组织免疫荧光应该这么做？
组织免疫荧光应该这么做？
圣诞节的时候写东西是一种考验啊。最近三周补了两个实验，都是和图像处理相关的。幸好，结果都还不错。所以要感谢谭老师的鼎力相助。有一个实验做了三次，
•第一次因为细胞背景太脏了，后期荧光太强了，重做。
•第二次因为聚焦的时候是以细胞为主，结果细菌没有照清楚，重做。
•第三次的时候，以为做imaging的那个机器和激光共聚焦的机器一样，可以调整图片，结果后期处理不好。
第三次本来要重做的，但是deadline太近了，就取了第一次的结果，截取了单个细胞做的，结果还不错。另外一个实验，也是比较曲折的。第一次铺细胞的时候，用了一瓶很久之前的PBS，结果细胞污染了，所以东西需要现灭现用。第二次因为没有了做confocal的dish，在深夜十一点到处借，所以要感谢两个小师妹的雪中送炭，最后终于搞定。第二天又临时找了谭老师帮我拍照片，做三维重建，总之小插曲很多，但所幸最后还是做成了，结果也还不错。
我这个人向来运气还比较好，这次虽然惊险通关，但是以后还需要更好的准备。
下面给大家看看我的三维重建的图片。因为在word文档中，放不了动画，所以大家将就看看图片吧。
三维重建
这周要开始分享组织的免疫荧光方法了，说实话我的内心是非常怵的，因为没有做过几次。我希望可以把我有限的知识放在这里，抛砖引玉，引起大家的讨论，然后有更好的解决办法。
组织的免疫荧光之所以难做，是因为组织会有自发荧光，会干扰我们的实验，尤其想在组织上做磷酸化的免疫荧光那更是难上加难。这次主要讲组织的免疫荧光。
做组织的免疫荧光我做过的和知道的有两种方法，一种是选用冰冻切片的组织，一种是选用石蜡包埋的组织。两种方法各有优缺点。
所以，石蜡切片的片子需要做抗原修复，需要在柠檬酸盐缓冲液中煮30 min，这样更有效的去除醛类固定试剂导致的蛋白之间的交联，
充分暴露石蜡切片样品中的抗原表位，从而大大改善免疫荧光染色。
在正式做荧光之前，片子的准备程序如下。（蓝色为石蜡切片，紫色为冰冻切片）
石蜡切片
•1.4%多聚甲醛4℃固定过夜；
•2.1xPBS洗一次，30min；
•3.30%乙醇1小时,摇床上慢摇，下同；
•4.50%乙醇1小时；
•5.70%乙醇1小时；
•6.85%乙醇1小时；
•7.95%乙醇1小时；
•8.正丁醇1小时（打开65℃温箱溶蜡）；
•9.石蜡65℃中处理3小时，每隔1小时换石蜡一次，包埋。
•10.切片
冰冻切片
•1.4%多聚甲醛冰上固定2小时；
•2.1xPBS洗一次，5min；
•3.30%蔗糖沉降2小时；
•4.OCT包埋。
组织和细胞一样有些常用的固定液。根据Bencroft的分类法，可分为四类：
•Ⅰ类：醛类，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。
•Ⅱ类：氧化剂类，四氧化锇（奥酸），高锰酸钾，重铬酸钾等。
•Ⅲ类：蛋白变性类，甲醇，乙醇，醋酸等。
•Ⅳ类：其他，氯化汞，苦味酸等。
•最常使用的是甲醛和多聚甲醛，其余的也在其它病理技术方面中用到，做比如电镜的固定剂一般用2.5%戊二醛固定。
而对于常用的甲醛及多聚甲醛固定液，各个的优缺点还是有些不一样的。
•10%甲醛：对组织渗透性强，固定均匀。对组织收缩少。对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。但经酒精脱水时有较大的收缩。能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，长期用其固定的组织使组织变为酸性，不利于染色，特别是细胞核的着色。经自来水冲洗6~24小时后，可以使其酸碱中和，并减少结晶。
•4%多聚甲醛：对组织穿透性好，组织收缩小，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好。固定的时间不宜太长，以24小时以内为宜，适用于免疫组织化学染色。
•我自己做的比较多的是石蜡切片的。先给大家看看我们课题组做的石蜡切片的肺组织免疫荧光。
下面是石蜡切片的免疫荧光步骤
（左边为切片机，右边为漂片机）
•1.先检查切片机各部位是否已固定，刀片是否锋利（最好用新的刀片）
•2.切片时要注意速度，太快易出现褶皱，这里可以先将样品置于冰上冷却哈；
•3.切片时发现纵向刀痕时要停止切片，清除刀片上的那些碎屑；
•4.展片水温控制在42℃左右，过高蜡片弥散，过低蜡片不能展
开；
•5.新换的水需要先将水加热到42度才能放入切片，否则水温上升后易出现微小气泡，影响贴片；
•6.展片槽水位应较高，防止玻片触底带起气泡，贴附于蜡片下影响贴片；
•7.展片时间要适中，过短则蜡片不能完全展开，过长则蜡片弥散，不利于贴片；
•8.可用普通载玻片展片；
•9.切片样品置于切片盒中敞开晾干后室温保存一段时间，我最长是两个月。建议长期保存还是放入蜡块中。
•因为最近没有做相关的实验，所以没有拍图片，下次做的时候补上。
•10.抗原修复：将切片置于0.1mol/L且Ph=6的枸橼酸液修复液中，微波炉中火加热6分钟至微微沸腾，再用中低火力维持10分钟，停止加热后自然冷却20-30分钟（直接煮沸6分钟×4次）。
•11.PBS浸洗2分钟X2次后，加0.2%tritonX-100透膜15分钟（如果你切片比较薄的话，也可不透膜，反正细胞已经被切开）。但如果是做细胞膜表面的蛋白，那就不要透膜了。
•12.PBS 2分钟清洗2次。
•13.用滤纸擦去标本外的PBS，滴加封闭血清（最好选用二抗同来源的血清，二抗一般来自山羊，所以可以选用山羊血清。）在湿盒中室温封闭1h。
•14.用滤纸擦去封闭液，PBS清洗两次。
•15.滴加适宜浓度的一抗置湿盒中4℃孵育过夜。
•16.滤纸吸去一抗，或者回收一抗。
•17.PBS 3分钟×5次，用滤纸擦去标本外的PBS。
•18.滴加荧光二抗室温置湿盒中避光孵育1小时，此时可在荧光显微镜下迅速观察是否染上，以确定终止时间。
•19.用PBS 3分钟×3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS。
•20.滴加 DAPI避光孵育15分钟。
•21.用PBS 5分钟×2次，用滤纸擦去标本外的PBS。
•22.用含抗荧光淬灭剂的封片，37度烘干保存。
冰冻切片
冰冻切片机
注意事项：
•1.样品提前两小时从液氮中放在-20℃平衡样品温度；
•2.冰冻包埋OCT液于室温呈液态，-15℃以下呈固态，如不马上切片，保存于-80度冰箱待用；
•3.载玻片应置于室温，若长时间置于-20℃则组织将不能贴附;
•4.切片：切片厚度40um，切片直接放在室温的PBS中，OCT会自动溶解于PBS中；
•5.封闭过氧化物酶体：3%H2O2，（1mL 30%H2O2 +9ml 甲醇）；
•6.PBS 5分钟X3次；
•7.高温抗原修复：95度水浴，柠檬酸盐（PH=6.0）修复液，6min。结束后放置20-30min使温度降低；（此步骤可选用，有相熟的同学做的时候用了这一步，结果也挺好的）；
•8.PBS 5分钟X3次；
•9.透膜，0.2%Triton 室温20 分钟；
•10.封闭：10%山羊血清，1h；
•11.一抗孵育4度过夜；
•12.PBS 5分钟X3次；
•13.孵育二抗，室温1h；
•14.PBS 5分钟X3次；
•15.滴加 DAPI避光孵育15分钟。
•16.用PBS 5分钟×2次，用滤纸擦去标本外的PBS。
•17.用含抗荧光淬灭剂的封片，37度烘干保存。
今天就讲到这里了，谢谢大家。
石蜡切片免疫荧光实验步骤
石蜡切片免疫荧光实验步骤 1、脱蜡至水：将组织切片室温放置10min后，依次将石蜡切片放 入二甲苯3min→无水乙醇5min—85%酒精5min—75%酒精5min—ddH2O洗5min。 2、抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复液（50X稀释至 1X使用)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（中火8min—停火8min—中低火7min）。此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min（具体修复液和修复条件根据组织来确定）。 3、画阻水圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，防止液体 流失。 4、BSA封闭：在圈内滴加3%-5%浓度BSA孵育30min（或二抗 同源血清封闭）。 5、一抗孵育：轻轻甩干封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的 一抗（溶于血清：PBS=1:19的抗体稀释液体系中），切片平放于湿盒（内加少量水防止抗体蒸发），4°C过夜。 6、二抗孵育：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每 次5min。切片稍甩干后在圈内滴加相应的荧光二抗，覆盖组织，避光RT孵育50min。 7、DAPI染核：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每 次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光RT孵育3-5min。 8、树脂封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每 次5min。切片稍甩干后用树脂封片剂封片（其间可滴加少量抗荧光淬灭剂）。 9、镜检拍照：切片于荧光显微镜/confocal/活细胞工作站中观察并 采集图像（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光； CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发橙光；CY5发红光）。 10、结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳 性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光，图片处理需使用Image J 软件。
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 （1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡 （2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min （4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。 （6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。 （8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温 30min。 （12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。 （15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 （18）使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 （1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min （2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min （3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min （5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （6）1%BSA室温封闭30min （7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 （10）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用 （12）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （13）用抗荧光淬灭剂封片 （14）荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一） （1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。
免疫荧光染色方法
免疫荧光染色方法 〔一〕制片 选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。 〔二〕固定 除研究细胞外表抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的作用有三：①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。 标本的固定原那么是：①不能损伤细胞的抗原；②不能凝集蛋白质； ③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。 常用抗原物质的固定方法
〔三〕水洗 固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。 〔四〕染色 染色分直接染色法与间接染色法。 1．材料与试剂 〔1〕荧光抗体，稀释至应用浓度。 〔2〕0.01Mol/L pH7.4PBS液 〔3〕9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。 〔4〕带盖方盘 2．直接染色法 〔1〕将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为
度，加盖，37℃感做30 min～45min。 〔2〕PBS冲洗3次，每次冲洗3min，即3×3ˊ冲洗。 〔3〕蒸馏水冲洗。 〔4〕滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。 2．间接染色法 〔1〕检查抗原：①取固定标本，加的免疫血清，37℃孵育30min； ②以PBS液3×3ˊ冲洗；③再加荧光标记的抗抗体，37℃孵育30min； ④PBS 3×3ˊ冲洗；⑤H2O冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。 〔2〕检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然枯燥，甲醇固定；②滴加相应抗原液〔按1﹕100～1﹕500稀释〕，37℃孵育30min； ③PBS液3×3ˊ冲洗；④加荧光抗体，37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ冲洗；⑥水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。 〔五〕结果显示 荧光显微镜所观察到的图象，主要以两个指标判断结果，一个是形态学特征；另一个是荧光的亮度，在结果的判定中，必须将二者结合起来，综合判定。 荧光强度的表示方法如下： ＋＋＋～＋＋＋＋：荧光闪亮，呈明显的亮绿色。 ＋＋：荧光明亮，呈黄绿色。 ＋：荧光较弱，但清楚可见。 ± ：极弱的可疑荧光。
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤 1 直接免疫荧光法的操作步骤 标本的处理： 石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次； ?2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min ?抗体染色： C孵育30min；–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37 ?0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。 ?缓冲甘油封片 –分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。 ?镜检：在荧光显微镜下观察。 ?优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。 ?缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。 直接免疫荧光法的注意事项 ?对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度； ?一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 ?染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化； –染色时间：从10 min到数小时，一般30 min； C的低温，延长染色时间。C可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2C)，高于37–染色温度：多采用室温(25 C 30 min效果好的多。–低温染色过夜较37 ?试验时需设置下列对照： –自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。 –阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 –特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。 ?若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 ?一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象； ?经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。 2 间接法又称为荧光抗-抗体法 需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。 –可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。 间接免疫荧光法操作步骤 ?标本的处理及非特异染色的封闭同直接法； ?一抗染色： C过夜。C作用30min或4–加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释)，37 ?0.01M PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)； C湿盒避光作用30min。?加荧光标记的二抗抗体，37 ?0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)； ?甘油缓冲液封片 ?镜检
组织免疫荧光应该这么做？
组织免疫荧光应该这么做？ 圣诞节的时候写东西是一种考验啊。最近三周补了两个实验，都是和图像处理相关的。幸好，结果都还不错。所以要感谢谭老师的鼎力相助。有一个实验做了三次， •第一次因为细胞背景太脏了，后期荧光太强了，重做。 •第二次因为聚焦的时候是以细胞为主，结果细菌没有照清楚，重做。 •第三次的时候，以为做imaging的那个机器和激光共聚焦的机器一样，可以调整图片，结果后期处理不好。 第三次本来要重做的，但是deadline太近了，就取了第一次的结果，截取了单个细胞做的，结果还不错。另外一个实验，也是比较曲折的。第一次铺细胞的时候，用了一瓶很久之前的PBS，结果细胞污染了，所以东西需要现灭现用。第二次因为没有了做confocal的dish，在深夜十一点到处借，所以要感谢两个小师妹的雪中送炭，最后终于搞定。第二天又临时找了谭老师帮我拍照片，做三维重建，总之小插曲很多，但所幸最后还是做成了，结果也还不错。 我这个人向来运气还比较好，这次虽然惊险通关，但是以后还需要更好的准备。 下面给大家看看我的三维重建的图片。因为在word文档中，放不了动画，所以大家将就看看图片吧。
三维重建 这周要开始分享组织的免疫荧光方法了，说实话我的内心是非常怵的，因为没有做过几次。我希望可以把我有限的知识放在这里，抛砖引玉，引起大家的讨论，然后有更好的解决办法。 组织的免疫荧光之所以难做，是因为组织会有自发荧光，会干扰我们的实验，尤其想在组织上做磷酸化的免疫荧光那更是难上加难。这次主要讲组织的免疫荧光。 做组织的免疫荧光我做过的和知道的有两种方法，一种是选用冰冻切片的组织，一种是选用石蜡包埋的组织。两种方法各有优缺点。 所以，石蜡切片的片子需要做抗原修复，需要在柠檬酸盐缓冲液中煮30 min，这样更有效的去除醛类固定试剂导致的蛋白之间的交联，
免疫荧光染色步骤
免疫组织化学染色步骤 1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ10min）、入水（100%酒精Ⅰ5min→100%酒精Ⅱ3min→95%酒精2min→80%酒精1min→70%酒精1min），蒸馏水冲洗后，0.01M PBS冲洗，5min×3次； 2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15min，自然冷却至室温，0.01M PBS冲洗，5min×3次； 3．3%H2O2溶液，37℃，20 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M PBS 冲洗，5min×3次； 4．正常羊血清封闭，37℃，30 min； 5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M PBS冲洗，5min×3次； 6．滴加二抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次； 7．滴加三抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次； 8．DAB避光显色，显微镜下控制显色时间； 9．0.01M PBS终止显色； 10．梯度酒精脱水（70%酒精1min→80%酒精1min→95%酒精Ⅰ1min→95%酒精Ⅱ1min→无水酒精Ⅰ10min→无水酒精Ⅱ10min），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15min →二甲苯Ⅱ10min； 11．中性树胶封片。 免疫荧光染色步骤 (1)将组织切片脱蜡入水； (2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15min，自然冷却至室温； (3)正常羊血清封闭，37℃，60 min； (4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，PBS冲洗，5min×3次； (5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次； (6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。 (7)荧光显微镜观察拍照。
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光实验步骤大全(精华版) 免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 1.将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1小时，脱蜡。 2.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 3.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。 4.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 注意：步骤3和4用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原可以直接跳过这一步骤。
5.进行抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3分钟，后转成低火15分钟。 6.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 7.在室温下，使用3% H2O2孵育30分钟，目的是灭活内源性过氧化物酶。 8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 9.使用1% BSA进行室温封闭30分钟，用于封闭非特异性抗原表位。 10.按照抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4℃湿盒中静置过夜。 11.次日取出切片，室温下复温30分钟。 12.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
13.选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37℃避光孵育30分钟。 14.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 15.在避光条件下，使用DAPI染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用。 16.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 17.在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 18.使用荧光显微镜进行观察和拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 1.在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3分钟。 2.使用4%多聚甲醛固定细胞爬片15分钟。
3.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 4.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。 5.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 6.使用1% BSA室温封闭30分钟。 7.弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜。 8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。 9.细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗。 10.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤 切片免疫荧光染色是一种常用的生物学实验方法，用于研究组织或细 胞样本中的特定蛋白质标记。下面是一般的切片免疫荧光染色的具体步骤：步骤一：取样 步骤二：切片 将固定的组织样本或细胞样本进行切片处理。可以使用切片刀或者切 片机来获得薄片。切片的厚度往往是几微米到几百微米。切片完成后，可 以将其放在载玻片上。 步骤三：预处理 载玻片上的切片需要进行一些预处理步骤，以去除可能会影响后续染 色的物质，如脂质或其他杂质。预处理步骤可能会包括洗涤、脱水和透明 化等。 步骤四：抗原修复 细胞或组织样本中的抗原有时会受到固定过程的影响，使得抗原无法 与抗体结合。因此，需要进行抗原修复步骤来恢复抗原的免疫原性。抗原 修复可以通过热处理、酸碱处理或酶解等方式进行。 步骤五：阻断非特异结合物 为了减少非特异抗体的结合，需要使用一种阻断剂来防止非特异结合。典型的阻断剂包括牛血清蛋白、胎牛血清等。阻断剂可以在洗涤缓冲液中 加入。 步骤六：初级抗体染色
在预处理和阻断步骤之后，将含有特定初级抗体的溶液加到样本上，进行孵育。初级抗体是特异性结合到目标蛋白质的抗体。孵育时间和温度可以根据实验的需要来确定。 步骤七：洗涤 之后，用缓冲液洗涤样本，将未结合的抗体和杂质去除。洗涤是非常重要的步骤，可以通过多次洗涤来提高特异性和背景的对比度。 步骤八：二级抗体染色 二级抗体通常是带有荧光标记的抗体。与初级抗体相比，二级抗体对特定的初级抗体更具选择性，并且能够增强荧光染色的信号。将含有二级抗体的溶液加到样本上，进行孵育。 步骤九：洗涤 与前面的步骤类似，需要用缓冲液洗涤样本，去除未结合的二级抗体和杂质。 步骤十：荧光显微镜观察 片片染色完成后，放入荧光显微镜中观察。通过荧光显微镜，可以看到标记的荧光信号并进行图像记录和分析。 需要注意的是，切片免疫荧光染色步骤根据具体实验目的的不同可能会有所不同。此外，具体的步骤和实验条件可以根据实验室的需要进行优化和修改。
免疫组织荧光步骤
免疫组织荧光步骤 免疫组织荧光是一种常用的实验技术，用于检测和定位特定抗原在细胞或组织中的分布情况。该技术利用荧光标记的抗体与目标抗原结合，通过荧光显微镜观察荧光信号的强度和位置，从而获得关于抗原分布的信息。下面将介绍免疫组织荧光的步骤。 第一步：固定和切片 在进行免疫组织荧光实验之前，首先需要将待检测的组织固定并制备成切片。固定可以保持组织结构的完整性，并固定其中的蛋白质，以便后续的抗体结合。切片是将组织切割成非常薄的片段，以便于抗体的渗透和荧光信号的观察。 第二步：抗原解表 为了提高抗体的结合效率和信号强度，需要对组织切片进行抗原解表处理。抗原解表通过一系列化学或物理方法，使组织中的蛋白质结构发生变化，使得抗体能够更容易地与目标抗原结合。 第三步：抗体孵育 在进行免疫组织荧光实验时，需要选择与目标抗原特异性结合的抗体，并将其与组织切片一起孵育。抗体可以是来自动物（如兔子、小鼠）的多克隆抗体或来自细胞培养的单克隆抗体。在孵育过程中，抗体会与目标抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
第四步：洗涤 为了去除无效的抗体和非特异性结合物，需要对组织切片进行洗涤。洗涤过程中使用缓冲液，可以有效地去除孵育过程中产生的杂质和未结合的抗体。 第五步：二抗孵育 为了增强信号的强度，需要使用荧光标记的二抗与抗原-抗体复合物结合。二抗是针对来自第一步孵育的抗体的抗体，可以与其特异性结合。二抗通常标记有荧光物质，如荧光素、荧光蛋白等，通过观察荧光信号可以确定抗原在组织中的分布情况。 第六步：洗涤 与第四步类似，需要对组织切片进行洗涤，以去除未结合的二抗和杂质。 第七步：荧光显微镜观察 在洗涤完毕后，将组织切片放置在荧光显微镜下观察。荧光显微镜可以通过激发荧光标记的抗体产生荧光信号，并将其放大和记录下来。通过观察荧光信号的强度和位置可以确定抗原在组织中的分布情况。 免疫组织荧光技术广泛应用于生命科学研究领域，可以用于检测疾病标志物、研究细胞功能以及探索生物过程的机制。然而，为了获得准确的结果，实验者需要严格控制每个步骤的条件和参数，避免
免疫荧光步骤
免疫荧光步骤 免疫荧光是一种常用的分子生物学技术，用于检测和定量特定抗原或 抗体的存在，以及其在细胞或组织中的分布情况。免疫荧光技术被广泛应 用于生物医学研究、临床诊断、药物研发和疾病治疗等领域。 免疫荧光技术步骤一般包括抗原/抗体的固定、非特异性结合物的洗脱、荧光标记的抗体的结合和荧光检测。下面是免疫荧光的详细步骤： 1.细胞/组织的固定：首先，需要将要研究的细胞或组织进行固定处理，以保持其形态和结构。常用的固定剂包括甲醛和乙酸乙腈酯等。固定 处理后，可以通过透射电镜或荧光显微镜等方法观察到细胞的染色。 2.非特异性结合物的洗脱：由于细胞和组织在固定过程中会产生非特 异的结合物，如蛋白质、核酸和脂质等，需要进行洗脱处理以减少非特异 性的背景信号。洗脱的方法包括用生理盐水或缓冲液溶液进行洗涤，以去 除固定剂和非特异性结合物。 3.抗原/抗体的结合：将特异性的一抗加入到样品中，与目标抗原或 抗体发生特异性结合。一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体。一抗的选择 要根据研究的目的和样品的特点来确定。 4.主抗体的荧光标记：荧光标记的抗体是免疫荧光技术的重要步骤之 一、常用的荧光标记剂包括荧光染料（如荧光素和罗丹明）、荧光蛋白 （如绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白）以及金纳米颗粒等。荧光标记的抗体 具有高度特异性和灵敏度，可通过荧光显微镜等设备直接观察到荧光信号。 5.荧光检测：将样品置于荧光显微镜下观察和记录荧光信号。根据需求，荧光显微镜可以具备单波长或多波长荧光检测功能，以获得更准确和
详细的结果。可以通过调节显微镜的荧光通道、滤光器和放大倍数，调整 荧光信号的亮度、对比度和分辨率，以获得最佳的图像质量。 以上就是免疫荧光的基本步骤。在实际应用中，还可以根据实验的需 要和条件，进行一些细微的改进和优化，如双标染色、组织切片、蛋白质 印迹等。 免疫荧光技术的优点包括高度特异性、灵敏度高、操作简便和快速等。在生物医学研究中，免疫荧光技术被广泛应用于肿瘤标记、病毒检测、免 疫组织化学等方面，对于探索基础科学、疾病发病机制和药物研发具有重 要意义。
免疫荧光实验原理及其步骤
免疫荧光实验原理及其步骤 免疫荧光实验是一种常用的生物学实验技术，用于检测和定位细胞或组织中特定的抗原或抗体。其原理是利用荧光染料与抗原或抗体结合形成复合物，然后通过荧光显微镜观察荧光信号的强度和位置，从而确定目标物的存在和分布情况。下面将详细介绍免疫荧光实验的步骤及其原理。 免疫荧光实验的步骤一般分为样品处理、抗体处理、荧光染色和观察四个主要步骤。 第一步是样品处理。首先需要选择合适的样品，可以是细胞培养物、组织切片或动物体内的器官等。样品处理的目的是使样品适应实验条件并提取目标物，一般包括固定、脱水和透明化等步骤。固定可以采用乙醛或甲醛等化学物质，使细胞或组织保持形态结构。脱水和透明化则是为了去除样品中的水分，并使其透明以便于观察。 第二步是抗体处理。根据实验的需要，可以选择针对目标物的一抗或二抗进行处理。一抗是指对目标物抗原的特异性抗体，二抗是指对一抗特异性结合的抗体。抗体处理的目的是使抗体与目标物结合形成复合物，一般需要在适当的温度和时间下进行孵育。在进行抗体处理之前，需要对样品进行预处理，如孵育样品以降低非特异性结合等。 第三步是荧光染色。荧光染色是利用荧光染料标记抗体，以便于荧
光显微镜观察。常用的荧光染料有荧光素（fluorescein）和罗丹明（rhodamine）等。荧光染色的原理是荧光染料与抗体结合后发射荧光信号，通过荧光显微镜可以观察到目标物的荧光信号。荧光染色的过程包括将荧光染料溶液加入样品中，与抗体发生特异性结合，并进行洗涤以去除未结合的荧光染料。 最后一步是观察。观察是通过荧光显微镜观察样品中的荧光信号，从而确定目标物的存在和分布情况。观察时需要选择适当的荧光滤光片和荧光显微镜参数，以便于观察到荧光信号的强度和位置。观察结果可以通过摄影或记录视频等方式保存下来，以便进一步分析和研究。 免疫荧光实验的原理基于抗原与抗体的特异性结合。抗原是指能够诱导机体产生免疫应答的物质，可以是细菌、病毒、细胞表面的蛋白质等。抗体是机体免疫系统产生的一类特异性蛋白质，能够与特定抗原结合形成复合物。在免疫荧光实验中，首先将样品中的目标物与特异性抗体结合，然后利用荧光染料标记抗体，使其发射荧光信号。通过荧光显微镜观察荧光信号的强度和位置，就可以确定目标物的存在和分布情况。 总结起来，免疫荧光实验是一种重要的生物学实验技术，通过利用荧光染料标记抗体，可以对细胞或组织中特定的抗原或抗体进行检测和定位。实验步骤包括样品处理、抗体处理、荧光染色和观察。
免疫荧光方法
免疫荧光方法 免疫荧光（Immunofluorescence, IF）实验方法 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或 Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
免疫荧光方法【精品】
免疫荧光（Immunofluorescence, IF）实验方法 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或 Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤： （1）细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 （2）固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min. （3）通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. （4）封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. （5）一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. （6）二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 （7）封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 （一）细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好的细胞一般在培养时直接放入coverslips让细胞生长在其上即可，尽量避免使用贴壁性能不好的细胞进行免疫荧光实验，以免后续的漂洗操作引起细胞脱落。少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察，建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 （二）固定和通透 除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的目的有三：
组织免疫荧光
免疫染色实验方法和步骤 免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作。 1. 样品准备(Sample preparation) 对于贴壁细胞： 可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。 也可以用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到6孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作。 对于悬浮细胞： 把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。然后就可以进行后续操作。如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用PDL等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力。 对于冷冻切片： 切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。 对于石蜡切片： 脱蜡：切片在二甲苯中脱蜡5分钟，再换用新鲜的二甲苯脱蜡，共用二甲苯脱蜡3次。无水乙醇5分钟，两次。90%乙醇5分钟，两次，70％乙醇5分钟，一次。蒸馏水5分钟，两次。 抗原修复：根据不同的抗原和抗体，可以选择把切片放置在如下抗原修复液中，10mM柠檬酸钠，pH6.0，或1mM EDTA，pH8.0，或10mM Tris, pH10.0，95℃加热12分钟，大约在30分钟内缓慢冷却至室温。2. 固定 可以使用适当的固定液固定细胞或切片，例如碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)。固定完毕后，可以用免疫染色洗涤液(P0106)洗涤两次，每次5分钟。 3. 封闭(Blocking) 加入免疫染色封闭液(P0102)，封闭60分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。 从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 在整个免疫染色过程中我们推荐使用碧云天的侧摆摇床(ESHK02)，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖样品。如果样品比较容易脱落，也可以把所有的步骤放置在桌面上静止进行，即封闭、抗体孵育、洗涤等步骤均不需摇动，但静止操作时宜适当延长作用时间或次数。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液(P0103)稀释一抗。 用微型台式真空泵(EVAC06/EV AC07)吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。 回收一抗。加入免疫染色洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 参考二抗的说明书，按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液(P0108)稀释荧光标记的二抗，或者用免疫染色(非荧光)二抗稀释液(P0110)稀释辣根过氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或碱性磷酸酯酶(AP)标记的二抗。辣根过氧化物酶(A0201/A0208/A0216)可向碧云天订购。 用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入免疫染色洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 6. 蛋白检测(Detection of proteins) 对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。