黄色瘤胃球菌纤维小体脚手架蛋白ScaC基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

中国畜牧兽医㊀２０１９,４６(７):１９１７Ｇ１９２５C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 黄色瘤胃球菌纤维小体脚手架蛋白S c a C 基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达曹平华,李晓霞,赵龙妹,武晓红,许会英,马禹龙(河南科技大学动物科技学院,洛阳４７１０２３)摘㊀要:为获得纤维小体(c e l l u l o s o m e )的基本元件,本试验以滩羊瘤胃液微生物混合D N A 为模板,根据黄色瘤胃球菌纤维小体的脚手架蛋白S c a C 基因序列(G e n B a n k 登录号:J N １０９６３４．１)设计特异性引物,扩增纤维小体脚手架蛋白基因,并对其进行克隆㊁测序及核苷酸和氨基酸序列分析;同时构建脚手架蛋白基因原核表达载体,分析其在大肠杆菌中的表达情况.结果显示,试验利用１对引物同时成功克隆获得２个脚手架蛋白编码基因,其中一个基因全长８６７b p ,编码２８８个氨基酸,命名为S c a C ２基因;另一个基因全长８７０b p,编码２８９个氨基酸,命名为S c a C ７基因.核苷酸序列分析表明,脚手架蛋白基因S c a C ２与S c a C ７的核苷酸序列相似性为７４．１％,S c a C ２基因与黄色瘤胃球菌A G Y ８０P ３１８及S c a C ７基因与黄色瘤胃球菌D A ６４０P ０３７S c a C 基因核苷酸序列相似性均为９９％;氨基酸保守序列分析显示,S c a C ２和S c a C ７氨基酸序列均具有典型的脚手架蛋白结构域,含有１个Ⅰ型黏附域和１个Ⅰ型锚定域.蛋白表达分析显示,S c a C ２和S c a C ７基因均能在大肠杆菌中实现可溶性表达,表达产物大小约为３３k u .本试验克隆获得的纤维小体的脚手架蛋白基因S c a C ２和S c a C ７可为后续人工纤维小体的构建提供基本材料.关键词:纤维小体;脚手架蛋白;克隆;表达中图分类号:S ８１６．３文献标识码:AD o i :１０．１６４３１/j ．c n k i ．１６７１Ｇ７２３６．２０１９．０７．００５㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:２０１９Ｇ０２Ｇ２８基金项目:河南省自然科学基金(１６２３００４１００８０);河南科技大学博士科研启动经费(４０２５Ｇ１３４８００８１);河南科技大学大学生科研训练计划项目(２０１８３７０)作者简介:曹平华(１９７８Ｇ),男,贵州施秉人,博士,讲师,研究方向:动物分子营养与饲用微生物,E Ｇm a i l :c ph x x ＠１２６．c o m C l o n i n g of S c a f f o l d i nG e n e S c a C f r o mC e l l u l o s o m e i n R u m i n o c o c c u s f l a v e f a c i e n s a n d I t sE x pr e s s i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i C A OP i n g h u a ,L IX i a o x i a ,Z HA OL o n g m e i ,WU X i a o h o n g ,X U H u i y i n g ,MA Y u l o n g(C o l l e g e o f A n i m a lS c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,H e n a nU n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,L u o y a n g ４７１０２３,C h i n a )A b s t r a c t :T oo b t a i n t h em o d u l e su s e dt oa s s e m b l y th ec e l l u l o s o m e s ,t h e t o t a lm i c r o b i a l g e n o m i c D N Ao fT a n s h e e p w e r eu s e d t o a m p l i f y t h e s c a f f o l d i nc o d i n gg e n e S c a C u s i n g a pa i r o f p r i m e r s d e s i g n e d a c c o r d i n g t ot h e p ub l i s h e ds e q u e nc e so f R u m i n o c o c c u s f l a v e fa c i e n sS c a C g e n e (G e n ＧB a n ka c c e s s i o n N o ．:J N １０９６３４．１)．T h es c a f f o l d i nc o d i n g g e n e w a sa m pl i f i e d ,c l o n e da n ds e Ｇq u e n c e d ,a n d t h e n u c l e o t i d e a n d a m i n o a c i d s e q u e n c e sw e r e a n a l y z e d ．M e a n w h i l e ,t h e e x pr e s s i o n o f t h e t a r g e t g e n e s i n E ．c o l i w a s a n a l y z e d ．T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t w os c a f f o l d i n gp r o t e i nc o d i n g g e n e sw e r e s u c c e s s f u l l y c l o n e du s i n g a p a i ro f p r i m e r s ．O n eo f t h e m w a s ８６７b p i n l e n g t h ,e n c o Ｇd i n g ２８８a m i n oa c i d s ,n a m e da sS c a C ２,a n dt h eo t h e rw a s８７０b p i nl e n g t h ,e n c o d i n g ２８９a m i n o a c i d s ,n a m e d a sS c a C ７．N u c l e o t i d es e q u e n c ea n a l y s i s r e s u l t s s h o w e dt h a t t h es i m i l a r i t y o f S c a C ２a n d S c a C ７g e n e sw a s ７４ １％．T h e s i m i l a r i t y o f S c a C ２a n d S c a C ７g e n e sw i t h R ．f l a v e fa c i e n s i s o Ｇl a t eA G Y ８０P ３１８a n dD A ６４０P ０３７S c a C g e n e sw e r e ９９％r e s p e c t i v e l y．C o n s e r v a t i v e a m i n o a c i d s e Ｇ中㊀国㊀畜㊀牧㊀兽㊀医４６卷㊀q u e n c e a n a l y s i s s h o w e d t h a t b o t hS c a C２a n dS c a C７a m i n o a c i d s e q u e n c e s h a d t y p i c a l s c a f f o l d p r oＧt e i nd o m a i n,i n c l u d i n g at y p eⅠa d h e s i o nd o m a i na n dat y p eⅠa n c h o r a g ed o m a i n．B o t h g e n e s w e r e s u c c e s s f u l l y e x p r e s s e d i n E s c h e r i c h i a c o l i B L２１(D E３)a n d t h e e x p r e s s i o n p r o d u c t s s h o w e d am o l e c u l a rw e i g h t o f３３k u b y S D SＧP A G E．T h e t w o g e n e s c o u l d b e u s e d a s b a s i cm a t e r i a l s f o r t h e r e c o n s t r u c t i o no fm i n iＧc e l l u l o s o m e s i n t h e f u t u r e．K e y w o r d s:c e l l u l o s o m e;s c a f f o l d i n;c l o n i n g;e x p r e s s i o n㊀㊀如何提高反刍动物粗饲料利用率一直是国内外研究者持续关注和研究的重要课题[１Ｇ４].自然界中某些厌氧微生物可产生一种致力于组织协调多种酶组分协同高效催化降解纤维素的多酶复合体[５],即纤维小体(c e l l u l o s o m e),它被认为是一个微型而高效的纤维素降解机器[６].目前,尽管对这个复杂系统仍缺乏整体了解,但将纤维素酶组装成纤维小体被认为是纤维素微生物降解系统中最有效的方式,也是开发利用纤维素的重要途径之一[７Ｇ９].纤维小体首先被L a m e d等[１０]从热纤梭菌(C．t h e r m o c e lＧl u m)中分离㊁鉴定,随后从厌氧细菌和真菌中不断被发现和分离[１１].由于这些厌氧微生物不易培养,而且天然纤维小体分子质量较大(６５０~２５００k u)[１２],分离纯化方法繁琐[１３],极大地限制了其有效应用.随着对纤维小体结构和功能研究的不断深入,近年来人们提出了人工设计型纤维小体的概念[１４Ｇ１５],即采用D N A重组技术克隆㊁融合㊁表达脚手架蛋白基因和携带锚定域的纤维素酶基因,重组蛋白被纯化后在体外通过脚手架蛋白将携带有相应锚定域的纤维素酶重构为纤维小体.若仅利用纯化的重组蛋白进行纤维小体的体外重构,其生产成本将是一个限制因素[１６].而利用基因工程技术设计功能特定的纤维小体,并使其各组分蛋白在宿主菌中高效分泌表达,表达产物在胞外自组装成人工纤维小体,以提高对复杂多糖的降解,可能是一种降解纤维素相对廉价和方便的方法[１７].由于纤维小体的超分子结构是由酶亚基通过脚手架蛋白组装而成的,克隆脚手架蛋白基因及相应锚定域基因等基本组件对纤维小体体外重构或胞外自组装尤为重要.因此,本试验拟克隆㊁表达纤维小体的脚手架蛋白基因,以期为人工设计纤维小体提供基础材料.１㊀材料与方法１．１㊀材料１．１．１㊀菌株及质粒㊀㊀大肠杆菌D H５α和B L２l (D E３)感受态细胞㊁表达载体p E TＧ２８a均为本实验室保存;克隆载体p M D１９ＧTS i m p l eV e c t o r购自宝生物工程(大连)有限公司.１．１．２㊀样品采集㊀㊀瘤胃液采自体重约为２９k g 健康的宁夏滩羊.试验羊屠宰后,收集其瘤胃内容物,随后用４层纱布过滤,将过滤得到的瘤胃液收集于５０m L离心管中,－８０ħ保存备用.１．１．３㊀主要试剂㊀㊀D L２０００D N A M a r k e r㊁P r i m e S T A R G X L高保真D N A聚合酶㊁T a q D N A聚合酶及限制性内切酶B a m HⅠ和X h oⅠ均购自宝生物工程(大连)有限公司;１k bD N A M a r kＧe r购自N E B公司;蛋白质分子质量标准(B l u e P l u s ⅡP r o t e i n M a r k e r)和蛋白质P r o t e i n I s oN iＧI D A R e s i n纯化试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司;E．Z．N．A G e lE x t r a c t i o nK i t㊁质粒小量提取试剂盒㊁S t o o lD N A提取试剂盒均购自O m e g a 公司;T４D N A连接酶㊁I P T G及XＧG a l均购自P r oＧm e g a公司;氨苄青霉素和卡那霉素均购自S i g m a公司;其余试剂均为国产分析纯.１．２㊀方法１．２．１㊀混合D N A的提取㊀㊀将收集的瘤胃液解冻,参照S t o o lD N A提取试剂盒说明书提取瘤胃液混合D N A,利用１．０％琼脂糖凝胶电泳检测基因组D N A的质量.１．２．２㊀目的基因的克隆㊀㊀根据G e n B a n k中公布的黄色瘤胃球菌(R．f l a v e f a c i e n s)脚手架蛋白S c a C基因序列(登录号:J N１０９６３４．１),设计特异引物扩增S c a C基因的开放阅读框.引物序列为: S c a CＧF:５ᶄＧA T G A A G A C A A A A A A G G T A G T C GＧ３ᶄ;S c a CＧR:５ᶄＧT C A G A G T T C A G A A A T G C T C T TＧG A GＧ３ᶄ.引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成.以瘤胃液混合D N A为模板,利用高保真D N A 聚合酶扩增S c a C基因.P C R反应体系５０μL:混合D N A模板５０n g,P r i m e S T A R G X L高保真D N A 聚合酶２μL,５ˑ扩增缓冲液１０μL,d N T P M i x ４μL,上㊁下游引物各１μL,d d H２O补至５０μL. P C R反应程序:９５ħ预变性３m i n;９８ħ变性１０s,６０ħ退火３０s,６８ħ延伸１．５m i n,共３０个循环;６８ħ延伸５m i n;１２ħ保存.片段经胶回收试剂盒８１９１㊀７期曹平华等:黄色瘤胃球菌纤维小体脚手架蛋白S c a C基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达纯化回收后,将纯化的P C R产物加A并连接至p M D１９ＧTS i m p l eV e c t o r,连接产物转化大肠杆菌D H５α感受态细胞,经蓝白斑筛选㊁菌落P C R鉴定及质粒的酶切鉴定后,阳性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序鉴定,阳性克隆质粒命名为p M DＧS c a C.１．２．３㊀脚手架蛋白基因序列分析㊀㊀利用D N AＧMA N软件对S c a C２和S c a C７基因的核苷酸序列进行比对分析,并对所得到的D N A序列进行翻译;采用N C B I的B L A S T程序(h t t p s:ʊb l a s t．n c b i．n l m．n i h．g o v/B l a s t．c g i)分别对S c a C２和S c a C７基因的核苷酸序列进行同源性比对分析,同时,利用N C B I 的C DＧS e a r c h(C o n s e r v e dD o m a i n sS e a r c h)在线分析程序(h t t p s:ʊw w w．n c b i．n l m．n i h．g o v/S t r u cＧt u r e/c d d/w r p s b．c g i)预测脚手架蛋白基因编码蛋白的保守结构域.１．２．４㊀重组表达质粒p E TＧS c a C的构建㊀㊀根据p E TＧ２８a载体图谱和S c a C２和S c a C７基因的酶切位点,设计１对特异引物,引物序列为:S c a CＧF１:５ᶄＧG T G G A C A G C A A A T G G G T C G C G G A T C C A T G AＧA G A C A A A A A A G G T A GＧ３ᶄ;S c a CＧR２:５ᶄＧC A G TＧG G T G G T G G T G G T G G T G C T C G A G T C A G A G T TＧC A G A A A T G C T CＧ３ᶄ(斜体部分分别为B a m HⅠ和X h oⅠ酶切位点,下划线部分为p E TＧ２８a载体重叠序列).引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成.以该引物从重组质粒p M DＧS c a C中扩增S c a C２和S c a C７基因.然后纯化㊁回收扩增产物.利用B a m HⅠ和X h oⅠ双酶切表达载体p E TＧ２８a,回收后参考P O EＧP C R方法[１８]将其分别与S c a C２和S c a C７基因片段构建脚手架蛋白的表达载体.然后将P O EＧP C R产物直接转化大肠杆菌D H５α感受态细胞,提取阳性克隆质粒,用B a m HⅠ和X h oⅠ双酶切鉴定正确后,送测序验证序列及编码框完整性,重组质粒分别命名为p E TＧS c a C２和p E TＧS c a C７.１．２．５㊀脚手架蛋白基因在大肠杆菌中的表达㊀㊀将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌B L２１(D E３)感受态细胞,挑取阳性重组子接种至L B培养基(含５０m g/m L卡那霉素)中,３７ħ摇床过夜培养;以１ʒ１００比例转接种至L B培养基(含５０m g/m L卡那霉素),３７ħ培养至D６００n m值达到０．４~０．６时,加入I P T G至终浓度为０．２m m o l/L,１６ħ㊁１８０r/m i n继续培养６h;４ħ㊁５０００r/m i n离心集菌,用p H７．４的P B S缓冲液洗２次,加入适量P B S 缓冲液重悬,用超声波破碎仪破碎菌体;１００００r/m i n 离心１５m i n,收集上清和沉淀;利用１２％S D SＧP A G E检测重组蛋白的表达情况,同时,以转化p E TＧ２８a的重组大肠杆菌B L２１(D E３)p E TＧ２８a作为空白对照.１．２．６㊀蛋白的纯化㊀㊀利用P r o t e i n I s oN iＧI D A R e s i n 试剂盒纯化蛋白,通过S D SＧP A G E进行检测分析.２㊀结㊀果２．１㊀脚手架蛋白基因的克隆由图１可知,以滩羊瘤胃液微生物基因组D N A 为模板扩增获得大小约８７０b p的特异条带,与脚手架蛋白基因预期大小一致.将S c a C基因P C R产物连接p M D１９ＧT S i m p l e V e c t o r,转化大肠杆菌D H５α感受态细胞后对重组菌进行菌落P C R鉴定.电泳检测结果显示,获得一条大小约８７０b p的目的条带(图２),表明S c a C基因成功克隆至T载体,重组质粒命名为p M D１９ＧS c a C.M,D L２０００D N A M a r k e r;１~４,S c a C基因P C R产物M,D L２０００D N A M a r k e r;１Ｇ４,P C R p r o d u c t so f S c a C g e n e图１㊀脚手架蛋白基因的P C R扩增F i g．１㊀P C Ra m p l i f i c a t i o no f s c a f f o l d i n g e neM,D L２０００D N A M a r k e r;１~８,重组菌菌落P C R产物M,D L２０００D N A M a r k e r;１Ｇ８,P C R p r o d u c t so f r e c o m b iＧn a n t b a c t e r i a c o l o n y图２㊀脚手架蛋白基因的菌落P C R鉴定F i g．２㊀C o l o n y P C Ri d e n t i f i c a t i o no f s c a f f o l d i n g e n e９１９１中㊀国㊀畜㊀牧㊀兽㊀医４６卷㊀２．２㊀脚手架蛋白基因S c a C的鉴定及生物信息学分析随机选取１０株重组菌送测序,结果发现,克隆得到２个脚手架蛋白基因,分别命名为S c a C２和S c a C７基因.S c a C２基因全长８６７b p,编码２８８个氨基酸,S c a C７基因全长８７０b p,编码２８９个氨基酸;S c a C２与S c a C７基因的核苷酸序列相似性为７４．１％(图３).核苷酸序列比对结果显示,S c a C２基因与已报道的黄色瘤胃球菌A G Y８０P３１８(G e nＧB a n k登录号:J N１１０２８１．１)和A N G８８F３４(G e nＧB a n k登录号:J N１１０３００．１)等的纤维小体脚手架蛋白基因S c a C相似性均达到９９％,S c a C７基因与黄色瘤胃球菌D A６４P０３７(G e n B a n k登录号:J N１０９６３４．１)和A O N８８P０３４(G e n B a n k登录号:J N１０９６３６．１)等的纤维小体脚手架蛋白基因S c a C相似性均达到９９％.氨基酸序列分析表明,S c a C２和S c a C７基因的氨基酸序列均包含有分泌信号肽序列(M１ＧA２８),与已报道黄色瘤胃球菌纤维小体脚手架蛋白基因(G e n B a n k登录号:A E V５９４４６㊁A E V５８７９９)的氨基酸序列相似性均为９９％.上述结果表明,本试验成功克隆获得２个黄色瘤胃球菌纤维小体脚手架蛋白基因S c a C２与S c a C７,提交G e n B a n k后获得登录号分别为K Y９８４０６９和K Y９８４０７０.图３㊀脚手架蛋白基因S c a C２与S c a C７的同源性比对F i g．３㊀H o m o l o g o u s a l i g n m e n t o f s c a f f o l d i n g e n e s S c a C２a n d S c a C７０２９１㊀７期曹平华等:黄色瘤胃球菌纤维小体脚手架蛋白S c a C 基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达㊀㊀氨基酸保守结构域预测结果显示,S c a C ２和S c a C ７氨基酸序列的保守结构域存在一定差异.其中,S c a C ２的特异位点包括１个Ⅰ型黏附域(３２－１８３位氨基酸),非特异位点包括１个Ⅱ型黏附域(３１－１６０位氨基酸)和Ⅰ型锚定域(２１５－２８２位氨基酸)(图４A ).S c a C ７的特异位点包括１个Ⅰ型黏附域(３２－１８３位氨基酸)和Ⅰ型锚定域(２１６－２８３位氨基酸),非特异位点包括１个Ⅱ型的黏附域(３１－１６０位氨基酸)(图４B ).A ,S c a C ２;B ,S c a C ７图４㊀S c a C ２和S c a C ７氨基酸序列保守域预测结果F i g ．４㊀P r e d i c t i o n r e s u l t s o f c o n s e r v a t i v e d o m a i n s o f S c a C ２a n dS c a C ７a m i n o a c i d s e qu e n c e s ２．３㊀表达载体的构建为验证２个基因编码蛋白是否完整及能否在异源宿主中表达,用含有酶切位点的引物从重组质粒中分别扩增脚手架蛋白基因S c a C ２和S c a C ７,克隆至经限制性内切酶(B a m HⅠ和X h o Ⅰ)酶切消化的表达载体p E T Ｇ２８a ,连接产物转化大肠杆菌D H ５α感受态细胞后,用B a m HⅠ和X h o Ⅰ鉴定重组质粒,经电泳检测显示,获得两条大小约５３００和８７０b p 的片段(图５),与预期结果相符.重组质粒经测序分析证实,插入基因的阅读框完整,表明纤维小体脚手架蛋白基因表达载体p E T ２８a ＧS c a C ２和p E T ２８a ＧS c a C ７构建成功,可进行后续表达分析.M ,１k bD N A M a r k e r ;１㊁２,p E T ＧS c a C ２双酶切产物;３㊁４,p E T ＧS c a C ７双酶切鉴定产物M ,１k bD N A M a r k e r ;１a n d２,D o u b l e d i g e s t i o n p r o d u c t s o f p E T ＧS c a C ２;３a n d４,D o u b l e d i ge s t i o n p r o d u c t sof p E T ＧS c a C ７图５㊀重组表达质粒的双酶切鉴定F i g ．５㊀D o u b l e e n z y m e d i g e s t i o n i d e n t i f i c a t i o no f r e c o m b i n a n t e x pr e s s i o n p l a s m i d s １２９１中㊀国㊀畜㊀牧㊀兽㊀医４６卷㊀２．４㊀p E T ２８a ＧS c a C ２和p E T ２８a ＧS c a C ７在大肠杆菌中的表达及重组蛋白的纯化S D S ＧP A G E 电泳检测所示,经I P T G 诱导后,重组大肠杆菌B L ２１(D E ３)pE T ２８a ＧS c a C ２和B L ２１(D E ３)pE T ２８a ＧS c a C ７上清表达产物在３３k u 附近均呈现一条特异性条带(图６),与理论计算值相符,初步判断该条带为重组蛋白表达产物.利用N i ＧN A T 纯化提取的细菌蛋白,S D S ＧP A G E 检测显示,纯化得到２个重组蛋白,大小约为３３k u (图７),表明２个脚手架蛋白基因在大肠杆菌中均成功实现可溶性表达.１,p E T ２８a ＧS c a C ７表达产物;２,pE T ２８a ＧS c a C ２表达产物;３,p E T Ｇ２８a ;M ,B l u eP l u s Ⅱ蛋白质分子质量标准１,p E T ２８a ＧS c a C ７e x p r e s s i o n p r o d u c t ;２,pE T ２８a ＧS c a C ２e x p r e s s i o n p r o d u c t ;３,p E T Ｇ２８a ;M ,B l u e P l u s ⅡP r o t e i n M a r k e r图６㊀脚手架蛋白基因在大肠杆菌中的表达F i g ．６㊀E x pr e s s i o no f t h e t w o s c a f f o l d i n g e n e s i n E ．c o li M ,B l u eP l u s Ⅱ蛋白质分子质量标准;１,pE T ２８a ＧS c a C ２表达产物;２,p E T Ｇ２８a ;３,pE T ２８a ＧS c a C ２纯化产物;４,pE T ２８a ＧS c a C ７纯化产物M ,B l u eP l u s ⅡP r o t e i n M a r k e r ;１,pE T ２８a ＧS c a C ２e x Ｇp r e s s i o n p r o d u c t ;２,p E T Ｇ２８a ;３,pE T ２８a ＧS c a C ２p u r i f i c a Ｇt i o n p r o d u c t ;４,p E T ２８a ＧS c a C ７p u r i f i c a t i o n p r o d u c t 图７㊀纯化产物S D S ＧP A G E 分析F i g ．７㊀S D S ＧP AG Ea n a l ys i s o f t h e p u r i f i e d p r o d u c t s ３㊀讨㊀论自然界中,许多厌氧菌可将所产纤维素酶通过组装成纤维小体进而高效降解纤维素[１６].纤维小体主要由含多种类型黏附域(c o h e s i nd o m a i n )的非催化亚基脚手架蛋白(s c a f f o l d i n )和含多种类型锚定域(d o c k e r i n d o m a i n)的催化亚基酶蛋白两部分组成[１０,１９Ｇ２０],酶分子依赖于酶亚基上的锚定域可高度专一地与脚手架蛋白上的黏附域结合,组装形成稳定的超分子结构的多功能复合体纤维小体[２１];同时,纤维素酶通过纤维素结合域(C B M )结合纤维素,进而协同㊁有序㊁高效地降解纤维素[１４,２２].目前,纤维小体已在许多厌氧细菌和真菌中被发现和分离[２３Ｇ２４],如溶纤维拟杆菌(B a c t e r o i d e s c e l l u l o s o l Ｇv e n s )㊁嗜纤维梭菌(C l o s t r i d i u mc e l l u l o v o r a n s )㊁热梭菌(C ．t h e r m o c e l l u m )㊁解纤维梭菌(C ．c e l l u l o l yt i Ｇc u m )㊁黄色瘤胃球菌(R ．f l a v e f a c i e n s )㊁产琥珀酸丝状杆菌(F i b r o b a c t e r s u c c i n o ge n e s )等.瘤胃中主要的纤维降解菌包括黄色瘤胃球菌(R ．f l a v e fa Ｇc i e n s )㊁产琥珀酸丝状杆菌(F ib r o b ac t e rs u c c i n o Ｇg e n e s )㊁溶纤维丁酸弧菌(B u t yr i v i b r i o f i b r i s o l Ｇv e n s )和梭状芽孢杆菌(C l o s t r i d i u m s p );其中,黄色瘤胃球菌与其余几种瘤胃纤维降解菌相比,相对丰度较高[２５].研究表明,黄色瘤胃球菌的纤维小体是一个非常复杂的超级结构,包括４种具有黏附域的脚手架蛋白:S c a A ㊁S c a B ㊁S c a C 和S c a E .其中,S c a C 只含有一个黏附域,且该黏附域与其他已知黏附域(包括S c a A 和S c a B 的黏附域)在序列上不同.S c a C 的C 端有一个锚定域,能与S c a A 上的黏附域结合.S c a C 还能与多种蛋白质结合,且与S c a A 可识别的蛋白质集合没有明显的重合[２６].S c a C 能识别一组特别的蛋白质,这些蛋白质被推测具有与已知锚定域不同的尚未识别的锚定域.因此,本试验以滩羊瘤胃液微生物混合D N A 为模板,根据G e n ＧB a n k 中已登录的黄色瘤胃球菌纤维小体的脚手架蛋白基因S c aC 序列设计引物,最终成功克隆获得了２个脚手架蛋白S c a C 基因,即S c a C ２和S c a C ７基因.分析显示,这２个基因的核苷酸序列相似性为７４ １％;S c a C ２和S c a C ７基因氨基酸序列保守结构域经C D Ｇs e a r c h 预测发现,二者均具有典型的结构域,即包括１个Ⅰ型黏附域和１个Ⅰ型锚定域.由黄色瘤胃球菌１７纤维小体结构推测可知,脚手架２２９１㊀７期曹平华等:黄色瘤胃球菌纤维小体脚手架蛋白S c a C基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达蛋白S c a C２和S c a C７的锚定域可与S c a A的黏附域结合,而其黏附域可结合含有对应锚定域的纤维素酶,进而组装为纤维小体[２７].许多研究证实,不同纤维小体脚手架蛋白基因均在异源宿主内进行了表达[２８Ｇ３０].本试验克隆的２个脚手架蛋白基因在大肠杆菌中也实现了可溶性表达,重组大肠杆菌B L２１(D E３)p E T２８aＧS c a C２菌体细胞胞液中的可溶性蛋白量高于B L２１(D E３) p E T２８aＧS c a C７,但２个脚手架蛋白基因的大部分表达产物仍以包涵体形式存在于细胞质中,这可能是因为在异源表达过程中由于宿主可能缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子,或因表达量较大使部分蛋白没有充足的时间进行折叠,无法形成正确的次级键,从而以包涵体形式存在[３１].虽然有很多方法(如机械方法)可将包涵体存在的蛋白与可溶性蛋白进行分离,进而对包涵体蛋白进行复性,恢复蛋白的结构和功能[３２],但这势必会使生产成本增加,不利于其广泛应用.因此,许多研究利用基因工程技术使纤维小体各组分蛋白在异源宿主中高效表达,进而在宿主菌胞内或表面组装成纤维小体,使重组菌能直接高效降解木质纤维素.如F a n等[２９]在酵母表面中展示了三酶纤维小体,其活性较二酶纤维小体高出约８．８倍;A n d e r s o n等[２８]在枯草芽孢杆菌中成功展示了三酶复合体,其活性约是单个酶的４倍,是三种单个酶总活性的１．３倍;陈宁等[３３]在酿酒酵母表面成功展示了双支架纤维小体,并实现共降解纤维素和半纤维素生产乙醇;T a n g等[３４]利用二硫键在酵母表面成功展示了多组分的复杂纤维小体,使酵母能直接将纤维素发酵成乙醇;S t e r n等[３０]在植物乳酸杆菌表面展示了六酶复合体,其总酶活性明显高于四酶纤维小体,并可有效降解小麦秸秆.本试验克隆所获得的脚手架蛋白基因S c a C２和S c a C７为后续纤维小体的体外重构提供了基本材料,其编码蛋白的功能尚需进一步验证.４㊀结㊀论本试验以滩羊瘤胃液微生物混合D N A为模板,成功克隆获得了２个长度分别为８６７和８７０b p 的脚手架蛋白编码基因S c a C２和S c a C７,二者核苷酸序列相似性为７４．１％;２个脚手架蛋白均可在大肠杆菌中实现可溶性表达,蛋白质分子质量约为３３k u.参考文献(R e f e r e n c e s):[１]㊀F R A N C O M D O,D E TMA N N E,B A T I S T A E D,e t a l．I n t a k e,d i g e s t i b i l i t y,a n dr u m e na n d m e t a b o l i cc h a r a c t e r i s t i c s o f c a t t l e f ed l o wＧq u a l i t y t r o p i c a l f o r a g ea n d s u p p l e m e n t e dw i t hn i t r o g e n a n d d i f f e r e n t l e v e l s o fs t a r c h[J]．A s i a nＧA u s t r a l a s i a n J o u r n a lo f A n i m a lS c i e n c e s,２０１７,３０(６):７９７Ｇ８０３．[２]㊀朱㊀勇,余思佳,包㊀健,等．发酵鲜食大豆秸秆对母羊繁殖性能㊁初乳品质及消化性能的影响[J]．中国畜牧兽医,２０１７,４４(１):１００Ｇ１０５．Z HU Y,Y US J,B A OJ,e t a l．T h e e f f e c t o f f e r m e n t e dv e g e t a b l es o y b e a n s t r a w o n r e p r o d u c t i v e p e r f o r mＧa n c e s,c o l o s t r u m q u a l i t y a n dd i g e s t i o n i na d u l t f e m a l eg o a t[J]．C h i n a A n i m a l H u s b a n d r y&V e t e r i n a r yM e d i c i n e,２０１７,４４(１):１００Ｇ１０５．(i nC h i n e s e) [３]㊀韩东魁,耿春银,张㊀敏,等．负离子中药复合制剂对延边黄牛生长性能㊁养分表观消化率及血液生化指标的影响[J]．中国畜牧兽医,２０１８,４５(７):１８５６Ｇ１８６２．HA N D K,G E N G C Y,Z HA N G M,e ta l．E f f e c to fc o m p o u nd p re p a r a t i o n so fn e g a t i v ei o na n d C h i n e s em e d i c i n eo n g r o w t h p e r f o r m a n c e,n u t r i e n ta p p a r e n td i ge s t i b i l i t y a n db l o o db i o c h e m i c a l i n d e x e s o fY a n b i a nY e l l o wc a t t l e[J]．C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y&V e t e rＧi n a r y M e d i c i n e,２０１８,４５(７):１８５６Ｇ１８６２．(i nC h i n e s e) [４]㊀张㊀旭,郭盼盼,金锡九,等．不同温度条件下发酵时间对完全混合发酵日粮(TM F)发酵品质的影响[J]．中国畜牧兽医,２０１８,４５(３):６７３Ｇ６８１．Z HA N G X,G U O PP,J I N XJ,e t a l．E f f e c t so f f e rＧm e n t a t i o nt i m eo nf e r m e n t a t i o n q u a l i t y o ft h et o t a lm i x e d f e r m e n t a t i o n r a t i o n(T M F)a t d i f f e r e n t f e r m e n t aＧt i o n t e m p e r a t u r e[J]．C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y&V e tＧe r i n a r y M e d i c i n e,２０１８,４５(３):６７３Ｇ６８１．(i nC h i n e s e) [５]㊀A R T Z IL,B A Y E R E A,MO R AÏSS．C e l l u l o s o m e s:B a c t e r i a l n a n o m a c h i n e s f o r d i s m a n t l i n gp l a n t p o l y s a cＧc h a r ide s[J]．N a t u r eR e v i e w sM i c r o b i o l o g y,２０１７,１５(２):８３Ｇ９５．[６]㊀B HA T T A C HA R Y A A S,B HA T T A C HA R Y A A, P L E T S C H K EBI．S y n e r g i s m o f f u n g a l a n db a c t e r i a lc e l l u l a s e s a n dh e m i c e l l u l a s e s:A n o v e l p e r s p e c t i v e f o re n h a n c e d b i oＧe t h a n o l p r o d u c t i o n[J]．B i o t e c h n o l o g yL e t t e r s,２０１５,３７(６):１１１７Ｇ１１２９．[７]㊀冯㊀薇,王加启,刘开朗,等．参与瘤胃内纤维素降解过程的主要微生物研究进展[J]．中国畜牧兽医,２０１１,３８(２):３７Ｇ４２．F E NG W,WA N GJQ,L I U K L,e t a l．T h er e s e a r c h３２９１中㊀国㊀畜㊀牧㊀兽㊀医４６卷㊀a d v a n c eo ft h e p r o c e s s e so fc e l l u l o s ed e g r a d a t i o ni nr u m e na n dr e l a t e dm i c r o o r g a n i s m s[J]．C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y&V e t e r i n a r y M e d i c i n e,２０１１,３８(２):３７Ｇ４２．(i nC h i n e s e)[８]㊀D O IR H,K O S U G IA．C e l l u l o s o m e s:P l a n tＧc e l lＧw a l lＧd e g r a d i n g e n z y m e c o m p l e x e s[J]．N a t u r e R e v i e w sM iＧc r o b i o l o g y,２００４,２(７):５４１Ｇ５５１．[９]㊀朱兆静,潘㊀虎,郭㊀俊,等．纤维小体结构及其功能的研究进展[J]．江苏农业科学,２０１８,４６(１９):１２Ｇ１６．Z HUZ J,P A N H,G U OJ,e t a l．R e s e a r c h p r o g r e s s o ns t r u c t u r e a n d f u n c t i o no f c e l l u l o s o m e[J]．J i a n g s uA g r iＧc u l t u r a l S c i e n c e s,２０１８,４６(１９):１２Ｇ１６．(i nC h i n e s e) [１０]㊀L AM E D R,S E T T E R E,B A Y E R E A．C h a r a c t e r i z aＧt i o no fac e l l u l o s eＧb i nd i n g,ce l l u l a s eＧc o n t a i n i n g c o mＧp l e xi n C l o s t r i d i u m t h e r m o c e l l u m[J]．J o u r n a lo fB a c t e r i o l o g y,１９８３,１５６(２):８２８Ｇ８３６．[１１]㊀M I N G A R D O N F,B A G E R TJD,MA I S O N N I E R C,e t a l．C o m p a r i s o no ff a m i l y９c e l l u l a s e sf r o m m e s oＧp h i l i c a n d t h e r m o p h i l i cb a c t e r i a[J]．A p p l i e da n dE nＧv i r o n m e n t a lM i c r o b i o l o g y,２０１１,７７(４):１４３６Ｇ１４４２．[１２]㊀D O IR H,K O S U G IA,MU R A S H I MAK,e t a l．C e l l uＧl o s o m e s f r o m m e s o p h i l i c b a c t e r i a[J]．J o u r n a l o f B a cＧt e r i o l o g y,２００３,１８５(２０):５９０７Ｇ５９１４．[１３]㊀P A S O NP,K O S U G IA,WA E O N U K U LR,e t a l．P u rＧi f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fa m u l t i e n z y m ec o m p l e xp r o d u c e db y P a e n i b a c i l l u s c u r d l a n o l y t i c u s BＧ６．[J]．A pＧp l i e dM i c r o b i o l o g y a n dB i o t e c h n o l o g y,２０１０,８５(３):５７３Ｇ５８０．[１４]㊀R A V A C H O LJ,B O R N ER,T A R D I FC,e t a l．C h a r a cＧt e r i z a t i o no f a l l f a m i l yＧ９g l y c o s i d eh y d r o l a s e ss y n t h eＧs i z e db y t h ec e l l u l o s o m eＧp r o d u c i n g b a c t e r i u m C l o sＧt r i d i u m c e l l u l o l y t i c u m[J]．J o u r n a lo f B i o l o g i c a lC h e m i s t r y,２０１４,２８９(１１):７３３５Ｇ７３４８．[１５]㊀C A S P I J,B A R A K Y,HA I MO V I T ZR,e t a l．E f f e c t o f l i n k e r l e n g t ha n dd o c k e r i n p o s i t i o no n c o n v e r s i o no f at h e r m o b i f i d a f u s c ae n d o g l u c a n a s et ot h ec e l l u l o s o m a lm o d e[J]．A p p l i e da n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l oＧg y,２００９,７５(２３):７３３５Ｇ７３４２．[１６]㊀王金兰,王禄山,刘巍峰,等．降解纤维素的 超分子机器 研究进展[J]．生物化学与生物物理进展,２０１１,３８(１):２８Ｇ３５．WA N GJL,WA N G L S,L I U W F,e ta l．R e s e a r c ha d v a n c e so nt h ea s s e mb l y m o d eo fc e l l u l o s o m a lm a cＧr o m o l e c u l a r c o m p l e x e s[J]．P r o g r e s s i nB i o c h e m i s t r ya n dB i o p h y s i c s,２０１１,３８(１):２８Ｇ３５．(i nC h i n e s e) [１７]㊀V A N D E V E N T,K A D L A J．C e l l u l o s e B i o m a s sC o n v e r s i o n[M]．I n t e c h O p e n,２０１３．[１８]㊀C A OPH,WA N GL,Z H O U GX,e t a l．R a p i d a s s e mＧb l y o fm u l t i p l eD N Af r a g m e n t s t h r o u g hd i r ec t t r a n sＧf o r m a t i o no fP C R p r o d u c t s i n t o E．c o l i a n d L a c t o b aＧc i l l u s[J]．P l a s m i d,２０１４,７６:４０Ｇ４６．[１９]㊀N O A C HI,L E V YＧA S S A R A F M,L AM E D R,e ta l．M o d u l a r a r r a n g e m e n t o f a c e l l u l o s o m a l s c a f f o l d i n s u bＧu n i t r e v e a l e df r o mt h ec r y s t a l s t r u c t u r eo fac o h e s i nd y a d[J]．J o u r n a l o f M o le c u l a rB i o l o g y,２０１０,３９９(２):２９４Ｇ３０５．[２０]㊀B A Y E RE A,S H I MO N LJ W,S H O HAM Y,e t a l．C e l l u l o s o m e ss t r u c t u r ea n du l t r a s t r u c t u r e[J]．S t r u cＧt u r a l B i o l o g y,１９９８,１２４(２Ｇ３):２２１Ｇ２３４．[２１]㊀B U L EP,P I R E S V M,F O N T E SC M,e ta l．C e l l u l oＧs o m e a s s e m b l y:P a r a d i g m sa r em e a n t t ob eb r o k e n[J]．C u r r e n tO p i n i o ni n S t r u c t u r a l B i o l o g y,２０１８,４９:１５４Ｇ１６１．[２２]㊀E L K I N SJ G,R AMA N B,K E L L E R M．E n g i n e e r e d m i c r o b i a l s y s t e m s f o r e n h a n c e d c o n v e r s i o n o f l i g n o c e lＧl u l o s i cb i o m a s s[J]．C u r r e n tO p i n i o ni n B i o t e c h n o l oＧg y,２０１０,２１(５):６５７Ｇ６６２．[２３]㊀P O N P I U M P,R A T A N A K H A N O K C H A I K,K Y U K L．I s o l a t i o na n d p r o p e r t i e so fac e l l u l o s o m eＧt y p e m u lＧt i e n z y m e c o m p l e xo f t h e t h e r m o p h i l i c B a c t e r o i d e s s p．s t r a i nPＧ１[J]．E n z y m ea n d M i c r o b i a l T e c h n o l o g y,２０００,２６(５Ｇ６):４５９Ｇ４６５．[２４]㊀F E L I X C R,L J U N G D A H L L G．T h ec e l l u l o s o m e: T h ee x o c e l l u l a ro r g a n e l l eo f C l o s t r i d i u m[J]．A n n u a lR e v i e wo f M i c r o b i o l o g y,１９９３,４７(４７):７９１Ｇ８１９．[２５]㊀HA NX,Y A N GY,Y A N H,e t a l．R u m e n b a c t e r i a l d iＧv e r s i t y o f８０t o１１０Ｇd a yＧo l d g o a t s u s i n g１６S r R N As eＧq u e n c i n g[J]．P L o SO n e,２０１５,１０(２):e０１１７８１１．[２６]㊀R I N C O N M T,MA R T I N JC,A U R I L I A V,e ta l．S c a C,a na d a p t o r p r o t e i n c a r r y i n g an o v e l c o h e s i n t h a te x p a n d s t h e d o c k e r i nＧb i n d i n g r e p e r t o i r eof t h e R u m iＧn o c o c c u s f l a v e f a c i e n s１７c e l l u l o s o m e[J]．J o u r n a l o fB a c t e r i o l o g y,２００４,１８６(９):２５７６Ｇ２５８５．[２７]㊀K A R P O LA,J O B B Y M K,S L U T Z K IM,e t a l．S t r u cＧt u r a l a n d f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n o v e l t y p eＧⅢd o c ke r i nf r o m R u m i n o c o c c u s f l a v e f a c i e n s[J]．F E B SL e t t e r s,２０１３,５８７(１):３０Ｇ３６．[２８]㊀A N D E R S O N TD,R O B S O NSA,J I A N GX W,e t a l．A s s e m b l y o fm i n i c e l l u l o s o m e so nt h es u r f a c eo fB aＧc i l l u s s u b t i l i s[J]．A p p l i ed a n dE n v i r o n me n t a lM i c r oＧb i o l o g y,２０１１,７７(１４):４８４９Ｇ４８５８．[２９]㊀F A NL H,Z HA N G ZJ,Y U X Y,e ta l．S e l fＧs u r f a c e４２９１㊀７期曹平华等:黄色瘤胃球菌纤维小体脚手架蛋白S c a C基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达a s s e mb l y o fc e l l u l o s o m e sw i t h t w om i n i s c a f f o ld i n so nS a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e f o rc e l l u l o s i ce t h a n o l p r oＧd u c t i o n[J]．P r o ce e d i n g s of t h eN a t i o n a lA c a d e m y o fS c i e n c e s,２０１２,１０９(３３):１３２６０Ｇ１３２６５．[３０]㊀S T E R NJ,MO R AÏSS,B E N D A V I D Y,e t a l．A s s e mＧb l y o f s y n t h e t ic f u n c t i o n a l c e l l u l o s o m a l s t r u c t u r e s o nＧt o t h ec e l l s u r f a c eo f L a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m,a p oＧt e n tm e m b e r o f t h e g u tm i c r o b i o m e[J]．A p p l i e da n dE n v i r o n m e n t a lM i c r o b i o l o g y,２０１８,８４(８):e００２８２Ｇ１８．[３１]㊀李㊀旺．纤维素酶基因重组野生型乳酸杆菌表达系统的构建[D]．杨凌:西北农林科技大学,２０１０．L IW．C o n s t r u c t i o n o fw i l d t y p e L a c t o b a c i l l u s e x p r e sＧs i o n s y s t e mi n t e g r a t e dw i t hc e l l u l a s e g e n e s[D]．Y a nＧg l i n g:N o r t h w e s tA&FU n i v e r s i t y,２０１０．(i nC h i n e s e) [３２]㊀Z HA N G Y H P,H I MM E L M E,M I E L E N ZJ R．O u t l o o k f o r c e l l u l a s e i m p r o v e m e n t:S c r e e n i n g a n ds eＧl e c t i o ns t r a t e g i e s[J]．B i o t e c h n o l o g y A d v a n c e s,２００６,２４(５):４５２Ｇ４８１．[３３]㊀陈㊀宁,杜济良,杨㊀玥,等．自组装嵌合纤维小体酿酒酵母菌群的乙醇发酵研究[J]．太阳能学报,２０１８,３９(８):２１０３Ｇ２１０９．C H E N N,D UJL,Y A N G Y,e t a l．S t u d y o f e t h a n o lf e r m e n t a t i o n o fs e l fＧa s s e m b l e d d e s ig n e rc e l l u l o s o m eo n S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e[J]．A c t aE n e r g i a eS oＧl a r i sS i n i c a,２０１８,３９(８):２１０３Ｇ２１０９．(i nC h i n e s e) [３４]㊀T A N G H,WA N GJ,WA N G S,e ta l．E f f i c i e n t y e a s t s u r f a c eＧd i s p l a y o f n o v e lc o m p l e x s y n t h e t i c c e l l u l oＧs o m e s[J]．M i c r o b i a l C e l lF a c t o r i e s,２０１８,１７(１):１２２．(责任编辑㊀董晓云)５２９１。