免疫组织荧光染色法实验操作流程
MBP免疫荧光染色（石蜡切片）
冰冻切片（贴片）
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 （1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡 （2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min （4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。 （6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。 （8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温 30min。 （12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。 （15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 （18）使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 （1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min （2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min （3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min （5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （6）1%BSA室温封闭30min （7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 （10）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用 （12）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （13）用抗荧光淬灭剂封片 （14）荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一） （1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。
免疫荧光染色步骤
免疫组织化学染色步骤 1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20→二甲苯Ⅱ10）、入水（100%酒精Ⅰ5→100%酒精Ⅱ3→95%酒精2→80%酒精1→70%酒精1），蒸馏水冲洗后，0.01M 冲洗，5×3次； 2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15，自然冷却至室温，0.01M 冲洗，5×3次； 3．32O 2溶液，37℃，20 ，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M 冲洗，5×3次； 4．正常羊血清封闭，37℃，30 ； 5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M 冲洗，5×3次； 6．滴加二抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次； 7．滴加三抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次； 8．避光显色，显微镜下控制显色时间； 9．0.01M 终止显色； 10．梯度酒精脱水（70%酒精1→80%酒精1→95%酒精Ⅰ1→ 95%酒精Ⅱ1→无水酒精Ⅰ10→无水酒精Ⅱ10），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15→二甲苯Ⅱ10； 11．中性树胶封片。 免疫荧光染色步骤 (1)将组织切片脱蜡入水； (2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15，自然冷却至室温；
(3)正常羊血清封闭，37℃，60 ； (4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，冲洗，5×3次； (5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 ，0.01M 冲洗，5×3次； (6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。 (7)荧光显微镜观察拍照。 细胞免疫组化染色（培养板中染色） 1．培养的细胞，弃去培养基，冷的洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10，洗2次，每次5－10分钟。 2．在含0.1% 100（4孔板200μl）的中进行10的透膜处理，洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。 3．羊血清用配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。 4．吸尽液体，勿洗，添加一抗，于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，洗3次，每次5-10分钟。 5．去除一抗后，细胞用洗三次。 6．加入二抗，然后加入相对应的孔，在37℃下作用30-60。洗3次，每次5-10分钟。 7．吸尽液体，加入三抗，在室温条件下作用30-60。洗3次，每次5-10分钟。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗及三抗的细胞作为阴性对照组。
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤 1 直接免疫荧光法的操作步骤 标本的处理： 石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次； ?2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min ?抗体染色： C孵育30min；–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37 ?0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。 ?缓冲甘油封片 –分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。 ?镜检：在荧光显微镜下观察。 ?优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。 ?缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。 直接免疫荧光法的注意事项 ?对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度； ?一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 ?染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化； –染色时间：从10 min到数小时，一般30 min； C的低温，延长染色时间。C可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2C)，高于37–染色温度：多采用室温(25 C 30 min效果好的多。–低温染色过夜较37 ?试验时需设置下列对照： –自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。 –阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 –特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。 ?若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 ?一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象； ?经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。 2 间接法又称为荧光抗-抗体法 需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。 –可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。 间接免疫荧光法操作步骤 ?标本的处理及非特异染色的封闭同直接法； ?一抗染色： C过夜。C作用30min或4–加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释)，37 ?0.01M PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)； C湿盒避光作用30min。?加荧光标记的二抗抗体，37 ?0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)； ?甘油缓冲液封片 ?镜检
免疫荧光染色实验步骤
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。 zo-1的免疫荧光，步骤如下： 1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。 2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟 3、4%的甲醛室温固定20-30分钟 4、1×PBS洗3次，每次10分钟 5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟 6、1×PBS洗3次，每次10分钟 7、5%BSA室温封闭30分钟 8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜 9、1×PBS洗3次，每次10分钟 10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光!!! 11、1×PBS洗3次，每次10分钟 12、95%甘油封片 注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释 从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光 细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致： 1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。 注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。 2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。 3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。 5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。 6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。 7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。 8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。 建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。 细胞免疫荧光简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min*3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2*5min 6.羊血清封闭：37度，20分钟 7.一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度1-2小时 8.4度PBS洗净，3min*5次 9.二抗37度小于一小时 10.37度PBS洗净，3*5min 凉干封片(封闭液PH8.5) 不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下pH值，可以使用PBS多清洗几次，也可以延长PBS清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。
免疫荧光实验步骤
免疫荧光实验步骤 Revised as of 23 November 2020
免疫荧光实验步骤 1. 直接免疫荧光法测抗原 （1）基本原理 将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。 （2）试剂与仪器 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：L， 荧光标记的抗体溶液：以L，的PBS进行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ 碳酸盐缓冲液1份配制 搪瓷桶三只（内有L，的PBS 1500ml） 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫） 荧光显微镜 玻片架 滤纸 37℃温箱等。 （3）实验步骤 ① 滴加L，的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。 ② 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。
③ 取出玻片，置玻片架上，先用L，的PBS冲洗后，再按顺序过L，的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。 ④ 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。 ⑤ 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。 （4）注意事项 1)对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 2)染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。 3)为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。 ① 标本自发荧光对照：标本加1-2滴L，的PBS。 ② 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光实验步骤大全(精华版) 免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 1.将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1小时，脱蜡。 2.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 3.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。 4.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 注意：步骤3和4用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原可以直接跳过这一步骤。
5.进行抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3分钟，后转成低火15分钟。 6.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 7.在室温下，使用3% H2O2孵育30分钟，目的是灭活内源性过氧化物酶。 8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 9.使用1% BSA进行室温封闭30分钟，用于封闭非特异性抗原表位。 10.按照抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4℃湿盒中静置过夜。 11.次日取出切片，室温下复温30分钟。 12.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
13.选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37℃避光孵育30分钟。 14.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 15.在避光条件下，使用DAPI染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用。 16.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 17.在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 18.使用荧光显微镜进行观察和拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 1.在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3分钟。 2.使用4%多聚甲醛固定细胞爬片15分钟。
3.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 4.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。 5.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 6.使用1% BSA室温封闭30分钟。 7.弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜。 8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 9.细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗。 10.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
免疫荧光染色实验步骤
免疫荧光染色实验步骤 1.细胞处理：将需要进行染色的细胞培养于培养皿中，通常使用生理 盐水或PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤细胞，以去除培养基或其它细胞残留物。 2.固定：使用适当的固定剂，如甲醛或乙醛，固定住细胞。通常在室 温下固定细胞10-30分钟，然后用PBS洗涤。 3.渗透化处理：为了增强抗原与抗体的结合，需要使用渗透化剂如BSA（牛血清白蛋白）或胎牛血清等，封闭其它非特异结合位点。浓度通 常为1-5%的BSA，可以根据实验需要调整。 4.预处理：通过预处理，可以增强抗原的可见性。预处理方法包括煮沸、酶解或蛋白酶处理等。具体方法应根据需要选择。 5.抗原特异性溶液：将具有特异性的抗体溶液加入到含有细胞的培养 皿中，使其与抗原结合。抗体通常与标记物如荧光染料共价结合，使得标 记的抗原能够被荧光显微镜观察。 6.清洗：将细胞用PBS洗涤，以去除未与抗体结合的游离抗体。 7.荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察染色后细胞中的抗原。荧光 显微镜具有特殊的光学透镜和滤光片，可以选择和激发不同荧光染料的发光。根据需要，可以选择合适的滤光片来检测多个染色的细胞。 8.影像分析：通过图像处理软件对荧光显微镜下观察到的细胞图像进 行分析和量化。常见的分析内容包括抗原的位置、表达强度和相对数量等。 9.结果解读：根据荧光染色的结果来解读细胞中其中一抗原的表达情况。可以通过比较实验组和对照组的亮度或表达分子的定量来确定差异。 补充说明：
2.正、阴对照：在进行抗原染色前，应设置正、阴对照实验。正对照是指使用已知表达目标抗原的样本，而阴对照是指使用未表达目标抗原的样本。通过对照实验可以判断染色结果是否可靠。 3.染色条件优化：染色条件如温度、时间、抗体的浓度等都可能影响染色效果。因此，需要对染色条件进行优化，以确保得到准确的结果。 4.扩展检测：除了直接染色，还可以使用间接染色方法来增强信号。通过使用辅助抗体，可以将多个标记物同时进行检测，提供更多的信息。 总结起来，免疫荧光染色实验步骤是：细胞处理→固定→渗透化处理→预处理→抗原特异性溶液→清洗→荧光显微镜观察→影像分析→结果解读。这一技术可以应用于细胞生物学、免疫学、病理学等领域的研究和诊断中，对于研究细胞的结构和功能具有重要意义。
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤 切片免疫荧光染色是一种常用的生物学实验方法，用于研究组织或细 胞样本中的特定蛋白质标记。下面是一般的切片免疫荧光染色的具体步骤：步骤一：取样 步骤二：切片 将固定的组织样本或细胞样本进行切片处理。可以使用切片刀或者切 片机来获得薄片。切片的厚度往往是几微米到几百微米。切片完成后，可 以将其放在载玻片上。 步骤三：预处理 载玻片上的切片需要进行一些预处理步骤，以去除可能会影响后续染 色的物质，如脂质或其他杂质。预处理步骤可能会包括洗涤、脱水和透明 化等。 步骤四：抗原修复 细胞或组织样本中的抗原有时会受到固定过程的影响，使得抗原无法 与抗体结合。因此，需要进行抗原修复步骤来恢复抗原的免疫原性。抗原 修复可以通过热处理、酸碱处理或酶解等方式进行。 步骤五：阻断非特异结合物 为了减少非特异抗体的结合，需要使用一种阻断剂来防止非特异结合。典型的阻断剂包括牛血清蛋白、胎牛血清等。阻断剂可以在洗涤缓冲液中 加入。 步骤六：初级抗体染色
在预处理和阻断步骤之后，将含有特定初级抗体的溶液加到样本上，进行孵育。初级抗体是特异性结合到目标蛋白质的抗体。孵育时间和温度可以根据实验的需要来确定。 步骤七：洗涤 之后，用缓冲液洗涤样本，将未结合的抗体和杂质去除。洗涤是非常重要的步骤，可以通过多次洗涤来提高特异性和背景的对比度。 步骤八：二级抗体染色 二级抗体通常是带有荧光标记的抗体。与初级抗体相比，二级抗体对特定的初级抗体更具选择性，并且能够增强荧光染色的信号。将含有二级抗体的溶液加到样本上，进行孵育。 步骤九：洗涤 与前面的步骤类似，需要用缓冲液洗涤样本，去除未结合的二级抗体和杂质。 步骤十：荧光显微镜观察 片片染色完成后，放入荧光显微镜中观察。通过荧光显微镜，可以看到标记的荧光信号并进行图像记录和分析。 需要注意的是，切片免疫荧光染色步骤根据具体实验目的的不同可能会有所不同。此外，具体的步骤和实验条件可以根据实验室的需要进行优化和修改。
三种细胞免疫荧光染色操作步骤
三种细胞免疫荧光染色操作步骤 三种细胞免疫荧光染色操作步骤免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包 括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到 荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。 zo-1的免疫荧光，步骤如下: 1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。 2、用预温的 1×PBS洗3次，每次10分钟 3、4%的甲醛室温固定20-30分钟 4、1×PBS洗3次，每次10分钟 5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟 6、1×PBS洗3次，每次10分钟 7、5%BSA室温封闭30分钟 8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜 9、1×PBS洗3次，每次10分钟 10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光 11、1×PBS洗3次，每次10分钟 12、95%甘油封片 注:4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释 从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光 细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致:
1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。注意:有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。 洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。 2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。 3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。 4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。 5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。 6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。 7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。 8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。 建议:1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。 细胞免疫荧光简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min*3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2*5min
免疫组织荧光染色法实验操作流程
免疫组织荧光染色法实验操作流程 免疫组织荧光染色法是一种常用的实验技术，它可以用于检测和定量 免疫组织中特定蛋白质的表达水平。该实验流程包括抗原修复、抗体染色、荧光染色、显微观察和数据分析等步骤。以下是一个详细的免疫组织荧光 染色法实验的操作流程。 1.样本固定 收集待染色的组织样本（如细胞培养物或小鼠组织），用4%的多聚 甲醛溶液进行固定。固定时间约为12-24小时，固定后的组织样本封存在 低温下。 2.抗原修复 将固定的组织样本从低温中取出，用生理盐水洗涤去除多余的甲醛。 然后将组织样本放入含有石蜡的容器中，用石蜡浴进行抗原修复。修复的 时间和温度根据不同的抗原类型来确定。修复完成后，用石蜡液替换石蜡浴，以便后续处理。 3.抗体染色 用PBS（磷酸缓冲盐溶液）对组织进行洗涤，去除残留的石蜡。根据 实验需要，使用特定的一抗抗体来探测目标蛋白质。将一抗稀释到合适的 浓度，并加到组织上，让其充分渗透。孵育时间一般为1-2小时，温度为 室温。然后用PBS进行洗涤，以去除未结合的一抗。 4.二抗染色
选择与一抗抗体不同的二抗抗体，标记上荧光染料。将二抗稀释到合 适的浓度，并加到组织上，使其充分渗透。孵育时间一般为1-2小时，温 度为室温。然后用PBS进行洗涤，以去除未结合的二抗。 5.荧光染色 将用二抗标记的荧光染料加到组织上，孵育时间一般为1小时，温度 为室温。然后再次用PBS进行洗涤，以去除未结合的荧光染料。 6.组织切片和封片 将处理完的组织样本进行切片，切片厚度一般为5-10μm。将切片放 在载玻片上，加一两滴封片剂，用封片剂将切片封住，以保护组织样本。 7.显微观察 将载玻片放在荧光显微镜下观察。选择适当的波长和滤光片，以获取 目标荧光信号。 8.图像获取和数据分析 使用荧光显微镜或相机获取图像，并使用图像处理软件进行数据分析。可以量化目标蛋白质的表达量，例如计算荧光强度、细胞数量等。 总结： 免疫组织荧光染色法是一种常用的免疫学实验技术，可以用于研究组 织中特定蛋白质的表达和定量。实验流程包括样本固定、抗原修复、抗体 染色、二抗染色、荧光染色、显微观察和数据分析等步骤。该技术对实验 操作的精细度和技术要求较高，但可以提供准确和定量的结果。