –自发荧光对照(空白对照)：标本加0。01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。 –阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 –特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体. •若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 •一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象； •经荧光染色的标本最好在当天观察,随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。 2 间接法又称为荧光抗—抗体法 需要两种抗体参与,即一抗和二抗（荧光素标记）.一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用,但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。ϕ –可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。 间接免疫荧光法操作步骤κ •标本的处理及非特异染色的封闭同直接法； •一抗染色： C过夜.︒C作用30min或4︒–加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释,用0.01MpH7。4的PBS稀释)，37 • 0.01M PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)； C湿盒避光作用30min.︒•加荧光标记的二抗抗体，37 • 0。01M PBST避光漂洗5min×3次（例如包上锡纸，在摇床上漂洗）； •甘油缓冲液封片 •镜检
石蜡切片和免疫组化 步骤整理
一：步骤 石蜡切片（骨组织） 1：PFA固定，4℃冰箱过夜后，用10%的EDTA脱钙，时间3-5周，鉴定脱钙完成的标志是：用细针可以刺进骨头。脱钙完成后开始做实验前需要把骨头放到70%的酒精24h。 2：脱水：70％酒精（1h）→ 80％酒精（30min）→ 95％酒精Ⅰ（20min）→无水乙醇Ⅰ（15min）→无水乙醇Ⅱ（15min）。 3：透明：二甲苯（15min）（如果组织小（例如小鼠和大鼠的组织）就15min，如果透明时间过长组织易脆，如果组织大（例如兔子、人、狗等)时间就可以稍微长一些。 4：浸蜡：恒温56℃～58℃（不超过60℃）。→石蜡Ⅰ（1-2h）→石蜡Ⅱ（1-2h）。（如果组织大浸蜡时间可以延长，可以达6-8h。） 5：包埋：待石蜡稍微凝固以后放到4℃冰箱过夜。 6：切片与展片：切片的时候要保持包埋好的蜡块的硬度，如果蜡块软的话切片的时候组织就会碎，所以要把蜡块放在冰上。在42℃温水中展片（如果组织太脆，就先把组织浸泡在甘油中，几分钟？后在把组织放在冰块上，一段时间后再取出来重新切片。） 7：捞片：捞片时，载玻片45°倾斜，然后将片置于载玻片2/3处。 8：收片子，37℃保存。 HE染色 1：脱蜡和脱水：二甲苯，10min×3（不常换，脱蜡用），酒精5min（100%Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ； 95%；70%），蒸馏水Ⅰ，Ⅱ5min（如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长） 2：染色：苏木精-2-3min 3：蒸馏水冲洗（起反蓝的作用）：大概1h-2h 4：伊红染色-2min 4:脱水 70%→80%→95%Ⅰ→100%ⅠⅡ、Ⅲ酒精各一分钟 5：二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各3min（脱水用，最好是用一次换一次，脱水用的二甲苯要透明干净，质量才好）
石蜡切片免疫荧光染色方法
对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l柠檬酸钠，pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏水 中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 PBS洗涤3次。每次5分钟。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间
免疫荧光染色步骤
免疫组织化学染色步骤 1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ10min）、入水（100%酒精Ⅰ5min→100%酒精Ⅱ3min→95%酒精2min→80%酒精1min→70%酒精1min），蒸馏水冲洗后，0.01M PBS冲洗，5min×3次； 2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15min，自然冷却至室温，0.01M PBS冲洗，5min×3次； 3．3%H2O2溶液，37℃，20 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M PBS 冲洗，5min×3次； 4．正常羊血清封闭，37℃，30 min； 5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M PBS冲洗，5min×3次； 6．滴加二抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次； 7．滴加三抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次； 8．DAB避光显色，显微镜下控制显色时间； 9．0.01M PBS终止显色； 10．梯度酒精脱水（70%酒精1min→80%酒精1min→95%酒精Ⅰ1min→95%酒精Ⅱ1min→无水酒精Ⅰ10min→无水酒精Ⅱ10min），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15min →二甲苯Ⅱ10min； 11．中性树胶封片。 免疫荧光染色步骤 (1)将组织切片脱蜡入水； (2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15min，自然冷却至室温； (3)正常羊血清封闭，37℃，60 min； (4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，PBS冲洗，5min×3次； (5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次； (6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。 (7)荧光显微镜观察拍照。
石蜡切片免疫组化步骤.
石蜡切片免疫组化步骤 1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。 2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(10min)→95%乙醇(10min)→90乙醇(10min)→80%(10min) 4.抗原修复：柠檬酸钠缓冲液95度，10分钟. (枸橼酸三钠3g 枸橼酸0.4g然后加水到950毫升左右，然后用NaOH或HCI调pH值6.0，最后定容在1000ml) 5. PBS浸洗2次各5min 6.加3%H2O2孵育5min(室温或37度，避光)。肝组织过氧化物酶含量高。需增加浓度或增长时间。蒸馏水洗2minx3次 8.pbs-曲拉通通透（pv法不需要） 9.与二抗种属一致的血清封闭非特异位点。（pv法不需要） 9.滴加一抗4℃过夜 10.PBS浸洗3次各5min 11.滴加二抗室温或37℃孵育30min 12.PBS洗3次各5min 15.DAB显色5~20min，自来水充分涮洗 16.苏木素复染2~3min，自来水充分涮洗 17.氨水反蓝，过蓝可用盐酸酒精分化2s，自来水充分涮洗.用稀氨水返蓝，自来水里加几滴稀氨水，就行了，返蓝时间5分钟左右，就很好看了;淡氨水有人用50ml自来水＋三四滴的氢氧化铵； 18.脱水、透明80%(5min)→90%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→ 100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min) 19.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干 二、操作流程 1、脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2h以上，然后按以下流程进行： 二甲苯Ⅰ（1h）、二甲苯Ⅱ（30min）、100%酒精（30min）、95%酒精（15min）、70%酒精（15min）、50%酒精（15min）、蒸馏水（15min） 2、3%H2O2，室温封闭5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。 3、甩去H2O2，蒸馏水洗2min×3次。 4、抗原热修复：将切片置于装有抗原修复液的玻璃容器中（耐高温），进入微波炉内，容器内液体温度达到95～100℃后断电，连续三次。 5、PBS冲洗5min×3次。 6、5%BSA封闭液20min，甩去。 7、用0.1mol/L PBS稀释一抗100倍，滴加后4℃过夜。 8、PBS冲洗2min×3次，滴加二抗37℃20min，PBS冲洗2min×3次，滴加SABC 37℃20min，PBS冲洗5min×4次，显色剂显色。 9、自来水冲洗，封片，观察。 注意：如果需要做双标记法，则在操作完步骤8后，重复步骤3～8即可
石蜡切片免疫组化步骤（整理）
石蜡切片免疫组化步骤（整理） 石蜡切片免疫组化步骤 1.脱蜡复水 二甲苯1（10min）二甲苯II （10min）二甲苯III （10min）无水乙醇I （10 min）无水乙醇II （5min）95％乙醇（5min）70％乙醇（3min）50％乙醇（3min）30％乙醇（3min）1X PBS浸泡（5min）。 2.抗原修复 a.将抗原修复液（250ml）加入开口容器中，放入微波炉中高火（9档）6min左右沸腾， 然后将玻片放入后，使用低火（3档）4min，微波炉中冷却5min，重复三次。（注意液面是否下降，如是需补充等温的缓冲液，或可放置一杯蒸馏水在微波炉中同时加热。）从微波炉中取出，室温等待缓冲液彻底冷却后（大约30-45 min），取出玻片。 TIP：修复液（柠檬酸：0.1g，柠檬酸钠：0.75g，溶于250mL去离子水）。 b. 用PBS洗（浸泡或冲洗）三次，每次5min。（期间用组画笔（疏水性油性蜡笔）圈出阻 止范围，以节省抗体）。 Tip：抗原决定簇在4％PFA固定过程中遭到破坏，因此需要复性过程以使抗原决定簇重新暴露出来，利于抗体结合。 3. 封闭 封闭液为5% 的二抗同源血清，配方为：[940 μl 1xPBS + 50 μl serum + 10 μl 10% BSA] 室温封闭1h，在湿盒中进行。结束后将载玻片竖立于吸水纸上，去除封闭液。不需要洗！Tip:从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景 Tip：如不使用二抗同源血清，也可使用3％~5％BSA进行封闭。 Tip：封闭作用：空间占位。BSA能非特异性的与表面抗原决定簇
石蜡切片操作方法
石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将枸橼酸1500ml~3000ml的盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤： （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例） 石蜡切片脱蜡至水。 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 PBS冲洗，5分钟×3次。 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 PBS冲洗，5分钟×3次。 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 PBS冲洗，5分钟×3次。 显色剂显色（DAB或AEC）。
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 Histogrip TM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 Histogrip TM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60o C烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60o C烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 3、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml 的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤： （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例） 4.1石蜡切片脱蜡至水。 4.2 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 4.3蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。