石蜡切片照样可以做免疫荧光的
石蜡切片照样可以做免疫荧光的，只不过需要抗原修复，尽量不要用H2O2阻断（据军科院的老教授说会减弱荧光显色）
可以用于免疫荧光的抗体当然可以用于免疫组化，前面的原理都是一样的，只不过二抗一个选的是辣根酶标记的，一个是荧光素标记的，当然免疫组化跟免疫荧光所需的条件不同，需要重新摸索适当的浓度比例如果免疫荧光做出来了，说明一抗可以和目的蛋白结合，二抗跟一抗结合也没问题，那么免疫组化做不出就可以怀疑是二抗问题了
当然还有一个极端情况，就是免疫荧光看到的就不是目的蛋白而是自发荧光，那么就是一抗问题了
石蜡切片免疫荧光实验步骤
石蜡切片免疫荧光实验步骤 1、脱蜡至水：将组织切片室温放置10min后，依次将石蜡切片放 入二甲苯3min→无水乙醇5min—85%酒精5min—75%酒精5min—ddH2O洗5min。 2、抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复液（50X稀释至 1X使用)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（中火8min—停火8min—中低火7min）。此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min（具体修复液和修复条件根据组织来确定）。 3、画阻水圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，防止液体 流失。 4、BSA封闭：在圈内滴加3%-5%浓度BSA孵育30min（或二抗 同源血清封闭）。 5、一抗孵育：轻轻甩干封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的 一抗（溶于血清：PBS=1:19的抗体稀释液体系中），切片平放于湿盒（内加少量水防止抗体蒸发），4°C过夜。 6、二抗孵育：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每 次5min。切片稍甩干后在圈内滴加相应的荧光二抗，覆盖组织，避光RT孵育50min。 7、DAPI染核：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每 次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光RT孵育3-5min。 8、树脂封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每 次5min。切片稍甩干后用树脂封片剂封片（其间可滴加少量抗荧光淬灭剂）。 9、镜检拍照：切片于荧光显微镜/confocal/活细胞工作站中观察并 采集图像（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光； CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发橙光；CY5发红光）。 10、结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳 性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光，图片处理需使用Image J 软件。
免疫荧光染色步骤
免疫组织化学染色步骤 1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20→二甲苯Ⅱ10）、入水（100%酒精Ⅰ5→100%酒精Ⅱ3→95%酒精2→80%酒精1→70%酒精1），蒸馏水冲洗后，0.01M 冲洗，5×3次； 2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15，自然冷却至室温，0.01M 冲洗，5×3次； 3．32O 2溶液，37℃，20 ，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M 冲洗，5×3次； 4．正常羊血清封闭，37℃，30 ； 5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M 冲洗，5×3次； 6．滴加二抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次； 7．滴加三抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次； 8．避光显色，显微镜下控制显色时间； 9．0.01M 终止显色； 10．梯度酒精脱水（70%酒精1→80%酒精1→95%酒精Ⅰ1→ 95%酒精Ⅱ1→无水酒精Ⅰ10→无水酒精Ⅱ10），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15→二甲苯Ⅱ10； 11．中性树胶封片。 免疫荧光染色步骤 (1)将组织切片脱蜡入水； (2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15，自然冷却至室温；
(3)正常羊血清封闭，37℃，60 ； (4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，冲洗，5×3次； (5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 ，0.01M 冲洗，5×3次； (6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。 (7)荧光显微镜观察拍照。 细胞免疫组化染色（培养板中染色） 1．培养的细胞，弃去培养基，冷的洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10，洗2次，每次5－10分钟。 2．在含0.1% 100（4孔板200μl）的中进行10的透膜处理，洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。 3．羊血清用配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。 4．吸尽液体，勿洗，添加一抗，于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，洗3次，每次5-10分钟。 5．去除一抗后，细胞用洗三次。 6．加入二抗，然后加入相对应的孔，在37℃下作用30-60。洗3次，每次5-10分钟。 7．吸尽液体，加入三抗，在室温条件下作用30-60。洗3次，每次5-10分钟。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗及三抗的细胞作为阴性对照组。
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤 1 直接免疫荧光法的操作步骤 标本的处理： 石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次； ?2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min ?抗体染色： C孵育30min；–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37 ?0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。 ?缓冲甘油封片 –分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。 ?镜检：在荧光显微镜下观察。 ?优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。 ?缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。 直接免疫荧光法的注意事项 ?对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度； ?一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 ?染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化； –染色时间：从10 min到数小时，一般30 min； C的低温，延长染色时间。C可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2C)，高于37–染色温度：多采用室温(25 C 30 min效果好的多。–低温染色过夜较37 ?试验时需设置下列对照： –自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。 –阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 –特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。 ?若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 ?一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象； ?经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。 2 间接法又称为荧光抗-抗体法 需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。 –可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。 间接免疫荧光法操作步骤 ?标本的处理及非特异染色的封闭同直接法； ?一抗染色： C过夜。C作用30min或4–加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释)，37 ?0.01M PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)； C湿盒避光作用30min。?加荧光标记的二抗抗体，37 ?0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)； ?甘油缓冲液封片 ?镜检
免疫荧光-石蜡切片
石蜡切片免疫荧光操作规程 试剂 1)二甲苯 2)PBS缓冲液 3)0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。 4)goat血清 5)一抗稀释液：3%BSA in TBS，pH7.4 操作流程 1.脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min。 1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min； 2）无水乙醇中浸泡5min； 3）95%乙醇中浸泡5min； 4）70%乙醇中浸泡5min； 2.PBS洗两次各5min。 3.抗原修复，用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15min，必须等缓冲液冷却后，方能将切片取出。 4.PBS洗5min。 5.滴加5%正常山羊血清，室温封闭30min，甩去多余液体。 6.滴加一抗，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45min）。 7.PBS洗3次每次5min。 8.滴加荧光标记的二抗，室温避光孵育1h。（注意抗体针对的种属，使用浓度：Alexa488、Alexa555为1：1000，Cy3、FITC为1：200，用锡箔纸包住培养板放在抽屉中避光。） 9.PBS洗3次每次5min。 10. Hoechst染色：把1000×Hoechst用PBS稀释，50ul/片，染色10min。 11. PBS洗3次每次2 min。 12.封片：Mounting Medium封片，等Mounting Medium凝固后再拍照。
石蜡切片及免疫荧光
一、石蜡切片 1.固定： 将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。凝固组织中的物质成分，尽可能保持其活体时的结构。同时能使组织硬化，有利于切片的进行。 2.脱水： 为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。 3.透明： 常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。材料块在透明剂浸渍过程称透明。 4.浸蜡：先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。 先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。
5包埋: 以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。 6.切片: 切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。通常切片厚度为3-5um，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。 7.贴片与烤片: 般使用恒温水浴锅，温度控制在37-401左右，有利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60^恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。 8.切片脱蜡及水化: 干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化。 9染色: 经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。实验操作简单。 免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。
石蜡切片免疫荧光染色方法
对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l柠檬酸钠，pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏水 中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 PBS洗涤3次。每次5分钟。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织的采集、固定和保存： 采取组织后， 方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4?C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜 方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年 tesis）PBS缓冲液洗三次，每次5min，4?C保存于70%乙醇中。 2、组织的包埋、切片、展片及保存：： 固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54?C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10?m，贴于处理过的干净载玻片上，37?C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。 石蜡包埋： 保存于4?C 70%乙醇中的组织样品 ? 80%乙醇 15 min ? 95%乙醇 15 min ? 100%乙醇 15min ? 2 ? 1/2乙醇1/2二甲苯 15 min ?
二甲苯透明 5-10 min ? 1/2二甲苯1/2石蜡 30 min ? 石蜡（1） ? 石蜡（2）? 石蜡（3）包埋 ? RT保存 3、石蜡组织切片的免疫组化方法： 密封保存于RT的组织切片 ? 二甲苯(1) 20 min ? 二甲苯(2) 20 min ? 100%乙醇 20min ? 95%乙醇 10 min ? 80%乙醇 10 min
? 通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈 ? 切片在PBS中浸泡 5 min*2 ? %Tritonx RT 10 min ? 切片在PBS中浸泡 5 min*3 3%H2O2 RT 10min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 %胰酶RT 10min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+%Tritonx-100 in PBS) RT 60min 倾去blocking buffer，勿洗 一抗4?C overnight in blocking buffer 取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3 二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h 切片在PBS中浸泡 5 min*3 DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2） 如果是增强型DAB只要1min即可。