免疫组织化学技术：染色步骤
免疫组织化学技术：染色步骤
免疫组织化学技术:染色步骤
一、免疫荧光法
１．直接法
（1）冰冻切片、涂片、印片或单层细胞培养物按要求进行固定，石蜡切片常规脱蜡后用酶消化处理，然后水化，用0.01mol/L PH7.2---7.4PBS洗5分钟，冷风吹干，放入湿盒中。
（2）滴加经稀释的荧光抗体，37℃ 30-60分钟或4℃过夜
（3）PBS 洗2次，蒸馏水洗1次
（4）50%甘油缓冲液封片
（5）荧光显微镜下检查
（6）对照染色
①阳性对照，用已经证实的含有靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阳性。②阴性对照，用确知不存在靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阴性。③空白对照，用免去特异性抗体或用PBS替代特异性抗体，结果应为阴性。④抑制试验，将标记抗体(例荧光抗体)和未标记的抗体或血清等量混合后，按上述步骤处理切片，结果应为阴性（一步法）。或将待检切片两张，一张加未标记特异性血清，另一张加未标记同种正常血清，孵育后冲洗，再加入标记的特异性血清（例如特异性荧光标记抗体），加了未标记特异性血清的切片因抗原抗休已结合，故染色被抑制，呈阴性结果，而加同种正常血清的切片则呈阳性反应（二步法）。
对照染色非常重要，开始试验时应做全面对照，每次试验时应做阳性和阴性对照。
2．间接法
（1）标本处理同直接法。
（2）滴加适当稀释的特异性抗体于标本上，置湿盒中，３７℃３０～６０分钟或４℃过夜。
（3）滴加适当稀释的间接荧光抗体，置湿盒中，３７℃３０～６０分钟。
（５）ＰＢＳ洗２次，双蒸水洗１次。
（６）甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察。
（７）对照染色：可用空白对照和阴性对照等。
３．补体法
（１）标本处理同直接法。
（２）滴加适当稀释的特异性抗体及补体的等量混合液，置湿盒中，３７℃３０分钟，ＰＢＳ洗３次。
（３）滴加适当稀释的抗补体荧光抗体，置理盒中，３７℃３０分钟。ＰＢＳ洗２次，蒸馏水洗１次。
（４）甘油缓冲液封片。
（５）对照染色，可作正常血清替代，灭活补体对照即经５６℃３０分钟灭活处理后，将灭活的补体与特异性抗体等量混合，进行染色，结果均应阴性。
４．双重色疫荧光法
在同一标本上有两种抗原需要直接显示时，可用不同的荧光素分别标记抗体进行染色。
一步法双染色：先将两种标记抗体按适当比例混合，按直接法步骤进行。
二步法双染色：先用一个标记抗体孵育，不必洗，再用另一个标记抗体孵育，按间接法步骤进行。
５．注意事项
（１）免疫荧光法最适宜进行冰冻切片的染色，因为此种切片一般抗原保存得较好。若是石蜡切片则应首先选用免疫酶法等染色技术。
（2）使用商品的荧光标记抗体，在进行染色前应作抗体效价的测定，找出合适的稀释度后再进行成批染色。一般而言，在阳性物质发出明亮荧光而背景又较暗时的稀释度是较为合适的。高稀释度的荧光抗体可以减少非特异性着色使染色结果更具特异性，但稀释度过高会
免疫组组织化学染色操作过程
1.接蒸馏水1L 2.PBST配置：PBS ：Tween20=1000：1 （PBS 2000mL-其中用1000mL配PBST） 3.30%的过氧化氢配成3%的过氧化氢(200ml） 4.配DAB 第二天配(1滴:1000ul) 5.一抗稀释（当天用当天配） 第一天 1．烤片：石蜡切片，烘烤箱内60度，3到5小时（目的使组织与玻片牢固结合）2．脱蜡：二甲苯(10min×3) 3．复水：无水乙醇5min×3，然后95%，75%，50%乙醇各5min。(目的是利用乙醇的双溶性，使得切片跟后续的水溶性实验体系相容） 4．自来水冲洗5min，蒸馏水浸泡5min 5．抗原修复：热修复（目的是将抗原表位暴露，使得后续的一抗可以结合上去）。 ①配置修复液：修复液主要有柠檬酸钠缓冲液（pH=6.0），EDTA（pH=8.0）和TE（pH=9.0）三种，其酸碱度不同，不同抗体的要求不同，要根据抗体和试剂的说明书来配； ②高压锅：半锅抗原修复液，蒸汽鸣笛开始算时间，进行3min，5mim，10min，15min进行摸索时间（如果是电热锅从沸腾开始算时间，修复时间要久一些）。煮完自然冷却。 6.洗涤：①蒸馏水5min，②PBST：3min × 2 ③ PBS：3min× 1 7.免疫组化笔画圈：切片置于湿润操作盒上。（若要破膜的话，移液枪滴0.3%Triton溶液于标本上45min） 8.淬灭（阻断）:（目的去除内源性过氧化物酶），30%过氧化氢加蒸馏水配成3%溶液，切片浸泡15min。 9.洗涤：①PBST：3min × 2 ② PBS：3min× 1 10.生物素阻断，依次滴A，B剂切片浸泡，各10min，依次洗涤：①PBST：5min × 2 ，②PBS：5min× 1 11．封闭（目的为了减少二抗与组织的非特异蛋白结合，需用二抗来源的血清进行封闭）。羊血清，移液枪。置于37℃温箱30min。封闭后不能洗！！甩干！！！12．孵育一抗：配抗体稀释液，涡旋。滴于切片上。4℃过夜。(＜16h!!!)
免疫组化染色操作步骤
免疫组织化学染色原理和操作步骤 一、免疫组织化学原理 免疫组织化学(IHC)又称免疫细胞化学,是根据抗原—抗体特异性结合的原理,应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法:直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分;间接法则先后加入一抗和二抗,形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的,该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶(PＡP)法、亲和素—生物素—过氧化物酶(ＡBC)法和链霉亲和素—过氧化物酶(ＳP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响,但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAＰ复合物（含３个酶分子和2个抗体分子),染色时依次加入一抗、二抗、ＰＡ Ｐ复合物孵育标本,最后用H ２Ｏ ２ 和二氨基联苯（DAB)为底物显示过氧 化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合４分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似,一抗不标记,二抗用生物素标记,染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上,最后加入DAＢ进行显色。AＢＣ法的敏感性较ＰAＰ法更高。
图１. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》） SP法与ABC法相似，其不同于ＡBＣ法之处在于用生 物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。在 标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化 物酶使其结合到二抗的生物素上,最后加入ＤAＢ进行显 色。与亲和素相比,链酶亲和素的结合力与亲和素相似而 非特异性结合较亲和素低。SＰ法简化了操作步骤，同时 也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免疫绥 化染色技术。 图2. SP法原理示意图二、实验准备： 1．标本准备 ①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理 ②冰冻组织切片:由病理室常规处理 ③细胞爬片:将无菌盖玻片置于六孔板中,接种细胞，待细胞生长达到6 ０％以上后取出玻片,4%多聚甲醛固定2 h。 2.试剂准备 ①抗体选择 单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后 将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位，可避免单克隆抗体
免疫组化染色操作顺序
精心整理免疫组织化学染色原理和操作步骤 一、免疫组织化学原理 免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。 图1.免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》） SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。SP法简化了操作步骤，同时也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免疫绥化染色技术。 二、实验准备： 1.标本准备 图2.SP法原理示意 ①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理 ②冰冻组织切片：由病理室常规处理
免疫组织化学技术：染色步骤
免疫组织化学技术：染色步骤 免疫组织化学技术:染色步骤 一、免疫荧光法 １．直接法 （1）冰冻切片、涂片、印片或单层细胞培养物按要求进行固定，石蜡切片常规脱蜡后用酶消化处理，然后水化，用0.01mol/L PH7.2---7.4PBS洗5分钟，冷风吹干，放入湿盒中。 （2）滴加经稀释的荧光抗体，37℃ 30-60分钟或4℃过夜 （3）PBS 洗2次，蒸馏水洗1次 （4）50%甘油缓冲液封片 （5）荧光显微镜下检查 （6）对照染色 ①阳性对照，用已经证实的含有靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阳性。②阴性对照，用确知不存在靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阴性。③空白对照，用免去特异性抗体或用PBS替代特异性抗体，结果应为阴性。④抑制试验，将标记抗体(例荧光抗体)和未标记的抗体或血清等量混合后，按上述步骤处理切片，结果应为阴性（一步法）。或将待检切片两张，一张加未标记特异性血清，另一张加未标记同种正常血清，孵育后冲洗，再加入标记的特异性血清（例如特异性荧光标记抗体），加了未标记特异性血清的切片因抗原抗休已结合，故染色被抑制，呈阴性结果，而加同种正常血清的切片则呈阳性反应（二步法）。 对照染色非常重要，开始试验时应做全面对照，每次试验时应做阳性和阴性对照。 2．间接法 （1）标本处理同直接法。 （2）滴加适当稀释的特异性抗体于标本上，置湿盒中，３７℃３０～６０分钟或４℃过夜。
（3）滴加适当稀释的间接荧光抗体，置湿盒中，３７℃３０～６０分钟。 （５）ＰＢＳ洗２次，双蒸水洗１次。 （６）甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察。 （７）对照染色：可用空白对照和阴性对照等。 ３．补体法 （１）标本处理同直接法。 （２）滴加适当稀释的特异性抗体及补体的等量混合液，置湿盒中，３７℃３０分钟，ＰＢＳ洗３次。 （３）滴加适当稀释的抗补体荧光抗体，置理盒中，３７℃３０分钟。ＰＢＳ洗２次，蒸馏水洗１次。 （４）甘油缓冲液封片。 （５）对照染色，可作正常血清替代，灭活补体对照即经５６℃３０分钟灭活处理后，将灭活的补体与特异性抗体等量混合，进行染色，结果均应阴性。 ４．双重色疫荧光法 在同一标本上有两种抗原需要直接显示时，可用不同的荧光素分别标记抗体进行染色。 一步法双染色：先将两种标记抗体按适当比例混合，按直接法步骤进行。 二步法双染色：先用一个标记抗体孵育，不必洗，再用另一个标记抗体孵育，按间接法步骤进行。 ５．注意事项 （１）免疫荧光法最适宜进行冰冻切片的染色，因为此种切片一般抗原保存得较好。若是石蜡切片则应首先选用免疫酶法等染色技术。 （2）使用商品的荧光标记抗体，在进行染色前应作抗体效价的测定，找出合适的稀释度后再进行成批染色。一般而言，在阳性物质发出明亮荧光而背景又较暗时的稀释度是较为合适的。高稀释度的荧光抗体可以减少非特异性着色使染色结果更具特异性，但稀释度过高会
免疫组化染色步骤
免疫组织化 [检验原理] 生物素标记的山羊抗小鼠/兔lgG与结合在组织片上的一抗反应形成免疫复合物，辣根酶标记链霉卵白素与生物素免疫复合物结合进一步形成聚合物，聚合物上的HR催化底物过氧化氢与DAB (或AEC) 反应，最终形成棕褐色(或红色)不溶性色原，从而在显微镜下显示出组织片中的特定杭原的位点。 [试剂] 1:内源性过氧化物酶阻断剂试剂 2:封闭用正常山羊血清工作液试剂 3:生物素标记山羊抗小鼠兔lgG试剂 4:辣根酶标记链霉卵白素工作液 [储存条件及有效期] 2~ 8C避光保存，不得冻存:产品有效期为12个月。 使用时即拿即放，使用后应立即放回冰箱，开封后试剂有效期6个月。 [样本要求] 1、标本类型:活检或手术切除标本。 2、标本固定:所有组织标本离体后(1小时内)尽快采用10%中性缓冲福尔马林固定，固定液与所浸泡组织的比例应足够。固定时间以8~72小时为宜。 3、组织切片:未染色的切片置于室温不宜超过6周，以防抗原丢失。切片厚度3~ 5μm 黏附在防脱玻片上，56~ 60摄氏度烤片2小时。 [检验方法] 1、检验所需仪器、设备:移液器、恒温箱、修复仪、免疫组化笔、计时器、孵育盒、染色架、盖玻片、光学显微镜、洗瓶。 2、试剂准备:显色液需要在使用前配制。 3、操作程序: a) 脱蜡和水化 石蜡切片置于新鲜二甲萃中，浸泡10分钟x3次:去除多余的液体后，置于无水乙醇中，浸泡3分钟x3次:去除多余的液体后，置于95%乙醇中,浸泡3分钟x2次:去除多余的液体后，置于75%乙醉中，浸泡3分钟x2次:蒸馏水冲洗1分钟，蹕于PBS缓冲液中。 b) 抗原修复，参见抗说明书。 c 阻断内源性过氧化物酶加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10分钟: PBS 缓冲液冲洗3分钟心3次。 d)滴加封闭用正常山羊血清工作液 滴加100uL或适量的封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育10-15分钟，倾去血清，勿洗。 e)滴加一抗 根据组织大小，滴加100pL或适量的抗，37*C孵育60分钟: PBS 缓冲液冲洗3分钟x3次
免疫组织化学常用染色方法和实验步骤
免疫组织化学常用染色方法和实验步骤 一、酶免疫组织化学 （一）间接酶免法 1.原理 染色时使用了两种抗体：第一抗体为针对靶抗原的特异性抗体，第二抗体是标记的针对第一抗体的抗体。将第一抗体滴加到标本上，与靶抗原结合。尔后滴加标记的第二抗体，与第一抗体结合，经显色定位出抗原存在的部位。第二抗体应来自于与第一抗体不同种的动物。此法敏感性高、信号强，标记一种二抗可检测多种抗原。但此法有可能出现非特异性背景着色。 2.操作步骤 （1）石蜡切片脱蜡至水，PBS洗3min×3次。 （2）封闭内源性过氧化物酶。PBS洗后，抗原修复。 （3）PBS再洗，若用DAB作底物，可以滴加50μl（一滴）1∶10稀释的非免疫性动物血清以减少非特异性背景染色，置湿盒10分钟后，直接接下一步，切忌冲洗，仅需要倾去多余的血清。 （4）滴加50μl第一抗体，置湿盒内1小时或4℃过夜。 （5）PBS洗，滴加稀释的酶标记的第二抗体，置湿盒内1小时。 （6）PBS洗，滴加新鲜配制的DAB溶液100μl，在显微镜下掌
握染色程度，约3～10分钟。 （7）自来水冲洗切片，苏木素复染2分钟。脱水、透明、封固。 （二）多聚螯合物酶法（EPOS法） 1.原理 EPOS（enhanc ed polymer one-step stainning）法是采用一种具有惰性的多聚化合物（葡聚糖）为骨架，将特异性抗体和HRP结合在一起，形成HRP-多聚化合物-特异性抗体巨大复合物，该复合物内不含第二抗体及亲和素。染色时，只需在组织切片上加入相应的酶标记特异性抗体EPOS试剂，孵育30～60分钟即可完成。无需再加酶标记第二抗体。EPOS法只需1次孵育，是目前最简便的方法，不足之处是现有商品化的酶标记特异性抗体的品种不全，此外，试剂价格昂贵。 2.操作步骤 （1）石蜡切片脱蜡至水，PBS洗3min×3次。 （2）蛋白酶消化或抗原修复（AR），PBS洗3min×3次。 （3）0.3%过氧化氢（H2O2）处理5分钟。 （4）蒸馏水洗，置于PBS中洗5分钟。 （5）加入相应的EPOS/HRP试剂，室温孵育30～60分钟。 （6）PBS洗3min×3次。
免疫组织化学染色步骤
免疫组织化学染色步骤 免疫组织化学染色（IHC）是一种用于检测组织切片中特定蛋白质的方法。该技术广泛应用于医学研究和临床诊断中，可以帮助医生确定肿瘤类型、评估疾病进展和预测患者预后。本文将介绍IHC的步骤和其原理。 IHC步骤： 1. 取得组织样本：将需要检测的组织切片取出，并进行脱水、脱脂和固定处理。 2. 制备切片：将处理后的组织样本切成薄片，并将其放置在载玻片上。 3. 抗体染色：将需要检测的抗体与组织样本接触，使其结合。 4. 洗涤：将切片在洗涤缓冲液中清洗，去除未结合的抗体。 5. 二抗染色：将特异性二抗与已结合的第一抗体结合。 6. 洗涤：将切片在洗涤缓冲液中清洗，去除未结合的二抗。 7. 标记染色：将标记物与已结合的二抗结合，例如使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等。 8. 洗涤：将切片在洗涤缓冲液中清洗，去除未结合的标记物。
9. 显色：加入染色剂使标记物呈现颜色。 10. 封片：将切片加入封片剂中，封闭切片，并进行显微镜检查。 IHC原理： IHC的原理基于抗体-抗原结合反应。当抗体与特定蛋白质结合时，可以使用二抗与已结合的第一抗体结合，二抗带有标记物，可以让我们对这些特定蛋白质进行检测。标记物常用的有HRP、AP等，它们可以被染色剂显色使得特定蛋白质呈现颜色。 需要注意的是，IHC检测的结果受到多种因素的影响，如抗体的质量、染色剂的选择等。因此，在进行IHC检测时需要进行严格的质量控制，确保结果的准确性和可靠性。 总结： 免疫组织化学染色是一种广泛应用于医学研究和临床诊断中的技术。通过对组织切片进行抗体染色和标记物显色，可以检测特定蛋白质的存在和表达情况。IHC步骤包括取得组织样本、制备切片、抗体染色、洗涤、二抗染色、标记染色、洗涤、显色和封片。IHC的原理基于抗体-抗原结合反应，检测结果受到多种因素的影响，需要进行严格的质量控制。
免疫组织学化学染色步骤
免疫组织学化学染色步骤 免疫组织学是一种研究生物体内免疫系统的组织学方法，它通过对组织切片进行染色和显微镜观察，来研究免疫系统的结构和功能。其中，化学染色是免疫组织学中最常用的染色方法之一，它可以用来检测特定的蛋白质、抗原或细胞类型。本文将介绍免疫组织学化学染色的步骤。 第一步：取样 在进行免疫组织学化学染色之前，需要先取得组织样本。组织样本可以来自于人体、动物或植物，通常是通过活检或解剖获取。在取样时，需要注意避免组织的损伤和污染，以保证后续的实验结果准确可靠。 第二步：固定 取得组织样本后，需要将其进行固定处理。固定的目的是使组织细胞的结构和形态得以保持，同时防止细胞的腐败和变性。常用的固定剂包括福尔马林、乙醛、甲醛等。固定时间和温度的选择要根据不同的组织类型和固定剂来确定。 第三步：切片 固定后的组织样本需要进行切片处理。切片可以使用手工切片或自动切片机进行。切片的厚度通常为3-5微米，切片的质量对后续
的染色和观察结果有很大的影响，因此需要注意切片的均匀和薄度。第四步：脱脂 切片后的组织样本需要进行脱脂处理。脱脂的目的是去除切片中的脂肪和油脂，以便后续的染色剂能够更好地渗透到组织细胞中。脱脂可以使用醇、醚等有机溶剂进行。 第五步：抗原修复 抗原修复是免疫组织学化学染色中非常重要的一步。抗原修复的目的是使组织中的抗原能够更好地暴露在染色剂的作用下，从而提高染色的灵敏度和特异性。抗原修复可以使用高压加热、酶解、酸解等方法进行。 第六步：阻断 阻断是为了避免非特异性结合和背景噪音的产生。阻断可以使用牛血清蛋白、鱼胶蛋白、BSA等蛋白质进行。阻断的时间和浓度需要根据实验的具体情况来确定。 第七步：一抗处理 一抗处理是免疫组织学化学染色中最关键的一步。一抗是指针对特定抗原的抗体，它可以与抗原结合形成免疫复合物。一抗的选择需要根据实验的目的和抗原的特性来确定。一抗处理的时间和浓度
常用免疫组织化学染色方法-步骤
常用免疫组织化学染色方法 ( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行) 1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。 2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。 3.无水酒精Ⅰ30秒。 4.无水酒精Ⅱ30秒。 5.95%酒精Ⅰ30秒。 6.95%酒精Ⅱ30秒。 7.90%酒精30秒。 8.80%酒精30秒。 9.70%酒精30秒。 10.自来水洗。(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10) 11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。 12.水洗。 13.抗原修复。 14.PBS洗3次，1分钟/次。 15.加入血清孵育20分钟。 16.摔干血清，加入一抗60分钟。 17.PBS洗3次，2分钟/次。 18加入二抗孵育30分钟。 19.PBS洗3次，2分钟/次。 20.加入ABC复合物，孵育30分钟。 21.PBS洗3次，2分钟/次。 22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。 23.PBS洗，水洗。 24.Harris苏木素染核5-10分钟。 25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。 (二)、LSAB法。(SP法)(Labelled streptavidim biotln) 1.切片脱蜡至水。 2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。 3.水洗。 4.抗原修复。 5.PBS洗3次，1分钟/次。 6.加入血清孵育10分钟。 7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。 8.PBS洗3次，每次2分钟。加入二抗，孵育20分钟。 9.PBS洗3次，每次2分钟。 10.加入SP复合物孵育20-30分钟。 11.PBS洗3次，每次2分钟。 12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。 13.PBS洗，水洗。 14.Harris苏木素染核5-10分钟。 15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
免疫组化染色操作步骤
免疫组化染色操作步骤 编辑整理： 尊敬的读者朋友们： 这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（免疫组化染色操作步骤）的内容能够给您的工作和学习带来便利。同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。 本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为免疫组化染色操作步骤的全部内容。
免疫组织化学染色原理和操作步骤 一、免疫组织化学原理 免疫组织化学(IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针,检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法:直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分;间接法则先后加入一抗和二抗,形成抗原-一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP)法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC)法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP)法. PAP法一抗和二抗均不标记,避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子)，染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本,最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶,即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素,ABC法即在此基础上建立.ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。
免疫组化染色操作步骤
免疫组化染色操作步骤 免疫组织化学染色原理和操作步骤 、免疫组织化学原理 免疫组织化学（IHC ）又称免疫细胞化学，是根据抗原一抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法: 直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原一一抗一二抗复合体以达到检测该抗原的目 的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶一抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素一生物素一过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素一过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响， 但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合 物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP 复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB ）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前 按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合 物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗
后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。
图1.免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》 ） SP 法与ABC 法相似，其不同于ABC 法之处在于用 生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。 在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧 化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入 DAB 行显色。与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素 相似而非特异性结合较亲和素低。 SP 法简化了操作步 骤，同时也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛 图2. SP 法 、实验准备: 1. 标本准备 ① 石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理 ② 冰冻组织切片：由病理室常规处理 60%以上后取出玻片，4%多聚甲醛固定2 h 。 2. 试剂准备 ①抗体选择 单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后 将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位， 可避免单克隆抗体 的免疫绥化染色技术。 ③细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中，接种细胞, 待细胞生长达到 X A.idLl frldirrt'l iwthod iwlhorl 二^ j5t 怵 Afliihndy (I! FA 瞅 PAP ■ J 0)1 A