免疫荧光染色方法
免疫荧光染色方法
〔一〕制片
选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。
〔二〕固定
除研究细胞外表抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的作用有三：①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。
标本的固定原那么是：①不能损伤细胞的抗原；②不能凝集蛋白质；
③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。
常用抗原物质的固定方法
〔三〕水洗
固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。
〔四〕染色
染色分直接染色法与间接染色法。
1．材料与试剂
〔1〕荧光抗体，稀释至应用浓度。
〔2〕0.01Mol/L pH7.4PBS液
〔3〕9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。
〔4〕带盖方盘
2．直接染色法
〔1〕将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为
度，加盖，37℃感做30 min～45min。
〔2〕PBS冲洗3次，每次冲洗3min，即3×3ˊ冲洗。
〔3〕蒸馏水冲洗。
〔4〕滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。
2．间接染色法
〔1〕检查抗原：①取固定标本，加的免疫血清，37℃孵育30min；
②以PBS液3×3ˊ冲洗；③再加荧光标记的抗抗体，37℃孵育30min；
④PBS 3×3ˊ冲洗；⑤H2O冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。
〔2〕检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然枯燥，甲醇固定；②滴加相应抗原液〔按1﹕100～1﹕500稀释〕，37℃孵育30min；
③PBS液3×3ˊ冲洗；④加荧光抗体，37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ冲洗；⑥水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。
〔五〕结果显示
荧光显微镜所观察到的图象，主要以两个指标判断结果，一个是形态学特征；另一个是荧光的亮度，在结果的判定中，必须将二者结合起来，综合判定。
荧光强度的表示方法如下：
＋＋＋～＋＋＋＋：荧光闪亮，呈明显的亮绿色。
＋＋：荧光明亮，呈黄绿色。
＋：荧光较弱，但清楚可见。
± ：极弱的可疑荧光。
－：无荧光。
〔六〕标本保存
由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进展荧光染色之后应立即观察。
保存的方法可采取以下几种：①固定标本片以后低温保存，随用随染；②染色片采取优质封固剂，如特别的荧光封固剂〔Fluormount〕或碱性优质纯甘油固剂等封固。这些封固剂能防止荧光激发，封固后低温保存；④可以采用拍照保存照片。
荧光原位杂交〔FISH〕实验步骤
仪器设备1、医用微波炉；
2、水浴锅；
3、OLYMPUS BX51荧光显微镜；
4、OLYMPUS DP11数字显微照相机。FISH试剂〔1〕1×PBS：
由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；
〔2〕20×SSC〔pH7.0〕；
〔3〕2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；
〔4〕25mg/ml蛋白酶K消化液。
〔5〕变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml 蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新鲜配制。
〔6〕杂交后洗涤液：20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。
实验步骤 1、脱蜡：
1〕二甲苯脱蜡3次，每次5min；
2〕100％酒精两次，每次2min；
3〕移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气枯燥。
2、蛋白酶处理:
1〕每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液参加管，摇动直到酶溶解。
2〕37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育
20min。
3〕×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
4〕梯度酒精脱水〔-20℃预冷〕。
3、变性：
1〕每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；
2〕78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；
3〕78℃孵育8min；
4〕即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精，每缸2min；
5〕空气枯燥。
4、杂交：
1〕准备探针；
2〕取一个较大的湿盒，穿插放置切片；
3〕滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；
4〕盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
杂交后的水洗：
5〕镊子小心去除盖玻片；
6〕43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；
7〕2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；
8〕切片放人染色缸的1×PBS待检测，勿使切片枯燥。
检测：
9〕从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，防止标本枯燥。把切片放入湿盒，同时处理4切片。
10〕每切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；
11〕去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS 室温下洗3次，每次2min。
扩增：
12〕从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
13〕每切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
14〕去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS 室温下洗3次，每次2min；
15〕从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
16〕每切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
17〕1×PBS室温下洗3次，每次2min。
5、细胞核染色：
1〕切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；
2〕尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h可以在显微镜下观察。
PRINS步骤 1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS；
2、用0.2mol/L盐酸处理5min；
3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃15min；
4、分别用80％，95％和100％酒精脱水，室温干片；
5、加PCR混合液25μL(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，各加200μmol/L dATP，dCTP，dGTP，
1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5μl，引物250ng，Taq DNA聚合酶2U)，加盖片；
6、94℃变性5min后置入65℃湿盒中5min；
7、用0.1×SSC液，65℃洗5min；
8、片于65℃10s～20s；用4×SSC-0.1％吐温20液42℃洗5min，2次；
9、经Buffer I液洗后滴加20％羊血清封闭30min；
10、加地高辛抗体复合物(1:500)室温下2h；
11、BufferⅢ液洗5min；
12、用BCIP-NBT显色1h～2h，在镜下控制，终止显色；
13、用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。
FISH-荧光原位杂交实验〔原位杂交〕
1. 实验目的
通过实验了解荧光原位杂交技术的根本原理和在生物学、医学领域的应用。掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。
2. 实验原理
荧光原位杂交〔Fluorescence in situ hybridization FISH〕是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的根底上开展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组构造研究、染色体精
细构造变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。FISH的根本原理是用的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原那么，与待检材料中未知的单链核酸进展特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA 分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进展杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分为三类：1〕染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合严密，杂交信号强，易于检测；2〕全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3〕特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进展标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进展检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进展放大，从而可以检测500bp的片段。而直接标记
法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进展信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。
3. 实验用具及材料
Y染色体探针、人外周血中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400、荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200mL移液器、20mL移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温20。
4. 实验方法及步骤
1〕探针及标本的变性〔1〕探针变性将探针在75℃怛温水浴中温育5min，立即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。〔2〕标本变性①将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3h。〔经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片〕。
②取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70%甲酰胺
/2×SSC的变性液中变性2～3min。③立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5min，然后空气枯燥。
2〕杂交将已变性或预退火的DNA探针10mL滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于源潮湿暗盒中37℃要交过夜〔约15～17h〕。由于杂交液较少，而且
杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进展。
3〕洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。〔1〕杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。〔2〕将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。〔3〕在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5min。〔4〕在室温下，将玻片标本2×SSC中轻洗一下。
4〕杂交信号的放大
〔1〕在玻片的杂交部位加150mL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。〔2〕去掉保鲜膜，再加150mL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育40min。〔3〕取出标本，将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。〔4〕在玻片标本的杂交部位加150mL封闭液II，覆盖保鲜膜，37℃温育
20min。〔5〕去掉保鲜膜，加150mL antiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育40min。〔6〕取出标本，将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中，洗涤3次，每次5min。
〔7〕重复步骤〔1〕、〔2〕、〔3〕，再于2×SSC中室温清洗一下。〔8〕取出玻片，自然枯燥。〔9〕取200mL PI/antifade染液滴加
在玻片标本上，盖上盖玻片。
5〕封片
可采用不同类型的封片液。如果封片中不含有Mowiol〔可使封片液产生自封闭作用〕，为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。
6〕荧光显微镜观察FISH结果
先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后翻开荧光激发光源，FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色，而经FITC 标记的探针的探针所在位置发出绿色荧光。由于本实验使用的是Y染色体上的特异序列，因此在男性外周血染色体标本的杂交中呈阳性，即使在末分裂的细胞中，也可以观察到明显的杂交信号。
附录I FISH相关溶液的配制
1〕20×SSC：175.3g NaCl, 882.g柠檬酸钠，加水至1000mL〔用10mol/L NaOH调pH至7.0〕。
2〕去离子甲酰胺〔DF〕：将10g混合床离子交换树脂参加100mL 甲酰胺中。电磁搅拌30min，用Whatmanl号滤纸过滤。
3〕体积分数70%甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺，5mL 20×SSC，10mL水。
4〕体积分数50%甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺，20mL 20×SSC，80mL水。
5〕体积分数50%硫酸葡聚糖〔DS〕：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。
6〕杂交液：8mL体积分数25%DS，20mL 20×SSC混合。〔或40mL体积分数50%DS，20mL 20×SSC，40mL ddH2O混合〕取上述混合液50mL，与5mL DF混合即成。其终浓度为体积分数10% DS 2×SSC，体积分数50% DF。
7〕PI/antifade溶液
PI原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为100mg/mL，取出1mL，加39mL双蒸水，使终浓度为2.5mg /mL。
Antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶液，使其浓度为10mg/mL，用0.5mmol/L的NaHCO3调pH值为8.0。取上述溶液1mL，加9mL甘油，混匀。
PI/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1：9比例充分混匀，
-20℃保存备用。
8〕DAPI/antifade溶液：用去离子水配制1mL/mg DAPI储存液，按体积比1:300,以antifade溶液稀释成工作液。
9〕封闭液I：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，dd H2O 1mL, Tween 20 5mL混合。
10〕封闭液II：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250mL, dd H2O 750mL, Tween 20 5mL混合。
11〕荧光检测试剂稀释液：体积分数5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，dd H2O 3mL, Tween 20 5mL混合。
12〕洗脱液：100mL 20×SSC，加水于500mL，加Tween20 500 mL。
13〕TE缓冲液：pH8.0: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA；
pH7.6: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA；
pH7.4: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA。
14〕溶液I：25mmol/L Tris HCl(pH 7.4), 10mmol/L EDTA。
15〕溶液II：10% SDS，0.2M NaOH。
16〕溶液III：Kac 14.7g, HAc 5.8mL, 加水至50mL。
17〕LB培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g, NaCl 10g, 加水至1000mL，用5mmol/L NaOH调pH值至7.0。
附录II DNA探针的制备
质粒DNA克隆的提取、纯化和鉴定。
1〕用接种环挑取一小块-70℃冻存的转化菌，接种于5mL LB培养基中，37℃剧烈震荡过夜。
2〕将收集到的菌液3000r/min离心10min，弃掉上清液。
3〕向菌体沉淀中参加溶液I300mL, 溶液II 350mL，混匀后将其置于冰浴中片刻，再加溶液III 350mL混匀，加酚和氯仿混合液〔体积比为1：1〕500mL 后充分混匀。
4〕12000r/min离心10min。
5〕取上清液，向其参加600mL异丙醇，充分混匀后以12000r/min 离心15～30min，弃掉上清液。
6〕用1500mL体积分数70%乙醇洗涤沉淀2～3次，晾干。
7〕用TE缓冲液溶解DNA沉淀。
8〕加水至200mL，以Rnase A〔终浓度200mg /mL〕在50℃水浴中消化30min。
9〕参加酚、氯仿和异丙醇〔三者体积比25：24：1〕溶液200mL 混匀，12000r/min离心2min。
10〕取上清液，再参加氯仿和异戊醇溶液〔体积比为24：1〕200mL 混匀，12000r/min离心2min。
11〕取上清液，以20mL 3M NaAc及500mL体积分数100%乙醇沉淀DNA。
12〕可将上述溶液在-70℃放置30min至1h以充分沉淀DNA，然后用12000r/min离心15min。
13〕将沉淀用1.5mL体积分数70%乙醇轻洗，自然晾干。
14〕用TE缓冲液溶解DNA。
15〕取1～2mL上述纯化的DNA溶液，于8.0g/L琼脂糖/TBE 缓冲液凝胶电泳鉴定DNA并检测浓度。
16〕取1mg DNA，用相应限制性切酶4～5单位，BSA100～200mg /mL，于37℃水浴中酶解2～4h。
17〕电泳观察，根据酶切片段数量及大小，估计DNA克隆插入片段大小。
附录III 探针的生物素标记
探针的标记可采用PCR或缺口平移法来制备，但多数情况下采用缺口平移法来制备。该过程包括以DNase I在DNA双链上作用产生缺口并以此作为第二反响步骤的作用赳噗，即大肠杆菌聚合酶I自缺口处进展修补合成。在修补合成互补链时将生物素标记的d-NTP掺入，从而复制出带有生物素标记的探针。本实验采用缺口平移法，按GIBCO公司提供的方法以biotin-14-dATP 标记探针。标记好的探针可以在-20℃下长期保存。
总反映体积50mL，DNA 1mg,10×dNTP 5mL, 10×En zyme Mix 5mL。
其中10×dNTP为：500mmol/L Tris·HCl(pH 7.8)
50mmol/L MgCl2
100mmol/Lβ-硫基乙醇
100mg /ml去除核酸酶的牛血清白蛋白
0.2mmol/L dCTP, 0.2mmol/L dGTP, 0.2mmol/L dTTP 0.1mmol/L dATP, 0.1mmol/L biotin-14-dATP
10×酶混合为：
0.5units/mL DNA聚合酶I
0.075untis/mL Dnase I
50mmol/L Tris·HCl(pH 7.5)
5mmol/L醋酸镁
1mmol/L β-硫基乙醇
0.1mmol/L苯甲基磺酰氟
体积分数50%甘油
100mg /mL牛血清白蛋白
将上述混合液于16℃作用1h。用8.0g/L琼脂糖/TBE缓冲液凝胶电检测标记产物。以DNA片段长约300～500bp为宜。如片段较大，那么应加适量Dnase I继续酶切，直至DNA片段长度适中后，加5mL终止缓冲液〔300mmol/L EDTA〕终止反响。用乙醇沉淀的方法将探针与非掺入的核苷酸分开。
免疫荧光细胞化学染色方法
免疫荧光细胞化学染色方法 一、标本制作 可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，经适当固定或不固定，作免疫荧光染色用。 二、荧光抗体染色方法 （一）直接法 1．染色切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如1：8或1：16的荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体或兔抗人IgG或IgA荧光抗体等），在室温或37℃染色30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。 2．洗片倾去存留的荧光抗体，将切片浸入pH7.4或 pH7.2PBS中洗两次，搅拌，每次5min，再用蒸馏水洗1min，除去盐结晶。 3．用50%缓冲（0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0～9.5）甘油封固、镜检 4．对照染色 ①正常免荧光血清染色，如上法处理切片，结果应为阴性。 ②染色抑制试验（一步法）：将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可用盐水代替
未标记抗血清，染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。③类属抗原染色试验，前面已作叙述。 直接法比较简单，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原，特异性高而敏感性较低。 （二）间接法 （1）切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗两次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体。 （2）再滴加间接荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等），同上步骤，染色30min，37℃，缓冲盐水洗两次10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。 对照染色：①抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。②抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。③阳性对照。 间接法中上述方法称双层法（Double Layer Method）。另一种称夹心法，即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下： ①切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。 ②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃，30min。
免疫荧光染色步骤
免疫组织化学染色步骤 1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20→二甲苯Ⅱ10）、入水（100%酒精Ⅰ5→100%酒精Ⅱ3→95%酒精2→80%酒精1→70%酒精1），蒸馏水冲洗后，0.01M 冲洗，5×3次； 2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15，自然冷却至室温，0.01M 冲洗，5×3次； 3．32O 2溶液，37℃，20 ，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M 冲洗，5×3次； 4．正常羊血清封闭，37℃，30 ； 5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M 冲洗，5×3次； 6．滴加二抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次； 7．滴加三抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次； 8．避光显色，显微镜下控制显色时间； 9．0.01M 终止显色； 10．梯度酒精脱水（70%酒精1→80%酒精1→95%酒精Ⅰ1→ 95%酒精Ⅱ1→无水酒精Ⅰ10→无水酒精Ⅱ10），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15→二甲苯Ⅱ10； 11．中性树胶封片。 免疫荧光染色步骤 (1)将组织切片脱蜡入水； (2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15，自然冷却至室温；
(3)正常羊血清封闭，37℃，60 ； (4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，冲洗，5×3次； (5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 ，0.01M 冲洗，5×3次； (6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。 (7)荧光显微镜观察拍照。 细胞免疫组化染色（培养板中染色） 1．培养的细胞，弃去培养基，冷的洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10，洗2次，每次5－10分钟。 2．在含0.1% 100（4孔板200μl）的中进行10的透膜处理，洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。 3．羊血清用配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。 4．吸尽液体，勿洗，添加一抗，于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，洗3次，每次5-10分钟。 5．去除一抗后，细胞用洗三次。 6．加入二抗，然后加入相对应的孔，在37℃下作用30-60。洗3次，每次5-10分钟。 7．吸尽液体，加入三抗，在室温条件下作用30-60。洗3次，每次5-10分钟。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗及三抗的细胞作为阴性对照组。
免疫荧光染色实验步骤
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。 zo-1的免疫荧光，步骤如下： 1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。 2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟 3、4%的甲醛室温固定20-30分钟 4、1×PBS洗3次，每次10分钟 5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟 6、1×PBS洗3次，每次10分钟 7、5%BSA室温封闭30分钟 8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜 9、1×PBS洗3次，每次10分钟 10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光!!! 11、1×PBS洗3次，每次10分钟 12、95%甘油封片 注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释 从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光 细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致： 1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。 注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。 2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。 3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。 5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。 6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。 7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。 8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。 建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。 细胞免疫荧光简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min*3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2*5min 6.羊血清封闭：37度，20分钟 7.一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度1-2小时 8.4度PBS洗净，3min*5次 9.二抗37度小于一小时 10.37度PBS洗净，3*5min 凉干封片(封闭液PH8.5) 不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下pH值，可以使用PBS多清洗几次，也可以延长PBS清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。
免疫荧光染色方法介绍
细胞免疫荧光-多重染色 1. 原理介绍 我们现在来考虑一下多重染色。使用多个标签进行免疫染色的目的，是在同一细胞或组织切片里，同时对两个或多个抗原进行染色定位。各个抗原分别使用不同的标签，以便区分。抗原可以是共定位的，即它们的亚细胞定位一致，或者是分开的。 荧光的作用原理。荧光分子能吸收特定波长的光，然后发射更长波长的光。在发出荧光之前，荧光分子跟环境相互作用失去能量，从而达到这一目的，这一现象叫内转换。 电子可以是基态或静止态 S0，也可以是较高能量的激发态 S1 和 S2。在每一个电子态，荧光染料存在的振动能级可以有多种，包括 0 级、1 级和 2 级。室温下，能量不足以使电子激发到激发态 S1 和 S2 或基态的较高振动能级。所以，只有当光存在时，吸收才发生在振动能态最低的分子上。 荧光染料在吸收光后，通常被激发至一个较高的振动能级 S1 或 S2，然后再回到S1的最低振动能级，从而完成内转换过程。此过程与光子发射过程结合形成荧光。荧光染料可多次重复这一激发发射循环，直至荧光消失，也就是光漂白。相较而言，有些荧光素更容易发生光漂白。例如，FITC 重复激发发射循环约 30000 次后发生光漂白。而第二代荧光染料，如 Alexa Fluor? 系列的光漂白没有这么快，由于它们有较高的消光系数，比较明亮，更适合用于多标记实验，如本幻灯片图像所示 常用到的一种传统染料的组合是：DAPI 蓝色染料、FITC 绿色染料、TRITC 黄色染料和 Cy5? 红色染料。而相应的第二代染料组合是：DAPI 蓝色染料、Alexa Fluor? 488 绿色染料、Alexa Fluor? 555 黄色染料和 Alexa Fluor? 647 红色染料 设计荧光多重标记实验时，可以采取以下几个步骤，以最大限度的减小或消除串色现象。首先，分析待选荧光素的吸收光谱和发射光谱，结合显微镜滤光片组的特点，评估是否兼容。尽量选择发射带宽窄的荧光素，以最大限度的减小与其它荧光素光谱的重叠。使用最明亮的荧光素来标记表达丰度最低的蛋白。如果蛋白的丰度相近，则适当降低波长最短的荧光素的使用浓度，从而减小到较长波长荧光素的串色程度。仔细选择显微镜的滤光片组，尽可能的匹配每种荧光素的吸收光谱和发射光谱。 调整显微镜的曝光，增益与减光镜设置，微调过强的荧光信号。最后，在多重染色之前，分别进行单染预实验，使用其它滤光片来观察评估串色问题。并根据上述参数调整实验设计。 2. 方法 现在让我们来讨论多重染色技术。简言之，多重染色实验是同时使用两个或多个标签的染色技术。多重染色方案以本次讲座前半部分为基础，必要时加上孵育和清洗步骤。无
免疫荧光三色染色步骤
免疫荧光三色染色步骤 免疫荧光三色染色是一种常用的免疫组化技术，用于检测和定位细胞或组织中的特定抗原。通过使用三种不同的荧光染料，可以同时检测三种不同的抗原，从而在同一样本中获得更多的信息。 下面是免疫荧光三色染色的步骤： 1. 样本处理：首先需要准备好待检测的细胞或组织样本。可以通过固定、切片和脱脂等步骤来处理样本，以便于荧光染料的渗透和抗原的暴露。 2. 抗原修复：某些细胞或组织中的抗原可能会经历一定程度的损伤或变性，需要进行抗原修复以恢复其免疫反应性。常用的抗原修复方法包括热处理、酶解和化学修复等。 3. 阻断非特异性结合：为了避免荧光染料的非特异性结合，需要使用适当的阻断剂来防止非特异性结合。常用的阻断剂包括牛血清蛋白、小鼠或兔子血清等。 4. 一抗染色：选择合适的一抗，加入到样本中与目标抗原结合。一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体，根据实验的需要选择合适的一抗。 5. 二抗染色：二抗是与一抗结合的抗体，通常是兔抗小鼠或小鼠抗
兔的抗体。二抗上标记有荧光染料，常见的有荧光素、荧光素同工酶和荧光素同工酶等。 6. 染色显色：将标记有荧光染料的二抗加入到样本中，与一抗所结合的抗原发生特异性反应，形成荧光染色的复合物。 7. 洗涤：染色完成后，需要进行多次洗涤以去除未结合的抗体和荧光染料，减少背景信号的干扰。 8. 封片：将处理好的样本用适当的封片剂封装在载玻片上，然后使用适当的封片胶或胶带固定样本。 通过以上步骤，可以实现免疫荧光三色染色的目的。这种技术可以在细胞或组织中同时检测和定位多种抗原，为科研工作者提供更多的信息和数据。 需要注意的是，在进行免疫荧光三色染色时，要选择合适的一抗和二抗，以及荧光染料的激发和发射波长。此外，还需要进行严格的实验控制，包括阴性对照和阳性对照，以确保实验结果的准确性和可靠性。 免疫荧光三色染色技术在生命科学研究中具有广泛的应用，可以用于研究细胞分子机制、疾病诊断和治疗等方面。随着技术的不断发展和改进，相信免疫荧光三色染色技术将在未来的研究中发挥更大的作用。
免疫荧光组织(细胞)化学染色方法
免疫荧光组织（细胞）化学染色方法 免疫荧光组织（细胞）化学染色方法：直接法 基本原理 将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。 试剂与仪器 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml） 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
荧光显微镜 玻片架 滤纸H 37℃温箱等。 试验步骤 1、滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持肯定湿度。 2、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全掩盖标本，置 于有盖搪瓷盒内，保温肯定时间（参考：30min）。 3、取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按挨次过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。 4、取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓
冲甘油，以盖玻片掩盖。 5、马上用荧光显微镜观看。观看标本的特异性荧光强度，一般可用"+'表示： （-）无荧光；（）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清晰可见；（++）荧光光明；（+++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达"++'以上，而各种对比显示为（）或（-），即可判定为阳性。 留意事项 1、对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有肯定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观看。 2、染色的温度和时间需要依据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采纳室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采纳0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。
细胞免疫荧光染色操作步骤
细胞免疫荧光染色操作步骤 免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋 白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光。实验步骤如下： 1.已转染72h的细胞种于共聚焦专用培养皿里，冰PBS洗三遍，每次5分钟。 2. 细胞半干时，覆盖以4%冷的多聚甲醛固定15分钟，避光。 3.吸去多聚甲醛后，用冰PBS洗三遍，每次5分钟。 4. 0.5%Triton X-100覆盖细胞10分钟，冰PBS洗三遍，每次5分钟。 5. 与二抗相同宿主的血清？进口胎牛血清室温封闭30分钟。 6. 配制一抗（SAB2104246-50UG, Sigma, USA）：SAB+FBS=1:200。 7.加入一抗覆盖细胞，锡纸包裹4度避光过夜。 次日： 8.取出细胞复温至室温约1h。 9.冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。 10.配制荧光标记二抗：Ab50598 Goat anti-rabbit IgG(H&L) TRITC，用PBS或FBS 配制。浓度1:200 11.加入二抗，室温孵育1小时(避光)。 12. 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。 13.DAPI染核，每皿1滴，完全覆盖住细胞即可。 14. 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。 15.加入防荧光淬灭封片剂，避光。 16.上机confocol 建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题， 再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会淬灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时 候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。4.不管采用何种 方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。
免疫荧光染色方法
免疫荧光染色方法 （一）制片 选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。 （二）固定 除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的作用有三：①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。 标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。
（三）水洗 固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。 （四）染色 染色分直接染色法与间接染色法。 1．材料与试剂 （1）荧光抗体，稀释至应用浓度。 （2）0.01Mol/L pH7.4PBS液 （3）9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。 （4）带盖方盘 2．直接染色法 （1）将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖，37℃感做30 min～45min。 （2）PBS冲洗3次，每次冲洗3min，即3×3ˊ冲洗。 （3）蒸馏水冲洗。 （4）滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。 2．间接染色法 （1）检查抗原：①取固定标本，加已知的免疫血清，37℃孵育30min；②以PBS液3×3ˊ冲洗；③再加荧光标记的抗抗体，37℃孵育
30min；④PBS 3×3ˊ冲洗；⑤H2O冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。 （2）检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，甲醇固定；②滴加相应抗原液（按1﹕100～1﹕500稀释），37℃孵育30min； ③PBS液3×3ˊ冲洗；④加荧光抗体，37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ冲洗；⑥水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。 （五）结果显示 荧光显微镜所观察到的图象，主要以两个指标判断结果，一个是形态学特征；另一个是荧光的亮度，在结果的判定中，必须将二者结合起来，综合判定。 荧光强度的表示方法如下： ＋＋＋～＋＋＋＋：荧光闪亮，呈明显的亮绿色。 ＋＋：荧光明亮，呈黄绿色。 ＋：荧光较弱，但清楚可见。 ±：极弱的可疑荧光。 －：无荧光。 （六）标本保存 由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。 保存的方法可采取以下几种：①固定标本片以后低温保存，随用随