培养基湿热灭菌原理
培养基灭菌的目的和要求
灭菌的方法
• 化学法
– 化学药品灭菌法：甲醛、苯酚等
• 物理法
– 干热灭菌法 – 湿热灭菌法（生物工程工业常用方法） – 射线灭菌法
1. 湿热灭菌原理和影响灭菌的因素
湿热灭菌的原理：主要是因高温使微生物体内的 一些重要蛋白质，如酶等，发生凝固、变性， 从而导致微生物无法生存而死亡。
• 固体培养基的灭菌时间比液体培养基的灭菌 时间长。其原因是液体培养基灭菌时，热的 传递有对流和传导，固体培养基只有传导。 对于含有少量大颗粒及粗纤维的培养基的灭 菌，需提高灭菌温度，且在不影响培养基质 量的条件下，采用粗过滤方法预先处理，以 防培养基结块而造成灭菌的不彻底。
3、pH 培养基的pH越低，灭菌所需时间越短。 • 培养基的pH与灭菌时间的关系见表。
K Nt
K
Nt
为理论灭菌时间的对数残留规律公式。
问题：能不能做到绝对无菌？
温度对K的影响 • 微生物的热死灭动力学接近一级反应
动力学，它的比热死灭速率常数K与 灭菌温度T的关系可用阿累尼乌斯方
程表征 K A eE/ RT
A-频率因子，min-1 ΔE-活化能，J/mol R-通用气体常数，J/（mol.k）
• 1、培养基成分 • 培养基中脂肪、糖分和蛋白质的含量越
高，微生物的热死亡速率越慢 • 在热死温度下，脂肪、糖分和蛋白质等
有机物质在微生物细胞外面形成一层薄 膜，它能有效保护微生物细胞抵抗不良 环境，因此需较高的灭菌温度。 • 另一些物质，如高浓度的盐类，色素等 可削弱其耐热性。
• 2、培养基的物理状态
• 优点：灭菌的温度较高，灭菌时间较短， 培养基的营养成分受破坏的程度较低， 从而保证了培养基的质量；设备的利用 率高；
连续灭菌
进
图5－7 ；连续灭菌的加热设备
设培养基流量为G，m3／s；进入加热器的温度为tp。； 灭菌温度为t；由热量平衡得加热蒸汽用量为
ρ：为培养基的密度，kg／m3； C：培养基的比热容，J／kg； CW：水的比热容，J／kg λ：加热蒸汽的热焓，J／kg。
▪ 改变培养基的pH（一般为降低pH） ▪ 降低培养基浓度（气温低时会增加冷凝水）
消除高温对有害影响的措施
▪ 采用特殊加热灭菌法（连续灭菌方法） ▪ 对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液
与其他成分分别灭菌后再合并 ▪ 对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，
然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀 ▪ 对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组
a．维持罐 维持罐如图5—8所示，
维持罐缺点：
维持罐直径比进料管直 径大得多，培养基不能先进 先出，返混较重，维持时间 被迫延长，加剧了营养成分 破坏。
图5－8 维持罐结构
连续灭菌的理论灭菌时间计算可沿用对数残留定律， 如忽略升温的灭菌作用，得停留时间
t = 1 ln c 0
5-26
k cS
C0：单位体积培养基在灭菌前活微生物个数，菌数／毫升 Cs：单位体积培养基在灭菌后活微生物个数，菌数／毫升
合培养基）可进行低压灭菌
灭菌方式 连续灭菌
优点
缺点
1.灭菌温度高，质的破坏
和冷却装置
2.操作条件恒定，灭菌质量稳定 2.操作较麻烦
3.易于实现管道化和自控操作
3.染菌的机会较多
4.避免了反复的加热和冷却，提高 4.不适合于含大量固体物料的
了热的利用率
热力灭菌的原理及应用
热力灭菌的原理及应用1. 原理热力灭菌是一种常用的微生物灭活方法，利用高温或蒸汽对目标物进行处理，以达到杀灭细菌、病毒和其他微生物的目的。
热力灭菌的原理主要是通过热量的传递和能量转化，破坏微生物的生物化学结构，使其无法繁殖和生存。
热力灭菌主要包括两种方法：湿热灭菌和干热灭菌。
1.1 湿热灭菌湿热灭菌是指利用高压蒸汽对目标物进行处理的方法。
高压蒸汽的温度可以达到121摄氏度，并保持一定的压力。
湿热灭菌主要通过以下步骤实现：1.加热：将目标物放入蒸汽中，加热使目标物温度升高，与微生物发生热交换。
2.杀菌：高温下，微生物的生物化学结构会发生变化，蛋白质、核酸和细胞膜等物质受到破坏，导致微生物无法生存。
3.冷却：将目标物从高温环境中取出后，通过冷却使其恢复正常温度，进行后续的包装和贮存。
湿热灭菌通常用于消毒医疗器械、生物制品、培养基和培养器皿等物品的处理。
1.2 干热灭菌干热灭菌是指利用热空气对目标物进行处理的方法。
干热灭菌通常采用高温和较长时间的处理。
干热灭菌主要通过以下步骤实现：1.加热：通过加热设备将目标物加热至一定温度，使微生物受到破坏。
2.热传导：高温空气会使微生物内部的水分蒸发，导致细菌细胞膜受损，细胞内部构造发生变化。
3.杀菌：微生物的蛋白质会发生变性，DNA的双链结构会被破坏，从而使微生物无法繁殖和生存。
干热灭菌通常用于灭活制药工业中的药物、原料以及一些粉末和玻璃器皿等。
2. 应用热力灭菌在医疗、制药及食品行业有着广泛的应用。
以下是热力灭菌在不同领域的具体应用示例：2.1 医疗行业•医疗器械消毒：湿热灭菌常用于对手术器械、注射器、电极等进行消毒处理。
•医疗废弃物处理：热力灭菌也常用于医疗废弃物处理，有效杀灭其中的病原体。
•医疗器械灭菌：干热灭菌广泛应用于一次性使用的医疗器械的制造过程中，确保其无菌。
•医药制造：在药品制造中，热力灭菌被用于灭活细菌、病毒和其他微生物，以保证产品的安全性。
2.2 制药行业•药物灭菌：热力灭菌被广泛应用于制药过程中，确保药物的安全性和无菌性。
培养基灭菌的方法
培养基灭菌的方法培养基灭菌是为了确保培养基中没有活性的微生物存在。
培养基灭菌的方法有多种，既包括物理方法，如高温灭菌、滤膜灭菌等，也包括化学方法，如化学灭菌剂灭菌等。
下面将详细介绍各种方法以及其操作步骤。
首先是高温灭菌法。
这是最常用的一种灭菌方法，通过高温的热力作用来杀灭微生物。
高温灭菌可以使用干热法或湿热法。
1. 干热法：将需要灭菌的培养基置于干热灭菌器中，通常在160-180C的高温下进行处理。
温度和时间的选择要根据具体情况而定，通常是在热力消毒时间表上选择。
干热灭菌器具有温度调节和定时功能，可以实现自动控制。
2. 湿热法：将培养基装入有效容器中，如玻璃瓶、耐热塑料瓶等，然后通过蒸汽或水浴进行灭菌处理。
蒸汽灭菌是最常用的方法，一般在100C以上进行。
水浴灭菌同样是将培养基容器放入预热的水浴器中进行灭菌，水温通常为100C，持续10-30分钟不等。
其次是滤膜灭菌法。
这是一种通过筛选微生物的方法，可以有效地灭活微生物而保留培养基中的营养物质。
1. 为了滤膜灭菌，首先需要选择一个滤膜尺寸，一般为0.22或0.45微米。
选择合适的滤膜尺寸可以删除绝大多数的微生物。
滤膜的材质非常重要，一般选择具有较好生物相关性的材料，如聚酯膜、聚酰胺膜等。
2. 将培养基通过真空泵抽吸，使其穿过滤膜。
微生物会被滤膜截留在上面，营养物质通过滤膜留下，进入下方的容器中。
3. 然后将滤膜移到含有灭菌溶液的培养皿中，使其与灭菌溶液接触。
最常用的灭菌溶液是70%乙醇或含有漂白剂的水。
化学方法是另一种常用的培养基灭菌方法，主要通过使用化学灭菌剂来达到灭活微生物的目的。
这种灭菌方法对于那些不能耐受高温或压力的培养基非常有用。
1. 最常用的灭菌剂是乙醛。
在常温下，将乙醛溶液添加到培养基中，然后将其密封存放一定时间，一般为3-24小时。
乙醛具有广谱抗微生物作用，在适当剂量下对大多数病原菌均有很好的抑制效果。
2. 另一种常用的化学灭菌剂是过氧化氢。
培养基消毒灭菌的方法(一)
培养基消毒灭菌的方法(一)培养基消毒灭菌方法传统方法•高温灭菌–干热灭菌：利用高温烘烤培养基，达到灭菌目的。
常见的干热灭菌器有烘箱和火焰灭菌器。
适用于耐热菌种的消毒。
–湿热灭菌：利用高温高压蒸汽，将培养基置于压力锅或高压蒸汽灭菌器中。
适用于对高温敏感的菌种。
•化学消毒–醇消毒：常用的酒精包括乙醇、异丙醇等，能杀死大多数细菌、真菌和病毒。
–漂白粉消毒：将培养基浸泡在含氯漂白粉溶液中，可有效杀灭细菌和病毒，但对芽胞等耐热菌种效果较差。
–过氧化氢消毒：过氧化氢具有较强的氧化作用，能高效杀灭各类细菌、真菌和病毒。
•紫外线消毒–使用紫外线灯照射培养基，能够有效杀灭细菌和病毒，并且不留化学残留物。
现代方法•高压蒸汽灭菌器–利用高温高压蒸汽将培养基进行灭菌，能够杀灭各类细菌、真菌和病毒，是常用的消毒方法之一。
•微波消毒–将培养基放入微波炉中加热，微波的热效应能够迅速杀灭细菌和部分病毒，对培养基的营养成分的破坏较小。
•红外线消毒–使用红外线灯照射培养基，能够快速升温并杀死细菌和病毒，无需预热时间，操作方便。
•化学消毒剂–可选择合适的化学消毒剂，如过氧化氢、酒精等，根据需要选择合适的浓度和时间进行消毒。
注意事项•在进行培养基消毒灭菌时，应注意个人的防护措施，如佩戴手套、口罩和护目镜等，以防止化学物品或高温对人体的伤害。
•不同的菌种对消毒灭菌的耐受性不同，要根据具体情况选择合适的消毒方法和消毒剂。
•消毒前要对培养基进行清洁，去除表面的污物和杂质，以增加消毒的效果。
•对于高温消毒方法，要根据菌种的特性和对温度的耐受性进行合理的调整，避免过高的温度造成培养基成分的损失。
以上是几种常见的培养基消毒灭菌方法，选择合适的方法可以有效杀灭细菌和病毒，保证培养基的无菌状态，为后续的实验工作提供可靠的基础。
在使用任何消毒方法时，务必遵循安全操作规程，确保自身安全以及实验的准确性。
特殊情况下的消毒方法•酒精灯–对于一些对高温敏感的菌种或需要进行局部消毒的情况，可以使用酒精灯进行消毒。
组织培养中的灭菌
组织培养时各种灭菌特点2007-12-11常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。
这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。
1、培养基用湿热灭菌培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。
高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。
在0.1mpa的压力下，锅内温度达121℃。
在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。
高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。
常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05mpa 时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。
关阀再通电后，压力表上升达到0.1mpa时，开始计时，维持压力0.1-0.15mpa，20分钟。
按容器大小不同，保压时间有所不同，见表1。
该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字，如果容器体积较大，但是放置的数量很少，也可以减少时间。
到达保压时间后，即可切断电源，在压力到0.5mpa，可缓慢放出蒸汽，应注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。
当压力降到零后，才能开盖，取出培养基，摆在平台上，以待冷凝。
不可久不放气，引起培养基成分变化，以至培养基无法摆斜面。
一旦放置过久，由于锅炉内有负压，盖子打不开，只要将放气阀打开，大气压入，内外压力平衡，盖子便易打开了。
对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种工具，可以延长灭菌时间或提高压力。
而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。
培养基的湿热灭菌
培养基的湿热灭菌在发酵过程中，培养基灭菌主要有以下几个原因：如不灭菌，会使生物反应的基质或产物，因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降;杂菌也会产生代谢产物，这就使产物的提取更加困难，造成得率降低，产品质量下降;杂菌大量繁殖后，会改变反应液的pH值，使反应异常;有些杂菌会分解产物，使生产失败;如果发生噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，使生产失败。
灭菌方法分类(一)化学物质灭菌原理：药物与微生物细胞中的成分反应，使蛋白质变性酶失活。
使用范围：器皿、双手和实验室、无菌室的环境灭菌，不能用于培养基灭菌。
常用的灭菌剂：甲醛 37% 戊二醛 2% 高锰酸钾 0.1%-0.25% 苯酚 0.1%-0.15%漂白粉 5% 过氧乙酸 0.02%-0.2% 酒精 75% 焦碳酸二乙酯0.01%-0.1% 煤酚皂(来苏尔) 1%—5%(二)辐射灭菌辐射灭菌的原理是利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。
常用的有紫外线、X射线和γ射线。
用于室内空气及器皿表面灭菌。
(三)干热灭菌灭菌原理是利用高温对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。
常用灼烧和电热箱加热，140-180℃ 1-2小时。
适于对玻璃及金属用具及沙土管灭菌。
(四)湿热灭菌灭菌原理是直接用蒸汽灭菌，蒸汽在冷凝时能释放出大量潜热，蒸汽具有强大的穿透力，破坏菌体蛋白和核酸的化学键，使酶失活，微生物因代谢障碍而死亡。
水煮常压灭菌：100℃。
或饱和蒸汽灭菌：一般121℃，30分钟。
适合培养基和发酵设备灭菌。
(五)过滤除菌除菌原理是利用微生物不能透过滤膜除菌。
方法是使用0.01~0.45 mm孔径滤膜，用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。
在工业生产中，对于培养基、管道、设备的灭菌，通常采用蒸汽加热到一定的温度，并保温一段时间的灭菌方法，称之为湿热灭菌。
培养基湿热灭菌的显著优点是：使用方便，无污染，而且其冷凝水可以直接冷凝在培养基中，也可以通过管道排出。
培养基的灭菌
比较各种微生
物对热的抵抗 能力大小
营养细胞、芽孢、病毒或孢子
6、火焰灭菌法 二、培养基的灭菌
湿热灭菌原理
灭菌条件 灭菌不利方面
火焰 适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口
酒精灯
由于蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时 会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而 杀死各种微生物。
121℃， 30min。
同时也会破坏培养基中的营养成分，甚至会产 生不利于菌体生长的物质。因此，在工业培养过程
t 1 ln N 0 2.303 lg N 0 K Nt K Nt
从上述的微生物对数死亡规律和非对数死亡动力学模型方程式可知， 如果要达到彻底灭菌，即灭菌结束时残留的活微生物数等于0，则所 需的时间应为无限长，这在实际中是不可能的。灭菌
10
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25
三、微生物的热死规律和影响灭菌的因素
说说优缺点？
受热时间如何确定？
1、 微生物的死亡速率：对数残留定律
微生物受热死亡的原因，主要是因高温使微生物体内的一些重要蛋白质，如酶等， 发生凝固、变性，从而导致微生物无法生存而死亡。微生物受热而丧失活力，但其物理 性质不变。
在一定温度下，微生物的受热死亡遵照分子反应速度理论。在灭菌过程中，活菌数 逐渐减少，其减少量随残留活菌数的减少而递减，即微生物的死亡速率与任一瞬时残存 的活菌数成正比，
• 3、杂菌会大量繁殖，会改变反应介质的PH值，从而使生 物反应发生异常变化；
• 4、杂菌可能会分解产物，从而使生产过程失败； • 5、发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失败，
等等
问题2
1、为防止杂菌的污染，哪些需要灭菌？
培养基、发酵设备、空气、菌种制作
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培养基的湿热灭菌原理
由于培养基灭菌大多数用湿热灭菌，在这里我主要介绍湿热灭菌。
衡量热灭菌的指标很多，最常用的是“热死时间”，即在限定的温度下杀死原有微生物中一定比例所需的持续时间。
影响热灭菌的温度和时间的因素很多，包括：微生物种类、性质、浓度和培养基的性质、浓度等。
（一）热灭菌的原理
1、微生物的热阻
在这里先讲几个概念：
①致死温度：杀死微生物的极限温度。
②致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。
③微生物的热阻：表示微生物对热的抵抗能力，即指微生物在某一特定条件下（主要是温度）的致死时间。
其对热的抵抗能力越大，可以理解为热阻越大，衡量不同的微生物对热的抵抗能力的大小，可以使用相对热阻的概念。
④相对热阻：某一微生物在某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。
例如：芽孢/大肠杆菌=3000000/1；病毒/大肠杆菌=1—5/1等。
2、对数残存定律
微生物的湿热灭菌过程，其本质上就是微生物细胞内蛋白质的变性的过程。
因此，可以把灭菌过程看成是蛋白质的变性的过程，从这个意义上讲，灭菌过程应遵循单分子反应的速度理论，那么，则有下列方程：
-dN/dt = k * N
式中，N—残存的活菌数；t—灭菌时间（s）；K—灭菌速度常数（s-1），也称反应速度常数或比死亡速度常数，此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关；dN/dt—活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。
该方程称为对数残存定律，表示微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比。
3、理论灭菌时间的计算
将上式积分，转换得：
t=1/k×lnN
0/N
t
=2.303/K×lgN
/N
t
式中：N
—开始灭菌（t=0）时原有活菌数； Nt----经时间t后残存活菌数。
k：意义同上；t ：表示理论灭菌时间
k=（2.303/t）logN
t /N
；比死亡速率常数K，K值大，表明微生物容易死亡。
理论灭菌时间的计算需要注意以下几个问题：
（1）K值因不同的微生物种类不同、不同的生理状态、不同的外界环境，差别很大，实质上，它是微生物热阻的一种表示形式，微生物的热阻越大，K值也越小。
可以取耐热性芽孢杆菌的K进行计算。
(2)在计算过程中，N
0，N
t
如何取值？
N
为灭菌开始时培养基中活微生物数，可以参考一般培养基中的活微生物数为（1-2）×107个/ml； Nt 通常取 0.001个，既灭菌失败的概率为千分之一。
（3）上述灭菌时间，通常称之为理论灭菌时间，只可以用于工程计算中，在实践过程中，因蒸汽的压力问题（不稳定）、蒸汽的流量问题有很大差别，甚至培养基中的固体颗粒的大小、培养基的粘度等因素，都会影响灭菌效果，实际的设计和操作计算时间可作适当比例的延长或缩短。
在实际生产中，通常采用经验数值：间歇灭菌，121℃，20—30分钟；连续灭菌，137℃，15—30s，在维持罐中保温8—20分钟。
4、灭菌温度的选择
在培养基灭菌过程中，除了杂菌死亡，还伴随着培养基成分的破坏。
因此必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养基的破坏降低至最低的工艺条件。
许多实验研究结果表明，培养基在高温灭菌的过程中，其营养成分的破坏在很大程度上可以用一级反应来描述其反应速度：
式中—表示营养成分破环的速率，
C：表示营养成分的浓度
K'：为反应速度常数，1/s，应速度常数K'与温度的关系，可以使用阿累尼乌斯公式表示之：
K'= A'exp- △E'/RT (1)
式中—— K'：反应速度常数，1/S
A：反应的活化能（J/mol）
R：气体常数，1.987*4.18 J/mol*k
T：反应的绝对温度，k
同样，灭菌过程中的反应速度常数也可以用下式表示出：
K = A×exp[-E/RT] (2)
（1）、（2）式可以改写成下列形式：
lg(k,2/k,1) = E,/R×(1/T1 – T2 ) (3)
lg(k2/k1) = E/R×(1/T1 – T2 ) (4)
（3）（4）的意义是指：反应的温度从T1 升高到 T2 ，其反应的速度常数分别从k,1 增加到 k,2；k1 增加到 k2；
培养基的灭菌过程实际上是营养成分破坏、菌体死亡的两个平行性反应，对于平行性反应，反应温度的提高，其两个平行性反应的速度常数都增加，但增加的幅度（大小）却不同，其比值可以表示为：
lg(k2/k1)/lg(k,2/ k,1)= E / E, (5)
实验证明：营养成分为破坏的反应的活化能E的值为E, = 8.36—83.6*103 J/mol；而菌体死亡的活化能E芽孢：E = 418*103 J/mol；无芽孢：E = 209—250*103 J/mol。
显然，（5）式的比值〉1，说明提高温度对于第二个平行反应，即菌体死亡的反应是有利的。
提高温度，虽然两个平行性反应的反应速度常数都提高了，但是，达到同样的灭菌效果，所需要的时间却缩短了，由于第一个反应也就是营养成分破坏的反应速度常速增加的少，因此，有利于减少培养基在灭菌过程中营养成分的破坏。
换言之，高温短时灭菌对于培养基营养成分是有利的。
通常所说的高温短时灭菌可以提高生产效益，其理论根据就在于此。
结论1：当灭菌温度上升时，微生物杀死速率的提高要超过培养基成分的破坏速率的增加。
要减少营养成分的破坏，可升高温度灭菌。
结论2：在灭菌时选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到需要的灭菌程度，同时又可减少营养物质的损失。
（二）、影响灭菌效果的因素
（1）微生物种类：不同的微生物k值不同。
（2）初始菌量：在保持N值不变的前提下，t 与初始菌量N0的对数成正比。
（3）培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐热性。
(4)传热与混合状况：影响受热均匀度。
(5)培养基中固体颗粒的存在影响热穿透。
(6)蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度。
(7)pH：酸性pH下可加快微生物热死速率。