免疫荧光染色步骤
免疫组织化学染色步骤
1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20→二甲苯Ⅱ10）、入水（100%酒精Ⅰ5→100%酒精Ⅱ3→95%酒精2→80%酒精1→70%酒精1），蒸馏水冲洗后，0.01M 冲洗，5×3次；
2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15，自然冷却至室温，0.01M 冲洗，5×3次；
3．32O 2溶液，37℃，20 ，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M 冲洗，5×3次；
4．正常羊血清封闭，37℃，30 ；
5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M 冲洗，5×3次；
6．滴加二抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次；
7．滴加三抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次；
8．避光显色，显微镜下控制显色时间；
9．0.01M 终止显色；
10．梯度酒精脱水（70%酒精1→80%酒精1→95%酒精Ⅰ1→ 95%酒精Ⅱ1→无水酒精Ⅰ10→无水酒精Ⅱ10），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15→二甲苯Ⅱ10；
11．中性树胶封片。
免疫荧光染色步骤
(1)将组织切片脱蜡入水；
(2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15，自然冷却至室温；
(3)正常羊血清封闭，37℃，60 ；
(4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，冲洗，5×3次；
(5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 ，0.01M 冲洗，5×3次；
(6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。
(7)荧光显微镜观察拍照。
细胞免疫组化染色（培养板中染色）
1．培养的细胞，弃去培养基，冷的洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10，洗2次，每次5－10分钟。
2．在含0.1% 100（4孔板200μl）的中进行10的透膜处理，洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。
3．羊血清用配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。
4．吸尽液体，勿洗，添加一抗，于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，洗3次，每次5-10分钟。
5．去除一抗后，细胞用洗三次。
6．加入二抗，然后加入相对应的孔，在37℃下作用30-60。洗3次，每次5-10分钟。
7．吸尽液体，加入三抗，在室温条件下作用30-60。洗3次，每次5-10分钟。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗及三抗的细胞作为阴性对照组。
8．避光显色，显微镜下控制显色时间；
9．终止显色；显微镜下观察拍照。
细胞免疫荧光染色（培养板中染色）
1．培养的细胞，弃去培养基，冷的洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10，洗2次，每次5－10分钟。
2．在含0.1% 100（4孔板200μl）的中进行10的透膜处理，洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。
3．羊血清用配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。
4．吸尽液体，勿洗，添加一抗，于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，洗3次，每次5-10分钟。
5．去除一抗后，细胞用洗三次。
6．滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 ，0.01M 冲洗，5×3次；
7．防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。
8．荧光显微镜观察拍照。
细胞爬片后的步骤同切片的免疫组织化学及免疫荧光的步骤。
染色
1. 石蜡切片常规脱蜡入水：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15→100%酒精Ⅰ、Ⅱ→95%酒精Ⅰ、Ⅱ→80%酒精→70%酒精→50%酒精各1-2。2．水洗：普通水洗2次，蒸馏水洗1次。
3. 苏木素染色10。
4. 充分水洗：自来水洗10。
5. 盐酸酒精分色：分色10-30s，随时镜检分色程度，使不该着色的部分全部褪去，应着色的部分着色适当。着色标准：胞核为深蓝色，胞质无色或浅灰色。
6. 充分水洗：自来水洗10。
7. 氨水蓝化2-3。
8. 充分水洗：自来水洗10-15，水洗后若染色太浅则可重新返回苏木素。
9. 脱水：70%、80%酒精各1-2。
10. 伊红染色0.5左右，随时镜下观察，染色不宜过深，要与苏木素作对比，要协调鲜明。
11．脱水透明：95%酒精Ⅰ、Ⅱ各1-2→100%酒精Ⅰ、Ⅱ各15→二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15。
12．中性树胶封片。
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 （1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡 （2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min （4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。 （6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。 （8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温 30min。 （12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。 （15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 （18）使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 （1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min （2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min （3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min （5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （6）1%BSA室温封闭30min （7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 （10）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用 （12）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （13）用抗荧光淬灭剂封片 （14）荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一） （1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。
免疫荧光染色步骤
免疫组织化学染色步骤 1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20→二甲苯Ⅱ10）、入水（100%酒精Ⅰ5→100%酒精Ⅱ3→95%酒精2→80%酒精1→70%酒精1），蒸馏水冲洗后，0.01M 冲洗，5×3次； 2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15，自然冷却至室温，0.01M 冲洗，5×3次； 3．32O 2溶液，37℃，20 ，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M 冲洗，5×3次； 4．正常羊血清封闭，37℃，30 ； 5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M 冲洗，5×3次； 6．滴加二抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次； 7．滴加三抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次； 8．避光显色，显微镜下控制显色时间； 9．0.01M 终止显色； 10．梯度酒精脱水（70%酒精1→80%酒精1→95%酒精Ⅰ1→ 95%酒精Ⅱ1→无水酒精Ⅰ10→无水酒精Ⅱ10），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15→二甲苯Ⅱ10； 11．中性树胶封片。 免疫荧光染色步骤 (1)将组织切片脱蜡入水； (2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15，自然冷却至室温；
(3)正常羊血清封闭，37℃，60 ； (4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，冲洗，5×3次； (5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 ，0.01M 冲洗，5×3次； (6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。 (7)荧光显微镜观察拍照。 细胞免疫组化染色（培养板中染色） 1．培养的细胞，弃去培养基，冷的洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10，洗2次，每次5－10分钟。 2．在含0.1% 100（4孔板200μl）的中进行10的透膜处理，洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。 3．羊血清用配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。 4．吸尽液体，勿洗，添加一抗，于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，洗3次，每次5-10分钟。 5．去除一抗后，细胞用洗三次。 6．加入二抗，然后加入相对应的孔，在37℃下作用30-60。洗3次，每次5-10分钟。 7．吸尽液体，加入三抗，在室温条件下作用30-60。洗3次，每次5-10分钟。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗及三抗的细胞作为阴性对照组。
免疫荧光染色实验步骤
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。 zo-1的免疫荧光，步骤如下： 1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。 2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟 3、4%的甲醛室温固定20-30分钟 4、1×PBS洗3次，每次10分钟 5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟 6、1×PBS洗3次，每次10分钟 7、5%BSA室温封闭30分钟 8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜 9、1×PBS洗3次，每次10分钟 10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光!!! 11、1×PBS洗3次，每次10分钟 12、95%甘油封片 注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释 从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光 细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致： 1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。 注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。 2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。 3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。 5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。 6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。 7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。 8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。 建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。 细胞免疫荧光简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min*3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2*5min 6.羊血清封闭：37度，20分钟 7.一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度1-2小时 8.4度PBS洗净，3min*5次 9.二抗37度小于一小时 10.37度PBS洗净，3*5min 凉干封片(封闭液PH8.5) 不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下pH值，可以使用PBS多清洗几次，也可以延长PBS清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。
免疫荧光三色染色步骤
免疫荧光三色染色步骤 免疫荧光三色染色是一种常用的免疫组化技术，用于检测和定位细胞或组织中的特定抗原。通过使用三种不同的荧光染料，可以同时检测三种不同的抗原，从而在同一样本中获得更多的信息。 下面是免疫荧光三色染色的步骤： 1. 样本处理：首先需要准备好待检测的细胞或组织样本。可以通过固定、切片和脱脂等步骤来处理样本，以便于荧光染料的渗透和抗原的暴露。 2. 抗原修复：某些细胞或组织中的抗原可能会经历一定程度的损伤或变性，需要进行抗原修复以恢复其免疫反应性。常用的抗原修复方法包括热处理、酶解和化学修复等。 3. 阻断非特异性结合：为了避免荧光染料的非特异性结合，需要使用适当的阻断剂来防止非特异性结合。常用的阻断剂包括牛血清蛋白、小鼠或兔子血清等。 4. 一抗染色：选择合适的一抗，加入到样本中与目标抗原结合。一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体，根据实验的需要选择合适的一抗。 5. 二抗染色：二抗是与一抗结合的抗体，通常是兔抗小鼠或小鼠抗
兔的抗体。二抗上标记有荧光染料，常见的有荧光素、荧光素同工酶和荧光素同工酶等。 6. 染色显色：将标记有荧光染料的二抗加入到样本中，与一抗所结合的抗原发生特异性反应，形成荧光染色的复合物。 7. 洗涤：染色完成后，需要进行多次洗涤以去除未结合的抗体和荧光染料，减少背景信号的干扰。 8. 封片：将处理好的样本用适当的封片剂封装在载玻片上，然后使用适当的封片胶或胶带固定样本。 通过以上步骤，可以实现免疫荧光三色染色的目的。这种技术可以在细胞或组织中同时检测和定位多种抗原，为科研工作者提供更多的信息和数据。 需要注意的是，在进行免疫荧光三色染色时，要选择合适的一抗和二抗，以及荧光染料的激发和发射波长。此外，还需要进行严格的实验控制，包括阴性对照和阳性对照，以确保实验结果的准确性和可靠性。 免疫荧光三色染色技术在生命科学研究中具有广泛的应用，可以用于研究细胞分子机制、疾病诊断和治疗等方面。随着技术的不断发展和改进，相信免疫荧光三色染色技术将在未来的研究中发挥更大的作用。
细胞免疫荧光染色操作步骤
细胞免疫荧光染色操作步骤 免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋 白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光。实验步骤如下： 1.已转染72h的细胞种于共聚焦专用培养皿里，冰PBS洗三遍，每次5分钟。 2. 细胞半干时，覆盖以4%冷的多聚甲醛固定15分钟，避光。 3.吸去多聚甲醛后，用冰PBS洗三遍，每次5分钟。 4. 0.5%Triton X-100覆盖细胞10分钟，冰PBS洗三遍，每次5分钟。 5. 与二抗相同宿主的血清？进口胎牛血清室温封闭30分钟。 6. 配制一抗（SAB2104246-50UG, Sigma, USA）：SAB+FBS=1:200。 7.加入一抗覆盖细胞，锡纸包裹4度避光过夜。 次日： 8.取出细胞复温至室温约1h。 9.冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。 10.配制荧光标记二抗：Ab50598 Goat anti-rabbit IgG(H&L) TRITC，用PBS或FBS 配制。浓度1:200 11.加入二抗，室温孵育1小时(避光)。 12. 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。 13.DAPI染核，每皿1滴，完全覆盖住细胞即可。 14. 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。 15.加入防荧光淬灭封片剂，避光。 16.上机confocol 建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题， 再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会淬灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时 候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。4.不管采用何种 方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光实验步骤大全(精华版) 免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 1.将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1小时，脱蜡。 2.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 3.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。 4.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 注意：步骤3和4用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原可以直接跳过这一步骤。
5.进行抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3分钟，后转成低火15分钟。 6.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 7.在室温下，使用3% H2O2孵育30分钟，目的是灭活内源性过氧化物酶。 8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 9.使用1% BSA进行室温封闭30分钟，用于封闭非特异性抗原表位。 10.按照抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4℃湿盒中静置过夜。 11.次日取出切片，室温下复温30分钟。 12.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
13.选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37℃避光孵育30分钟。 14.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 15.在避光条件下，使用DAPI染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用。 16.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 17.在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 18.使用荧光显微镜进行观察和拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 1.在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3分钟。 2.使用4%多聚甲醛固定细胞爬片15分钟。
3.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 4.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。 5.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 6.使用1% BSA室温封闭30分钟。 7.弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜。 8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 9.细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗。 10.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
免疫荧光染色实验步骤
免疫荧光染色实验步骤 1.细胞处理：将需要进行染色的细胞培养于培养皿中，通常使用生理 盐水或PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤细胞，以去除培养基或其它细胞残留物。 2.固定：使用适当的固定剂，如甲醛或乙醛，固定住细胞。通常在室 温下固定细胞10-30分钟，然后用PBS洗涤。 3.渗透化处理：为了增强抗原与抗体的结合，需要使用渗透化剂如BSA（牛血清白蛋白）或胎牛血清等，封闭其它非特异结合位点。浓度通 常为1-5%的BSA，可以根据实验需要调整。 4.预处理：通过预处理，可以增强抗原的可见性。预处理方法包括煮沸、酶解或蛋白酶处理等。具体方法应根据需要选择。 5.抗原特异性溶液：将具有特异性的抗体溶液加入到含有细胞的培养 皿中，使其与抗原结合。抗体通常与标记物如荧光染料共价结合，使得标 记的抗原能够被荧光显微镜观察。 6.清洗：将细胞用PBS洗涤，以去除未与抗体结合的游离抗体。 7.荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察染色后细胞中的抗原。荧光 显微镜具有特殊的光学透镜和滤光片，可以选择和激发不同荧光染料的发光。根据需要，可以选择合适的滤光片来检测多个染色的细胞。 8.影像分析：通过图像处理软件对荧光显微镜下观察到的细胞图像进 行分析和量化。常见的分析内容包括抗原的位置、表达强度和相对数量等。 9.结果解读：根据荧光染色的结果来解读细胞中其中一抗原的表达情况。可以通过比较实验组和对照组的亮度或表达分子的定量来确定差异。 补充说明：
2.正、阴对照：在进行抗原染色前，应设置正、阴对照实验。正对照是指使用已知表达目标抗原的样本，而阴对照是指使用未表达目标抗原的样本。通过对照实验可以判断染色结果是否可靠。 3.染色条件优化：染色条件如温度、时间、抗体的浓度等都可能影响染色效果。因此，需要对染色条件进行优化，以确保得到准确的结果。 4.扩展检测：除了直接染色，还可以使用间接染色方法来增强信号。通过使用辅助抗体，可以将多个标记物同时进行检测，提供更多的信息。 总结起来，免疫荧光染色实验步骤是：细胞处理→固定→渗透化处理→预处理→抗原特异性溶液→清洗→荧光显微镜观察→影像分析→结果解读。这一技术可以应用于细胞生物学、免疫学、病理学等领域的研究和诊断中，对于研究细胞的结构和功能具有重要意义。
细胞免疫荧光染色步骤
细胞免疫荧光染色步骤 细胞免疫荧光染色是一种常用的实验技术，可以用于研究细胞的结构、功能以及相互作用。本文将介绍细胞免疫荧光染色的详细步骤。 1. 细胞培养和固定 需要将研究对象的细胞培养在培养皿中，提供适宜的生长条件。然后，用适当的缓冲液（如PBS）洗涤细胞，使其悬浮在缓冲液中。接下来，使用适当的固定剂（如甲醛或乙醛）固定细胞，以保持细胞的形态和结构。 2. 渗透化处理 为了使抗体能够进入细胞内部，需要对固定的细胞进行渗透化处理。常用的渗透化剂包括Triton X-100和Tween-20。将渗透化剂溶解在PBS中，并将其加入到固定的细胞中，使其渗透进入细胞内部。3. 阻断非特异性结合 为了避免非特异性抗体与细胞结构的非特异性结合，需要对细胞进行非特异性结合的阻断处理。常用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA）和小鼠或兔子的血清。将阻断剂溶解在PBS中，并将其加入到渗透化处理后的细胞中，进行阻断处理。 4. 一抗孵育 选择合适的一抗（即抗体），并将其加入到细胞中进行孵育。一抗可以是针对特定蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。一抗的选择应根据
研究的目的和所需的特异性来确定。孵育时间和温度可以根据实验的要求进行调整。 5. 清洗 孵育一抗后，需要对细胞进行充分的清洗，以去除未结合的一抗。使用PBS或其他合适的缓冲液进行多次洗涤，确保细胞表面没有残留的一抗。 6. 二抗孵育 选择合适的二抗，并将其加入到细胞中进行孵育。二抗是针对一抗的抗体，通常标记有荧光物质。二抗的选择应根据一抗的种类和宿主动物来确定。孵育时间和温度同样可以根据实验的要求进行调整。 7. 清洗和染色核酸 对细胞进行充分的清洗，去除未结合的二抗。然后，使用荧光染料（如DAPI）对细胞核酸进行染色，以便观察细胞的核结构。 8. 贴片和观察 将处理后的细胞贴在载玻片上，并加入适当的缓冲液。使用显微镜观察细胞，在合适的波长下激发荧光，观察细胞的荧光信号，并记录下观察到的结果。 细胞免疫荧光染色是一种常用的技术，通过标记特定的蛋白或分子在细胞中的分布和定位，可以研究细胞的结构和功能。通过以上的步骤，可以获得高质量的荧光染色结果，并对细胞进行深入的研究。
免疫荧光实验步骤
免疫荧光实验步骤 Revised as of 23 November 2020
免疫荧光实验步骤 1. 直接免疫荧光法测抗原 （1）基本原理 将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。 （2）试剂与仪器 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：L， 荧光标记的抗体溶液：以L，的PBS进行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ 碳酸盐缓冲液1份配制 搪瓷桶三只（内有L，的PBS 1500ml） 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫） 荧光显微镜 玻片架 滤纸 37℃温箱等。 （3）实验步骤 ① 滴加L，的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。 ② 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。
③ 取出玻片，置玻片架上，先用L，的PBS冲洗后，再按顺序过L，的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。 ④ 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。 ⑤ 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。 （4）注意事项 1)对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 2)染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。 3)为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。 ① 标本自发荧光对照：标本加1-2滴L，的PBS。 ② 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
免疫荧光染色方法
免疫荧光染色方法 〔一〕制片 选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。 〔二〕固定 除研究细胞外表抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的作用有三：①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。 标本的固定原则是：①不能损伤细胞的抗原；②不能凝集蛋白质； ③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。 常用抗原物质的固定方法
〔三〕水洗 固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。 〔四〕染色 染色分直接染色法与间接染色法。 1．材料与试剂 〔1〕荧光抗体，稀释至应用浓度。 〔2〕0.01Mol/L pH7.4PBS液 〔3〕9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。 〔4〕带盖方盘 2．直接染色法 〔1〕将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为
度，加盖，37℃感做30 min～45min。 〔2〕PBS冲洗3次，每次冲洗3min，即3×3ˊ冲洗。 〔3〕蒸馏水冲洗。 〔4〕滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。 2．间接染色法 〔1〕检查抗原：①取固定标本，加的免疫血清，37℃孵育30min； ②以PBS液3×3ˊ冲洗；③再加荧光标记的抗抗体，37℃孵育30min； ④PBS 3×3ˊ冲洗；⑤H2O冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。 〔2〕检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然枯燥，甲醇固定；②滴加相应抗原液〔按1﹕100～1﹕500稀释〕，37℃孵育30min； ③PBS液3×3ˊ冲洗；④加荧光抗体，37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ冲洗；⑥水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。 〔五〕结果显示 荧光显微镜所观察到的图象，主要以两个指标判断结果，一个是形态学特征；另一个是荧光的亮度，在结果的判定中，必须将二者结合起来，综合判定。 荧光强度的表示方法如下： ＋＋＋～＋＋＋＋：荧光闪亮，呈明显的亮绿色。 ＋＋：荧光明亮，呈黄绿色。 ＋：荧光较弱，但清楚可见。 ± ：极弱的可疑荧光。