石蜡切片免疫荧光技巧
石蜡切片免疫荧光技巧
石蜡切片免疫荧光技术是一种常用的免疫组织化学方法，用于检测或定位特定抗原在组织样本中的分布情况。
以下是石蜡切片免疫荧光技术的步骤：
1. 组织固定和包埋：将组织样本固定在含有4%的缓冲甲醛中，以保持其形态和结构。之后，将组织样本包埋在去离子石蜡中，以增加其硬度和切片的稳定性。
2. 去除蜡并切片：用刀片将固定和包埋的组织样本切割成薄片，通常为4-10微米厚。
3. 抗原解蜡：将蜡切片浸泡在去蜡溶液中，以去除蜡，并将其进行再水化，以恢复组织的水合状态。
4. 抗原检测：用适当的抗体与特定的抗原结合。首先，用一种可以结合到抗原的初级抗体处理组织切片。然后，使用荧光标记的二级抗体结合到初级抗体上，从而使标记可见。
5. 荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察组织切片，并通过选择合适的滤光片来检测和分析特定抗原的荧光信号。不同的荧光染料可用于标记不同的抗原，以实现多重标记和多抗体检测。
石蜡切片免疫荧光技术具有高度的灵敏性和特异性，可用于检测和研究生物标志物在各种疾病和组织中的分布和表达水平。
石蜡切片免疫荧光实验步骤
石蜡切片免疫荧光实验步骤 1、脱蜡至水：将组织切片室温放置10min后，依次将石蜡切片放 入二甲苯3min→无水乙醇5min—85%酒精5min—75%酒精5min—ddH2O洗5min。 2、抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复液（50X稀释至 1X使用)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（中火8min—停火8min—中低火7min）。此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min（具体修复液和修复条件根据组织来确定）。 3、画阻水圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，防止液体 流失。 4、BSA封闭：在圈内滴加3%-5%浓度BSA孵育30min（或二抗 同源血清封闭）。 5、一抗孵育：轻轻甩干封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的 一抗（溶于血清：PBS=1:19的抗体稀释液体系中），切片平放于湿盒（内加少量水防止抗体蒸发），4°C过夜。 6、二抗孵育：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每 次5min。切片稍甩干后在圈内滴加相应的荧光二抗，覆盖组织，避光RT孵育50min。 7、DAPI染核：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每 次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光RT孵育3-5min。 8、树脂封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每 次5min。切片稍甩干后用树脂封片剂封片（其间可滴加少量抗荧光淬灭剂）。 9、镜检拍照：切片于荧光显微镜/confocal/活细胞工作站中观察并 采集图像（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光； CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发橙光；CY5发红光）。 10、结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳 性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光，图片处理需使用Image J 软件。
免疫荧光染色步骤
免疫组织化学染色步骤 1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20→二甲苯Ⅱ10）、入水（100%酒精Ⅰ5→100%酒精Ⅱ3→95%酒精2→80%酒精1→70%酒精1），蒸馏水冲洗后，0.01M 冲洗，5×3次； 2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15，自然冷却至室温，0.01M 冲洗，5×3次； 3．32O 2溶液，37℃，20 ，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M 冲洗，5×3次； 4．正常羊血清封闭，37℃，30 ； 5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M 冲洗，5×3次； 6．滴加二抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次； 7．滴加三抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次； 8．避光显色，显微镜下控制显色时间； 9．0.01M 终止显色； 10．梯度酒精脱水（70%酒精1→80%酒精1→95%酒精Ⅰ1→ 95%酒精Ⅱ1→无水酒精Ⅰ10→无水酒精Ⅱ10），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15→二甲苯Ⅱ10； 11．中性树胶封片。 免疫荧光染色步骤 (1)将组织切片脱蜡入水； (2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15，自然冷却至室温；
(3)正常羊血清封闭，37℃，60 ； (4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，冲洗，5×3次； (5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 ，0.01M 冲洗，5×3次； (6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。 (7)荧光显微镜观察拍照。 细胞免疫组化染色（培养板中染色） 1．培养的细胞，弃去培养基，冷的洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10，洗2次，每次5－10分钟。 2．在含0.1% 100（4孔板200μl）的中进行10的透膜处理，洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。 3．羊血清用配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。 4．吸尽液体，勿洗，添加一抗，于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，洗3次，每次5-10分钟。 5．去除一抗后，细胞用洗三次。 6．加入二抗，然后加入相对应的孔，在37℃下作用30-60。洗3次，每次5-10分钟。 7．吸尽液体，加入三抗，在室温条件下作用30-60。洗3次，每次5-10分钟。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗及三抗的细胞作为阴性对照组。
石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案
石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案 石蜡标本固定、脱水、包埋方法 大鼠自心脏灌注4%多聚甲醛内固定1-2h后取材：取脑出血血肿处脑组织（厚度约3mm），置于塑料盒中并浸泡在4%多聚甲醛中固定，室温中固定时间12-48h，固定好的组织脱水前应流水冲洗30min-1h左右除去固定液，取固定好的脑组织标本脱水、包埋。具体步骤按以下方法进行：此方法参考《组织病理学技术》周庚寅北京大学出版社 2006年 ?70%： 1h-2h ?80%： 1h-2h ?90%： 1h-2h ?95%： 1h-2h ?95%： 1h-2h ?无水Ⅰ：30min-60min ?无水Ⅱ：30min-60min ?二甲苯及水水酒精 1：1混合液 30min ?二甲苯Ⅰ：30min ?二甲苯Ⅱ：30min ?石蜡Ⅰ： 1h ?石蜡Ⅱ： 1h ?石蜡Ⅲ： 1h 包埋：在病理科包埋方法基础上灵活改进：在包埋铁模具上进行，融蜡-放置组织于中央-扣包埋盒4℃冷却10min-撬蜡。 注意事项： 1、固定液的种类：10%中性甲醛，4%的多聚甲醛最合适，在37°或室温中固定12-48h能很 好保存抗原和抗体的反应能力，实验室用的更多的是在4℃冰箱中固定24h-3d。有人建议中性甲醛40摄氏度固定2~3小时，流水冲洗20min-30min，这样可以缩短制片的时间。 2、熔蜡温度65 ℃左右； 3、严格按照预定实验步骤进行，保证脱水及透明完全，透明后见云雾状说明脱水不完全， 需退回无水酒精中返工。 4、经一级二甲苯透明后检查组织是否透明，二级二甲苯透明时间以具体时间而定。 5、注意及时更换梯度酒精及二甲苯（1月）。 组织石蜡切片摘自《免疫组织化学实验技术及应用》 P12 化学工业出版社2006 1.载玻片的处理：采用现成的APES处理过的硅化载玻片。 2.石蜡切片注意事项：1、用于免疫组化的蜡温应为56~58℃，切片水温为 40℃左右，应先置于冷水中（冷水中可参入酒精有利快速展片-见相关方 法），然后再移入热水中，这样可以使切片顺利展平；2、烤片时要注意：一般在62℃烤片30-60min，抗原较强的组织可在60摄氏度烤3~8h，抗 原较弱的组织可于37℃的恒温箱内过夜；3、切片如需长期保存，可置 于4℃或室温下，千万不可脱蜡后4℃保存，因脱蜡后失去了对抗原决定 族的保护。
免疫荧光单标染色技术石蜡切片脱蜡至水的步骤
免疫荧光单标染色技术是一种用于检测特定抗原或蛋白质的方法，能 够在细胞或组织中定位这些分子。这种技术常常用于生物医学研究、 临床诊断和药物开发中。在进行免疫荧光染色之前，需要进行石蜡切 片脱蜡至水的步骤，以确保样品的质量和稳定性。 第一步：脱蜡 1.1 在进行免疫荧光染色前，首先需要将样品中的蜡质去除。通常使用挥发性有机溶剂（如二甲基苯）来溶解蜡质，以达到脱蜡的目的。 1.2 脱蜡过程需要严格控制时间和温度，以避免对样品中的细胞结构和蛋白质的影响。 1.3 脱蜡后，样品需要经过多次洗涤，以保证蜡质完全被去除。 第二步：水洗 2.1 脱蜡后的样品需要经过一系列的水洗步骤，以移除残留的有机溶剂，并保证细胞或组织的完整性。 2.2 水洗过程需要使用高纯度的蒸馏水，并频繁更换，以避免污染和离子残留。 2.3 水洗后，样品需要进行去离子处理，以避免水中离子对免疫荧光染色的干扰。 免疫荧光单标染色技术通过上述步骤，可以在细胞或组织中准确地检 测和定位特定抗原或蛋白质。在这个过程中，严格控制的脱蜡和水洗 步骤对于提高染色的敏感性和稳定性非常重要。
个人观点和理解： 免疫荧光单标染色技术是一种非常重要的生物医学研究工具，它可以帮助科研人员和临床医生更好地理解细胞和组织中的蛋白质定位和表达水平。而其中的石蜡切片脱蜡至水的步骤，是确保染色质量的关键一环。只有通过严格的处理和洗涤，才能保证样品的稳定性和免疫荧光染色的准确性。 总结回顾： 通过本文的阐述，我们深入探讨了免疫荧光单标染色技术中石蜡切片脱蜡至水的关键步骤。这些步骤不仅仅是简单的预处理，更是整个染色过程中样品质量的保证。在未来的研究和实践中，我们应该更加重视这些细节步骤的执行，以确保最终的实验结果的准确性和可靠性。 在中文文章的写作中，要求对于指定的主题或概念进行全面评估，包括深度和广度，并根据主题文字撰写一篇高质量的文章，其中包含了详细的步骤和个人观点以及总结回顾性的内容。文章的格式需要符合知识文章的要求，使用普通文本撰写，使用序号标注，总字数大于3000字。在免疫荧光单标染色技术中，正确的脱蜡和水洗步骤是非常重要的，因为这些步骤直接影响着后续的免疫荧光染色结果。脱蜡的过程需要严格控制温度和时间，以避免对样品中的细胞结构和蛋白质
石蜡切片免疫荧光染色方法完整版
石蜡切片免疫荧光染色 方法 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入l柠檬酸钠，(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏水 中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 PBS洗涤3次。每次5分钟。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 6. 蛋白检测(Detection of proteins)
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤 1 直接免疫荧光法的操作步骤 标本的处理： 石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次; • 2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min •抗体染色： C孵育30min；︒–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1：8或1：16稀释）,放在湿盒中，37 • 0.0lmol/L PBS（pH 7。4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。 •缓冲甘油封片 –分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2,0。2M碳酸盐缓冲液1份配制。 •镜检：在荧光显微镜下观察。 •优点:方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。 •缺点：敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体.若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。 直接免疫荧光法的注意事项μ •对荧光标记的抗体的稀释:要保证抗体的蛋白有一定的浓度； •一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 •染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化； –染色时间：从10 min到数小时，一般30 min； C的低温，延长染色时间。︒C可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0—2︒C)，高于37︒–染色温度:多采用室温(25 C 30 min效果好的多。︒–低温染色过夜较37 •试验时需设置下列对照: –自发荧光对照(空白对照)：标本加0。01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。 –阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 –特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体. •若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 •一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象； •经荧光染色的标本最好在当天观察,随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。 2 间接法又称为荧光抗—抗体法 需要两种抗体参与,即一抗和二抗（荧光素标记）.一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用,但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。ϕ –可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。 间接免疫荧光法操作步骤κ •标本的处理及非特异染色的封闭同直接法； •一抗染色： C过夜.︒C作用30min或4︒–加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释,用0.01MpH7。4的PBS稀释)，37 • 0.01M PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)； C湿盒避光作用30min.︒•加荧光标记的二抗抗体，37 • 0。01M PBST避光漂洗5min×3次（例如包上锡纸，在摇床上漂洗）； •甘油缓冲液封片 •镜检
免疫荧光-石蜡切片
石蜡切片免疫荧光操作规程 试剂 1)二甲苯 2)PBS缓冲液 3)0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。 4)goat血清 5)一抗稀释液：3%BSA in TBS，pH7.4 操作流程 1.脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min。 1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min； 2）无水乙醇中浸泡5min； 3）95%乙醇中浸泡5min； 4）70%乙醇中浸泡5min； 2.PBS洗两次各5min。 3.抗原修复，用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15min，必须等缓冲液冷却后，方能将切片取出。 4.PBS洗5min。 5.滴加5%正常山羊血清，室温封闭30min，甩去多余液体。 6.滴加一抗，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45min）。 7.PBS洗3次每次5min。 8.滴加荧光标记的二抗，室温避光孵育1h。（注意抗体针对的种属，使用浓度：Alexa488、Alexa555为1：1000，Cy3、FITC为1：200，用锡箔纸包住培养板放在抽屉中避光。） 9.PBS洗3次每次5min。 10. Hoechst染色：把1000×Hoechst用PBS稀释，50ul/片，染色10min。 11. PBS洗3次每次2 min。 12.封片：Mounting Medium封片，等Mounting Medium凝固后再拍照。
石蜡切片及免疫荧光
一、石蜡切片 1.固定： 将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。凝固组织中的物质成分，尽可能保持其活体时的结构。同时能使组织硬化，有利于切片的进行。 2.脱水： 为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。 3.透明： 常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。材料块在透明剂浸渍过程称透明。 4.浸蜡：先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。 先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。
5包埋: 以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。 6.切片: 切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。通常切片厚度为3-5um，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。 7.贴片与烤片: 般使用恒温水浴锅，温度控制在37-401左右，有利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60^恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。 8.切片脱蜡及水化: 干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化。 9染色: 经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。实验操作简单。 免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。
组织免疫荧光应该这么做？
组织免疫荧光应该这么做？ 圣诞节的时候写东西是一种考验啊。最近三周补了两个实验，都是和图像处理相关的。幸好，结果都还不错。所以要感谢谭老师的鼎力相助。有一个实验做了三次， •第一次因为细胞背景太脏了，后期荧光太强了，重做。 •第二次因为聚焦的时候是以细胞为主，结果细菌没有照清楚，重做。 •第三次的时候，以为做imaging的那个机器和激光共聚焦的机器一样，可以调整图片，结果后期处理不好。 第三次本来要重做的，但是deadline太近了，就取了第一次的结果，截取了单个细胞做的，结果还不错。另外一个实验，也是比较曲折的。第一次铺细胞的时候，用了一瓶很久之前的PBS，结果细胞污染了，所以东西需要现灭现用。第二次因为没有了做confocal的dish，在深夜十一点到处借，所以要感谢两个小师妹的雪中送炭，最后终于搞定。第二天又临时找了谭老师帮我拍照片，做三维重建，总之小插曲很多，但所幸最后还是做成了，结果也还不错。 我这个人向来运气还比较好，这次虽然惊险通关，但是以后还需要更好的准备。 下面给大家看看我的三维重建的图片。因为在word文档中，放不了动画，所以大家将就看看图片吧。
三维重建 这周要开始分享组织的免疫荧光方法了，说实话我的内心是非常怵的，因为没有做过几次。我希望可以把我有限的知识放在这里，抛砖引玉，引起大家的讨论，然后有更好的解决办法。 组织的免疫荧光之所以难做，是因为组织会有自发荧光，会干扰我们的实验，尤其想在组织上做磷酸化的免疫荧光那更是难上加难。这次主要讲组织的免疫荧光。 做组织的免疫荧光我做过的和知道的有两种方法，一种是选用冰冻切片的组织，一种是选用石蜡包埋的组织。两种方法各有优缺点。 所以，石蜡切片的片子需要做抗原修复，需要在柠檬酸盐缓冲液中煮30 min，这样更有效的去除醛类固定试剂导致的蛋白之间的交联，
免疫荧光三重标记具体方法及步骤
免疫荧光三重标记具体方法及步骤 即利用抗原抗体特异性结合原理，在同一张切片上3个抗原进行同时标记，从而实现定位，定性，半定量的分析 1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。 2、抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min停火8min转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织来确定) 3、画圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走) 4、血清封闭:在圈内滴加BSA孵育30min。(一抗若是山羊来源，则加兔血清) 5、加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发) 6、加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。
次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加CY3荧光增强剂，避光室温孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 8、微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。 9、加第二种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发) 10、加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 11、加FITC荧光增强剂：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加FITC荧光增强剂，避光室温孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 12、微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。 13、加第三种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织的采集、固定和保存： 采取组织后， 方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4︒C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜 方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年tesis） PBS缓冲液洗三次，每次5min，4︒C保存于70%乙醇中。 2、组织的包埋、切片、展片及保存：： 固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54︒C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10μm，贴于处理过的干净载玻片上，37︒C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。 石蜡包埋： 保存于4︒C 70%乙醇中的组织样品 ↓ 80%乙醇15 min ↓ 95%乙醇15 min ↓ 100%乙醇15min ⨯ 2 ↓ 1/2乙醇1/2二甲苯15 min ↓
二甲苯透明5-10 min ↓ 1/2二甲苯1/2石蜡30 min ↓ 石蜡（1） 1.5hr ↓ 石蜡（2） 1.5-2.5hr ↓ 石蜡（3）包埋 ↓ RT保存 3、石蜡组织切片的免疫组化方法： 密封保存于RT的组织切片 ↓ 二甲苯(1) 20 min ↓ 二甲苯(2) 20 min ↓ 100%乙醇20min ↓ 95%乙醇10 min ↓
80%乙醇10 min ↓ 通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈 ↓ 切片在PBS中浸泡 5 min*2 ↓ 0.4%Tritonx RT 10 min ↓ 切片在PBS中浸泡 5 min*3 3%H2O2 RT 10min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 0.25%胰酶RT 10min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min 倾去blocking buffer，勿洗 一抗4︒C overnight in blocking buffer 取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3 二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h
免疫荧光三重标记具体方法及步骤
免疫荧光三重标记具体方法及步！ 即利用抗原抗体特异性结合原理，在同一张切片上3个抗原进行同时标记，从而实现定位，定性，半定量的分析 1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯115min-二甲苯H15min-无水乙醇I 5min-无水乙醇H5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸储水洗。 2、抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min停火8min转中低火7min ,此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min o（修复液和修复条件根据组织来确定） 3、画圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走） 4、血清封闭:在圈内滴加BSA孵育30min。（一抗若是山羊来源，则加免血清） 5、加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 6、加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min o
次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加CY3荧光增强剂，避光室温孵育lOmin.孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 8、微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min ,去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发,切勿干片。 9、加第二种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发) 10、加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 11、加FITC荧光增强剂：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加FITC荧光增强剂，避光室温孵育lOmin.孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 12、微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min ,去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发,切勿干片。 13、加第三种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)
免疫荧光最全攻略：从protocol到问题解决
免疫荧光最全攻略：从protocol到问题解决 免疫荧光（Immunofluorescence）：简称IF，与western blotting一样，也是根据抗原抗体反应的原理，将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体或抗原上，与其相应的抗原或抗体结合后，在荧光显微镜下进行观察，从而确定抗原或抗体的性质和定位，包括直接法和间接法。 一、实验步骤 1. 样品准备（贴壁细胞、悬浮细胞以及组织等）
（1）对于贴壁细胞： 先将洁净的盖玻片在70%乙醇中进行浸泡处理，然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中，用无菌PBS洗去残留的乙醇。待细胞接近长成单层后取出盖玻片，操作小心，防止细胞脱片。 （2）对于悬浮细胞：有2种方法， ①先在悬浮液中进行固定步骤，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。 ②先在悬浮液中进行固定和染色步骤，离心洗脱，然后用移液管移至盒式玻片进行后续染色步骤。 （3）对于冷冻切片：切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。 （4）对于石蜡切片：免疫荧光中石蜡切片较少，要先进行脱蜡和抗原修复处理。 2、固定（防止离体组织自溶抗原扩散） 固定液包括：有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮等）；交联剂（4%PFA、10%中性福尔马林），固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性，不过，目前甲醛用的还是最多的，但针对磷酸化的抗体，不适合用甲醛，会导致磷酸蛋白从膜表面转移到胞浆中，故应选择冰冷的无水甲醇或无水乙醇，同时应注意甲醛会挥发，在4-8°C不宜储存太久。 固定时间：取决于组合块的大小和类型，对于大多数组织，18-24h较为理想，细胞固定时间较短，一般2%的甲醛室温固定20min 即可。 以细胞样品为例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min。 3、通透（目的是使抗体进入胞内）