聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白
聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法分离血清蛋白质.
实验七聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法分离血清蛋白质一实验目的掌握聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法分离血清蛋白质。
二实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰化胺凝胶作支持物的一种区带电泳，由于此种凝胶具有分子筛的性质，所以本法对样品的分离作用，不全决定于样品各组分所带净电荷的多少，即在电泳开始阶段，由于不连续pH梯度的作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。
聚丙烯酰胺凝胶具有网状立体结构，很少带有离子的侧基，惰性好，电泳时，电渗作用小，几乎无吸附作用，对热稳定，呈透明状，易于观察结果。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的含有酰化胺基侧链的脂肪族大分子化合物。
三实验器材1、血清及其他蛋白质样品。
2、移液器。
3、稳压直流电源（500V）。
4、玻璃管0 .5cm×7-10cm(×10)。
5、灯泡瓶。
6、注射器10ml(×1)。
7、滴管。
8、培养皿10cm(×5)。
9、圆盘电泳槽。
10、量瓶25ml（×1）、10ml（×1）。
四实验试剂1、1mol/LHCL。
2、丙烯酰胺（Acr）：3、N，N，N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED):密封避光保存.可用N-二甲氨基丙腈或三乙醇胺代替,但效果较差.4、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis):5、三羧甲基氨基甲烷(简称Tris).6、过硫酸铵(A.R)(聚合用催化剂)7、0.05％氨基黑10B溶液:称取50mg溶于100ml水中.8、冰醋酸.9、0.05％溴酚蓝溶液:称取50mg溴酚蓝加水溶解并定容到100ml10、40％蔗糖。
11、20％蔗糖-溴酚蓝溶液：100ml20％蔗糖溶液加50mg溴酚蓝12、甘氨酸-Tris 缓冲液：称取甘氨酸28.8mg，Tris 0.6g加水定容至1000ml （pH8.3）13、1％考马斯亮蓝G250。
实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白
➢ 连接电极，上负下正； ➢ 浓缩胶：3mA／管，分离胶：4mA／管； ➢ 待示踪染料接近凝胶管底部约0.5cm处，切断电源。
剥胶
取下凝胶管，用注射器吸取一定量的蒸馏水，将针头插入胶柱-与管内壁之间 ，边注水边旋转玻管，直至胶柱与管壁分离，然后用洗耳球轻轻在玻管的一 端加压，使凝胶柱从玻管缓慢滑出，将凝胶柱置于干净的试管内，用蒸馏水 冲洗几次。
1、聚丙烯酰胺凝胶生成
催化Acr聚合成长链
TEMED催化AP生成硫酸自由基
Acr：丙烯酰胺 Bis：甲叉双丙烯酰胺 AP：过硫酸胺（催化剂） TEMED： N, N, N′,N′-四甲基乙二胺（ 加速剂）
Acr、Bis决定孔径大小 AP、TEMED决定聚合速度
Bis将单体长链连成网状结构
3
2、连续胶和不连续胶电泳
连续胶电泳
采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统（样品缓冲液、凝胶缓冲液 和电极缓冲液），在pH恒定、离子强度相同的条件下进行。
优点：
➢ 制胶简单、快捷 ➢ 缓冲液pH值恒定，可以防止样品进胶后因pH值改变发生的凝聚和沉淀 ➢ 缓冲系统组成简单，来源广泛
缺点：
➢ 分辨率不高
4
不连续胶电泳
采用不相同孔径的凝胶和不同缓冲系统的电泳方式，在电泳分离过程中，由 于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶界面上先浓缩成一窄带，然后 在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离。
一、实验目的
① 掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的原理； ② 学习聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的操作技术； ③ 了解血清蛋白的主要成份。
1
二、实验原理
➢ 不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白样品通过浓缩胶的浓 缩按分子大小排列成层，然后进入分离胶，随着电泳的不断进行 ，不同大小、电荷的蛋白质分子逐渐被分开。
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白质
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白质一、试验目的了解并掌握垂直板凝胶电泳的使用方法。
二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳是以聚丙烯酰胺凝胶做支持物的一种区带电泳，由于此种凝胶具有分子筛的性质，所以本法对样品的分离作用，不仅决定于样品中各组分所带净电荷的多少，也与分子的大小有关。
其次，聚丙烯酰胺凝胶电泳还有一种独特的浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH 梯度的作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。
聚丙烯酰胺凝胶具有网状立体结构，很少带有离子的侧基，惰性好，电泳时，电渗作用小，几乎无吸附作用，对热稳定，呈透明状，易于观察结果。
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂的作用下，聚合交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。
三、仪器和试剂仪器电泳仪、垂直平板电泳槽、微量注射器、灯泡瓶、移液器、染色与脱色缸、量筒、滴管。
试剂1. 丙烯酰胺(单体，简称Acr)2. 1%琼脂3. N，N，N，，N，—四甲基乙二胺(TEMED)4. N，N，—亚甲基双丙烯酰胺(交联剂，简称Bis)5. 过硫酸铵(聚合时的催化剂)6. 试剂A(pH8.9)：36.6g 三羟甲基氨基甲烷(Tris)和48mL 1mol/l HC l 混合加水至100ml7. 试剂B(pH 6.7)：5.98g Tris 和48ml 1mol/lHCl 混合加水至100ml8. 电极缓冲液：6.0gTris 和28.8g 甘氨酸混合加水至1000ml，用时稀释10倍9. 0.05%溴酚蓝10. 20%甘油11. 7%醋酸12. 1mol/l HCl13. 蛋白样品：人或动物血清四、操作步骤1.垂直平板电泳槽的安装先把垂直平板电泳槽和两块玻璃板洗净，晾干。
通过硅胶带将两块玻璃板紧贴于电泳槽(玻璃板之间留有空隙)，两边用夹子夹住。
将1%琼脂糖融化，冷至50℃左右，用吸管吸取热的1%琼脂沿电泳槽的两边条内侧加入电泳槽的底槽中，封住缝隙，冷后琼脂凝固，待用。
实验十一 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质
实验十一聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、目的1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳技术；2、掌握同工酶遗传标记的分析方法。
二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)，是以聚丙烯酰胺凝胶为作为支持介质的一种常见电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。
化学聚合法以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速器。
在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
由于同工酶的酶蛋白分子的大小和结构不同，携带的电荷种类和数量不同，所以可用凝胶电泳将它们一一分开。
在适宜酶催化反映的条件下提供酶作用的底物，再利用特殊的显色反应以显示产物的形成或底物的消失，就可以看到经电泳分离后的同工酶谱带。
同工酶的鉴定过程通常如下：1、从植物样品中提取粗酶液；2、聚丙烯酰胺凝胶电泳把样品中酶带分开；用专一作用底物和特殊染料把需要分析的酶染色，显示同工酶谱。
同工酶技术是通过电泳和组织化学方法进行特异性染色而把酶蛋白分子分离，并将其位置和活性直接在染色区带以酶谱的形式标记出来。
分离同工酶的方法有：电泳法、层析法、酶学法和免疫学其中以电泳法最为普遍，电泳法中又以垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率为最好。
聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种物理效应：1、样品的浓缩效应；2、凝胶的分子筛效应；3、一般的电泳分离的电荷效应。
三、仪器、设备、药品及材料仪器、设备：电泳仪、电泳槽、离心机、移液管、装凝胶用的玻璃管（内径为5mm、长度为90mm）。
垂直板电泳装置图药品：三羟甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr）、价差双丙烯酰胺（Bir）、甘氨酸、过硫酸铵（AP）、蔗糖、溴酚蓝、联苯胺、过氧化氢。
生物化学实验--聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质
聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质【目的】1 ．掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。
2 ．熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。
【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。
在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关。
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺（ Acr ）单体和少量交联剂 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺（ Bis ）在催化剂过硫酸铵（ Ap ）和加速剂四甲基乙二胺（ TEMED ）的作用下发生聚合反应而制得的（其化学结构式见第 2 篇第 1 章）。
聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。
根据血清蛋白分子量的大小，学生实验一般选用 7 ％聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分离物质（见第 2 篇第 1 章），使样品分离效果好，分辨率较高。
一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出 5 ～ 7 条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条来（图 3-4 ），是目前较好的支持介质，应用十分广泛。
图 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱根据凝胶支持物的形状不同，分为垂直板电泳和盘状电泳两种，二者原理相同。
本实验采用的盘状电泳是在直立的玻璃管中，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系，使样品在不连续的两相间积聚浓缩（浓缩效应）成厚度为 10 -2 cm 的起始区带，然后再利用分子筛效应和电荷效应的双重作用在分离胶中进行电泳分离。
【器材】1 ．电泳仪直流稳压电源，电压 400 ～ 500V ，电流 50mA 。
2 ．垂直管型圆盘电泳装置目前这类装置的种类很多，可根据不同的实验要求选择其中的一种。
这类装置均由两个基本的部分组成，一部分为载胶玻璃管，须选用内径均匀（ 5 ～ 6mm ） , 外径 7 ～ 8mm ，长 80 ～ 100mm 的玻璃管作为材料，也可以使用更细的玻璃管。
血清蛋白的分离——
（2）分离胶的制备
试剂名称 分离胶缓冲液（ph8.9） 分离胶凝胶贮液
蒸馏水
用量（ml) 2.5ml 5.0ml 2.5ml
将以上三种试剂混合均匀后， 置于真空干燥器中
过硫酸铵，置于真空干燥器 中，抽气10min
抽气10min 10.0ml
按上表格配胶，二者抽气后混合均匀，小心不 要在溶液中搅出气泡，以免过多接触空气。
(3) 浓缩胶制备（同垂直板）：
按垂直板的方案进行配制，配制好后，立
即加入到已配制好的分离胶上面至短玻璃板上 端约1cm，然后放于日光灯下10 分钟左右浓缩 胶就开始凝胶，30~50 分钟左右凝好（凝缩胶 变为乳白色为准）。
2.加样
将 电极缓冲液稀释10 倍后倒入电泳装置的上.下槽 中（注意需没过玻璃管的上下端），用微量注射 器通过缓冲液在每个玻璃管的凝胶表面加约5ul 的 样品
将分离胶上层的水倒去，再用滤纸吸去多余的 水（注意不要碰破胶面），为下一步做准备。
(3)浓缩胶制备：
试剂名称
用量（ml)
浓缩胶缓冲液（ph6.7)
0.5ml
浓缩胶贮液
1.0ml
40%蔗糖
2.0ml
将以上三种试剂混合均匀后， 置于真空干燥器中，
抽气10min
核黄素
0.5ml
按上表所示配胶，抽气后加核黄素0.5ml,混匀， 立即加入到已配制好的分离胶上面至短玻璃板 上端约0.5cm，插入加样梳，放于日光灯下10 分钟左右浓缩胶就开始凝胶，30~50分钟左右 凝好（凝缩胶变为乳白色为准），凝好后小心 拔去加样梳。
将缓冲液回收至试剂瓶中，还可用1-2 次 （注意将正负级的缓冲液分开回收）。
4.剥胶 将固定螺丝旋松，取出硅橡胶框，将一块
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS－聚丙烯酰胺凝胶 电泳分离血清蛋白质
一、பைடு நூலகம்的要求
1.学习电泳原理和技术
2.掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的工作原
理和操作方法
二、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联
剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺 (TEMED)和催化剂过硫酸铵((NH4)2S2O8 ，AP) 的作用 下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支
持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
TEMED(加速剂)
Acr(单体)+Bis(交联剂)
AP(催化剂)
凝胶
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有 电荷效应、分子筛效应。
电荷效应（电泳物所带电荷的差异性） 分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的 大小形状不同所致） PAGE同时还具有浓缩效应与体系的不连续性。
四、 操作步骤
固定玻板
制备分离胶 制备浓缩胶 加样 电泳
染色和脱色
1.安装夹心式垂直板电泳槽
安装好后，在长玻璃板下端与硅胶模框
交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂糖。其目 的是封住空隙，凝固后的琼脂糖中应避免有 气泡。
2、配制凝胶
7.5%分离胶 （10ml） DDW 30%Acr-Bis 4.85 2.5 3%浓缩胶 （5ml） 3.16 0.5
6 .染色与脱色
电泳结束后，取下凝胶模，卸下胶框，用小 刀或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下左上 角作为加样标记。加入染色液染色1-2 h，再用 脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰。
将楔子插进，将底部插紧
插入梳子
加缓冲液
加 样
电泳
剥胶
五、实验结果
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质Separating Serum Protein by PAGE一、目的1.把握聚丙烯酰胺凝胶电泳的大体原理2.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE）,是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采纳电泳基质的不持续体系（即凝胶层的不持续体系、缓冲液离子成份的不持续性、pH的不持续性及电位梯度的不持续性），使样品在不持续的两相间积聚浓缩成薄的起始区带（厚度1—2mm），然后再进行电泳分离。
聚丙烯酰凝胶电泳的进程中有三种物理效应：（1）样品的浓缩效应，（2）凝胶的分子筛效应，（3）一样电泳的电荷效应。
使样品分离成效好，分辨率高。
例如人血清用醋酸纤维素薄膜电泳（）能够分成5—7个成份，而用聚丙烯酰胺凝胶电泳那么可分成20—30条带清楚的成份。
下面就聚丙烯酰胺凝胶电泳说明三种物理效应的原理。
1、样品的浓缩效应：由于电泳基质的4个不持续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩然后再被分离。
（1）凝胶层的不持续性：两层不同的凝胶，其作用如下：浓缩胶：为大孔胶，样品在其中浓缩，并按其迁移率递减的顺序慢慢在其与分离胶的界面积聚成薄层。
分离胶：为小孔胶，样品在其中进行电泳和分子筛分离。
（2）缓冲液离子成份和电位梯度的不持续性：在浓缩胶当选择，电泳槽缓冲液pH为，HCl几乎全数释放出Cl-,甘氨酸（等电点在；羧基解离 pKa1=, 氨基—NH3+解离pKa2=）在此条件下有极少部份的分子（1—%）解离成为甘氨酸负离子NH2CH2COO-在下，大部份蛋白质都以负离子形式存在（大多数蛋白质等电点接近于）。
这三种离子都带有相同电荷，当电泳系统通过必然电流后三种离子同时向正极移动，而且它们的有效泳动率按以下顺序排列。
（有效泳动率=泳动率m·解离度d）m Cl d Cl>m蛋d蛋>m甘d甘依照有效率泳动率的大小，最快的称为快离子，最慢的称为慢离子，电泳刚开始时，两种凝胶都含有快离子，只有电泳槽中电泳含慢离子，电泳开始后，由于快离子的泳动率最大，就会专门快超过蛋白质，因此，在快离子的后面形成一离子浓度低的区域即低电导区。
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聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白[实验目的](1)学习聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳原理。
(2)掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。
(3)比较醋酸纤维薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白的操作效果。
[实验原理]带电质点在电场作用下，会向两极移动；带正电荷的移向负极，带负电荷的移向正极，这种现象称为电泳。
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N'，N'—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
[实验试剂]1、待测样品：新鲜血清2、制备分离胶、浓缩胶有关试剂：(1)凝胶缓冲液：称取1 mol/L HCl 48ml,Tris(三羟基氨基甲烷)36.6g,TEMED 0.23mL,加重蒸馏水至80mL 使其溶解，调pH8.9，然后加重蒸馏水定容至100mL ，至棕色瓶，冰箱储藏。
(2)分离胶贮液，一般有两种配法：ⅰ28％Acr-0.735％Bis贮液：丙烯酰胺28.0克，甲叉双丙烯酰胺0.735克,加重蒸馏水使其溶解然后定容至100mL.ⅱ30％Acr-0.8％Bis贮液:Acr30.0克,Bis0.8克,加重蒸馏水使其溶解定容至100mL.以上两种溶液需用棕色试剂瓶盛放,4℃储存,一般可放置一个月左右.(3)分析纯过硫酸铵(AP)(AR)0.14g加重蒸水100mL,棕色瓶,4℃储存仅能用一周,最好当天配置.上述三种试剂用于制备分离胶.(4)浓缩胶缓冲液:称取1mol/LHCL48mL,Tris5.98g,TEMED 0.46mL,加重蒸水至80mL,调pH6.7,用重蒸水定容至100mL,棕色瓶4℃储存.(5)浓缩胶贮液:称取Acr10g，Bis2.5g，加重蒸水溶解定容100mL，过滤后至棕色瓶4℃贮存。
(6)40％蔗糖溶液（W/V）(7)核黄素4.0mg,加重蒸水溶解,定容至100mL,棕色瓶4℃贮存.以上(4)-(7)4种溶液用于配置浓缩胶.3.Tris-甘氨酸电极缓冲液(pH8.3)称取Tris 6.0g,甘氨酸28.8g,加蒸馏水至900mL,调pH之后定容至1000mL,4℃贮存,使用前稀释10倍.4. 0.1％溴酚蓝指示剂.5.染色液染色液种类较多,染色方法也不完全相同,详细染色法如下:本实验采用0.05％考马斯亮蓝R250染色液中,含20％磺基水杨酸,其优点是染色固定同时进行,背景易脱色.0.05％考马斯亮蓝R250的20％磺基水杨酸染液:考马斯亮蓝0.05g,磺基水杨酸20g,加蒸馏水至100mL,过滤后至试剂瓶内保存.6.脱色液0.1mol/lNaCl溶液7.保存液甘油10mL,冰乙酸7mL,加蒸馏水至100mL8.1％琼脂糖溶液琼脂1g,加已稀释10倍的电极缓冲液,加热溶解,4℃贮存备用，使用时取出加热成液体，待稍微冷却后用胶头滴管吸取使用，胶头滴管使用完后立即清洗干净.[实验仪器]夹心式垂直板电泳槽，样品槽模板，直流稳压电源（电压300—600V，电流50—100mA），吸量管（1mL，5mL，10mL），烧杯，细长头滴管，1mL注射器及6号长针头，微量注射器，水泵或油泵，真空干燥器，培养皿（直径120mm），玻璃板，日光灯一台[实验步骤]一、安装夹心式垂直板电泳槽夹心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏，其装置如图1.导线接头2.下贮槽3.凹形橡胶框 1.样品槽模板 2.长玻璃板4.样品槽模板5.固定螺丝6.上贮槽 3.短玻璃板 4.凹形橡胶框7.冷凝系统各部件依下列顺序组装:(1)装上贮槽和固定螺丝，勿使上下贮槽在外连通，使用橡皮管时用夹子夹住.(2)玻璃板洗净后用吹风机吹干，清洗玻璃板时不得用刷子刷，可用纱布或海绵擦洗，以免在玻璃表面上留下刮痕，清洗后不得用纸或布擦干，将长短玻璃板分别插在硅相框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。
(3)将已插好玻璃板的橡胶框平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。
(4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线方式旋紧螺丝帽。
(5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅模框交界的缝隙内加入已融化的1％琼脂，其目的是封住空隙，凝固后的琼脂应避免里面有气泡。
二、配胶目前用于PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）凝胶贮液有30％Acr-0.8％Bis及28％Acr-0.735％Bis 2种，以它们为母液可以配置不同浓度的分离胶。
不同浓度的分离胶及浓缩胶配置方法见下表：三、制备凝胶板PAGE有连续体系和不连续体系，其灌胶方式不完全相同，分别叙述如下：a)连续体系本实验采用28％Acr-0.735％Bis 凝胶贮液，从冰箱取出各种贮液，平衡至室温后，按上表的配比配制20mL 7.0％凝胶。
前三种溶液混合在一小烧杯内，（3）号液单独放置一小烧杯。
二者抽气后混合均匀，立即用细长头滴管将分离胶溶液加到凝胶膜长、短玻璃板间的夹缝内，当加至距离短玻璃板上缘约0.5cm时，停止加胶，轻轻将样品槽模板（梳子）插入。
在上、下贮槽中倒入蒸馏水，液面不能超过上贮槽的短玻璃板，防止蒸馏水进入凝胶之中。
作用是增加压力，防止凝胶渗漏。
凝胶液在混合后15min开始聚合，约30min-1h完成聚合作用。
聚合后，在样品槽模板梳齿下缘与凝胶界面间有折射率不同的透明带。
看到透明带后继续放置半小时，再用双手取出样品槽模板，动作要轻，用力均匀，以防弄破加样凹槽。
凹槽中残留液体可用窄滤纸条轻轻吸取，切勿插进凝胶中，应保持加样槽凹面平整。
放掉上、下贮槽中的蒸馏水，在上下两个电极槽倒入电极缓冲液，液面应没过短玻璃板上方约0.5cm。
b)不连续体系不连续体系采用不同孔径及pH的分离胶与浓缩胶，凝胶制备分两步进行。
i.分离胶制备：根据实验要求，本实验需20mL pH8.9 7.0％PAA溶液，配置方法见凝胶配置表。
其加胶方式不同于连续体系。
混合后的凝胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板的狭缝内，加至距离样品模板梳齿下端约1cm。
用1mL注射器在凝胶表面轻轻加一层重蒸馏水,用于隔绝空气,使胶面平整,为防止渗漏,在上、下贮槽中加入略低于胶面的蒸馏水，上下槽两侧加入25o C～30o C温水，有助于凝胶。
约30min-60min凝胶完全聚合，可以看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线，用滤纸吸去多余的水，但不要碰破胶面。
ii.浓缩胶的制备：浓缩胶为3.75％PAA，其配制方法见凝胶配置表。
即（4）︰（5）︰（6）︰（7）=1︰3︰3︰1。
混合均匀后用细长头的滴管将凝胶溶液加到长、短玻璃板的窄缝内（即分离胶上方），距短玻璃板上端0.5cm处，轻轻加入样品槽模板。
在上、下贮槽中加入蒸馏水，但是不能超过短玻璃板上缘。
在距电极槽10cm处用日光灯或者太阳光照射，进行光聚合，但是不要造成大的升温。
凝胶由淡黄透明变成乳白色，则表示聚合作用开始。
继续光照，使凝胶完全聚合，聚合完成后放置30-60min，轻轻取出样品槽模板，用窄滤纸条吸去凹槽中多余的液体，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5cm，即可加样。
注：本次试验采用不连续体系，以达到较好的分离效果四、加样用微量注射器取5微升样品，通过缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。
五、电泳将直流稳压电泳仪的正极与下槽相连，负极与上槽连接。
接通冷却水，打开电泳仪开关，开始时将电流调至10mA。
待样品进入分离胶时，将电流调至20-30mA，当蓝色染料迁移至距离橡胶框下端1cm时，电泳完成。
关闭冷却水开关及电源。
收集上、下贮槽电极缓冲液，取出硅胶框，用钢铲轻轻将一块玻璃撬开移走，将凝胶板置于大培养皿中染色。
六、染色本实验用0.05％考马斯亮蓝R250染色液，染色与固定同时进行，染色时加热，染色30min 左右。
七、脱色用0.1mol/L的NaCl浸泡漂洗数次，直至背景蓝色褪去，但注意不要过久，能看清楚蛋白质带即可。
[注意事项]1.器材不洁净会影响凝胶聚合，所有器材均应严格清洗。
玻璃板应浸泡在重铬酸钾洗液3-4h 或0.2mol/L KOH的酒精溶液中20min以上，用清水冲洗，再用纱布或海绵蘸洗涤液洗净，最后用蒸馏水冲洗干净，直接阴干或者用吹风吹干。
2.用琼脂封底和灌胶时不能出现气泡，以免影响电泳时电流的通过。
3.取出样品槽模板以及用滤纸吸取多余液体时应注意不能弄破胶面，动作要轻，用力要均匀。
4.电泳时正负极不能接错。
[思考题]1.为什么要在样品中加入含少许溴酚蓝的40％蔗糖溶液？蔗糖及溴酚蓝的用途各是什么？2.上、下电极缓冲液电泳后，能否混合存放？为什么？3.根据实验过程的体会，总结做好聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的关键步骤有哪些？[评分标准]1.按时上课：+5；2.实验台卫生：+10；3.实验操作：+25；4.预习报告：+10；5.实验报告：①实验现象、图样描述（+15）；②思考题的分析解答（+20）；③实验心得（+5）（自评、互评）；④实验日志（+10）盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白(选学)【目的和要求】1.掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。
2.学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术，包括制胶、灌胶、加样、电泳、剥胶、染色及脱色等。
3.了解盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用，利用盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质和血清球蛋白-血清清蛋白-铁氧还原蛋白的混合液。
【实验原理】盘状聚丙烯酰胺凝胶，是由丙烯酰胺单体和少量的交联剂甲叉双丙烯酰胺，在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。
改变单体的浓度或单体与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，将次凝胶灌装于直立的玻璃管中，再加样品，进行电泳分离，称为盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳。
一般常采用7.5%的盘状聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，2.4%的分离核酸。
盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳又常分为两大类，第一类是连续的凝胶电泳，第二类是不连续的凝胶电泳不连续的凝胶电泳亦可称为盘状电泳。
在这种电泳过程中，除去一般的电荷效应外，还有两种物理效应：（1）凝胶对样品分子的筛选效应：颗粒小，形状为圆球形的样品分子，移动较快；颗粒大形状不规则的样品分子，通过凝胶孔洞时受到的阻力较大，移动较慢。
（2）不连续系统对样品的浓缩效应：高度的浓缩效应，大大提高电泳分离的分辨率，特别适用于稀浓度的样品的分离。
【实验试剂与仪器】试剂：新鲜不溶血的动物细胞，凝胶缓冲液（pH=8.9），分离胶缓冲液（28%Acr-0.735%Bis），浓缩胶缓冲液（pH=6.7），浓缩胶贮液，过硫酸铵溶液（当天用当天配置），核黄素铵溶液，40%蔗糖溶液，Tris-甘氨酸电极缓冲液（pH=8.3），0.1%溴酚蓝指示剂，染色液，脱色液。