植物病理学高级实验技术指导
农业植物病理学实验指导
农业植物病理学实验指导农业植物病理学是农业生产中极为重要的学科之一，其研究的是农作物疾病的发生与预防。
为了更好地培养学生的病理实验操作能力，本文将提供一份简单的农业植物病理学实验指导。
1. 实验一：植物病原菌的分离和鉴定实验目的：掌握分离与鉴定植物病原菌的方法，理解病原学的基础概念。
实验原料：感染有病征的植株、消毒剂、无菌玻璃棒、琼脂、静置培养皿、荧光显微镜。
实验步骤：1. 从感染病株中取样。
用无菌玻璃棒在感染病株的表面轻刮几次，然后在无菌培养基上划一条线。
2. 将无菌玻璃棒沾上感染样品，并将其划到无菌培养基上，将其密封，将其放入37℃的温室中培养3-5天。
3. 检查接种坛中的细菌单个斑点，清除任何后来发现的杂细菌，然后进行细菌鉴定，以识别不同的菌株。
使用荧光显微镜和其他实验技术来确定不同的菌株。
实验结果：1. 获得了可研究的植物病原菌。
2. 学生理解了病原学的概念和关键技术。
2. 实验二：植物病害综合鉴定实验目的：应用综合鉴定法确认植物病害。
实验原料：受感染的植物样品，显微镜、手镰、组织切片、滴定管、生长瓶、测试器。
实验步骤：1. 阐述农业病害发生的原因和病害的分类。
培养出病原菌后，学生将初步考虑在何种植物病害范围内进行综合鉴定。
2. 制备切片，利用显微镜查看组织细胞的变化，以确定该病是有效的。
3. 测试样品以确保它是含有特征性病原体的。
除了使用显微镜查看组织切片外，还可以使用滴定管和生长瓶来测试样品的pH、氧含量、有机成分等信息。
4. 将所有数据纳入综合考虑，从而确定植物病害的类型、发展和所需的病虫害防治措施。
实验结果：1. 确定了植物病害的类型和发展。
2. 学生掌握了植物病害检测的重要步骤。
3. 实验三：生物防治法实验目的：为学生提供基本原则和技术，了解生物防治如何减少植物病虫害的损失。
实验原料：扁豆种子、法国圆白菜的幼苗、甜菜虫、灰蝉、昆虫脂肪。
实验步骤：1. 学生准备研究模型—扁豆或法国圆白菜幼苗，然后在其中一部分植物上覆盖甜菜虫或灰蝉，让它们大肆繁殖和吃掉幼苗。
《农业植物病理学》实验教学大纲
《植物病理学》实验教学大纲
课程类型：专业基础课、选修
适用专业：作物本科生专业基础课
总学时：10
一、制定本课程实验大纲依据
依据植物病理学教学计划和教学大纲要求，为达到教学目的和要求而制定。
二、本课程实验教学的作用
要求学生掌握每一个实验的基本内容，学会鉴定各种农作物病害、病原物方法，通过理论与实践相结合学会应用原理解决实践问题。
三、本课程教学目的及学生能力标准
1、通过实验教学进一步掌握部分植物病理学的基础，加强学生对病害的症状和
病原识别。
2、实验教学使学生掌握鉴定病原物、识别病害的方法。
3、通过本课程学习，使学生能够正确的识别和鉴定各种农作物生产上的主要病
害。
4、通过实验教学培养学生动手能力，加强学生基本技能的训练，培养学生分析
问题和解决问题能力。
四、学时分配、教学形式及实验性质：
1、学时分配：总学时为40学时，其中实验课10学时。
2、教学形式：
1）讲课与实验相结合。
实验课上讲述植物病害的症状特点、病原物的形态特征，指导学生独立完成实验过程；
2）以培养学生动手能力、分析问题和解决问题能力为主；
3）新鲜标本、盒装标本、浸制标本、挂图、病原玻片等多种手段。
3、实验性质：为应用性实验。
五、实验成绩评定：
根据学生在实验中的表现及实验完成情况，并结合实验报告情况综合平分。
实验成绩单独记分。
六、实验项目、内容及学时分配表：
七、教材：
1、《普通植物病理学实验指导》许志刚编农业出版社
2、《农业植物病理学实验实习指导》李洪连主编中国农业出版社.。
植物病理学 实验1 植物病害症状观察 图文
苹果灰霉腐烂病
玉米干腐病
萎焉
番茄青枯病
黄瓜青枯病
西瓜萎焉病
畸形
泡桐丛枝病
马铃薯癌肿病
西瓜根结线虫
粟白发病
1. 粉状物
病症的主要类型
小麦黑粉病
十大功劳白粉病
玉米黑粉病
2. 霉状物
草莓灰霉软腐病
桃褐腐病
樱桃根霉软腐病
葡萄霜霉病
3. 点状物Leabharlann 山茶花灰斑病甜瓜蔓枯病
4. 颗粒状物
甘蓝菌核病
花椰菜菌核病
实验一 植物病害症状观察
1、实验目的
识别一些植物病害的症状（包括病状和 病症）类型； 正确理解症状在病害诊断中的作用。
主要病状类型
变色1
烟草花叶病（花叶）
长春藤黄化(花变色)
变色 2
长春藤病毒（脉明）
郁金香的碎锦
南瓜绿斑驳病
坏死
高粱炭疽病
水稻胡麻斑病
玉米大斑病
水稻白叶枯病
腐烂
辣椒疫病
梨轮纹病
5. 脓状物——细菌病害的病症
水稻白叶枯病 （ 叶枯、 菌脓）
豆薯叶斑病(水渍状)
实验报告内容：
从供观察的植物病害标本中选择10种，描 述其症状特点。
农业植物病理学实验室守则及实验指南
农业植物病理学实验室守则及实验指南
一、实验须知
1、实验前须充分预习实验指导书的内容，明确本次实验的目的要求，准备好当次实验所需用具。
2、实验操作要细心谨慎，认真进行观察，独立完成实验作业。
3、实验用品和材料用后必须放回原处，以免丢失，也方便他人取用，对于需清洁的用具须及时清洁。
4、实验仪器设备等由于操作不当或其他原因等引起损坏或遗失的，应及时登记并按照学校有关规定处理。
5、实验完毕应将仪器放回原处，擦净桌面，收拾整齐。
离开实验时注意关闭门、窗、水、灯等。
二、实验指南
农业植物病理学实验是农业植物病理学课程的重要组成部分，目的是以植物病理学和其它相关学科知识为基础，追溯引起植物病害发生的原因及过程，认识不同病原所致病害的症状特点及病原形态特征。
掌握植物病害实验及研究的基本技能及方法，注重学生观察、思考、分析、解决实际问题的能力培养，为将来的研究工作打下基础。
本实验适用于植保学科各专业方向（植物病理学、植物检疫学、农业昆虫学等）《农业植物病理学》课程的实验教学，共分为9次实验，30个学时，前1～7次实验，重点要求学生认识和掌握水稻、麦类、棉花、杂粮、烟草、油料作物、果树和蔬菜病害等的症状和病原物的形态特点、学习显微绘图、制片技术；实验8～9为综合型实验，要求学生掌握田间一般病害的诊断和鉴定方法，以及学会田间病害调查方法，做到将所学知识真正应用到生产实践中。
要求学生在实验课前预习实验指导，明确实验的目的意义，复习实验相关理论知识，了解实验的方法、步骤及重难点；实验课上在教师指导下，按照要求的内容和方法，认真、独立地进行实验，分析实验数据和结果，认真完成实验报告，总结实验所得并找出实验中不足之处的原因，培养严谨的科学态度。
植物病理学实验实验七、侵染性病害侵染过程的观察
苗龄达到 1叶1心叶
接种
潜育期 约8天后开始现斑
作业
1.写出烟草花叶病毒病接种的简要步骤，并说明其 原理，记载并分析结果。
2.写出小麦条锈病菌接种的简要步骤，调查小麦条 锈病菌的潜育期、寄主反应型、病害普遍率、严 重度，计算发病率和病情指数，并将结果记入下 表。
小麦条锈病接种试验结果
用研钵将烟草花叶病毒源研成匀浆； 3.在健康叶片正面撒上依稀可见的800目金刚砂； 4.用洗净的手指蘸少许毒源匀浆，在健康的烟草叶
片上摩擦三次（不要用力过大）。同时用清水摩 擦作对照，注意应先作对照摩擦试验，后做病毒 汁液摩擦接种，以免对照感染TMV； 4.用洗瓶冲掉叶面上残留的汁液； 5.将接种后的烟草苗放于温室中进行培养观察。
实验七
侵染性病害侵染过程 的观察
一、实验目的
1.学习侵染性病害病原接种方法。 2.了解植物病害的侵染过程。
二、实验材料
1. 温 室 培 养 好 的 3-4 叶 期 烟 草 ， TMV毒源（感染TMV的烟叶）， 800目金刚砂，研钵，洗瓶等。
2.温室培养好的3-4叶期铭贤169 小麦苗；吐温-20；小麦条锈病 菌毒性小种；喷壶等。
品种名 称
潜育期（天）
反应 型
普遍率（％） 严重度（％） 病情指数（％）
接种日期： 月
日 调查日期：
月
日
小麦条锈病菌接种
➢小 麦 条 锈 病 病 原 物 为 条 形 柄 锈 菌 （Puccimia striiformis），担子菌门柄锈菌 属。
条锈菌菌种繁殖的主要步骤
种苗 1.喷雾法 2.撒粉法
菌种
有活性的新鲜孢子 量比：1：3
步骤
接种 潜育 收菌
植物病理学
1.材料 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或卡尔酵母(Saccharomyces calsbergensis)培养2天左右的麦芽汁(或豆芽汁)液体培养物。
2.试剂 0.05％和O.1％吕氏碱性美蓝染色液。
3.器材 显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、洒精灯等。
2.Schaeffer与Fulton氏染色法
（1）涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。
（2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过2—3次。
（3）染色：
①加染色液：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），染色；染色时间5分钟，其间，不时地将玻片置于酒精灯火焰上方微微加热，但不可过分加热或使染色液干涸，必要时，将玻片离开火焰、略冷却后补加染液。
实验一 酵母菌子囊孢子形态的观察（3学时）
实验二 酵母细胞的固定化技术(3学时）
实验三 化学因素对微生物生长的影响（3学时）
附加 培养基的配制与灭菌
实验四 细菌芽胞的观察（3学时）
酵母细胞固定化技术
一、 实验原理
固定化酶和固定化细胞是利用各种不同方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、吸附法和结合法。一般来说，细胞更适合采用包埋和吸附法固定化。这是因为细胞个大，而酶分子很小；个小的酶容易从凝胶孔径中漏出。
（4）涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上，做成涂面，晾干。
（5）固定：将涂片通过酒精灯火焰3次。
（6）脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。
（7）复染：加蕃红水溶液染色5min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。
（8）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜观察。
植物病理学实验实验五、植物病害标本采集及病原鉴定
Common Powdery Mildew Genera
球针壳属
Phyllactinia
叉丝壳属
Microshe
Uncinula
单丝壳属
叉丝单囊壳属
Sphaerotheca
Podosphaera
霜霉目霜霉科分属检索表
1. 孢囊梗粗壮，顶端分枝不规则，粗而密，寄生于禾本科植物 …………………………指梗霉属（Sclerospora）(谷子白发病) 1’. 孢囊梗细长，并有规律的分枝 2. 分枝末端膨大呈盘状，盘的边缘生小梗，梗上产生孢子囊 ………………………………盘梗霉属（Bremia）（莴苣霜霉病） 2’. 分枝末端不膨大 3. 孢囊梗单轴分枝，与主梗近直角，分枝末端平钝 …………………………单轴霉属（Plasmopara）（葡萄霜霉病） 3’. 孢囊梗非单轴分枝 4. 孢囊梗二叉状分枝，孢子囊无乳状突起 …………………………霜霉属（Peronospora）（白菜霜霉病） 4’. 孢囊梗先单轴分枝一次，然后不完全对称二叉状分枝，孢子囊有乳状突 起……假霜霉属（Pseudoperonospora）（黄瓜霜霉病）
实验五 植物病害标本采集及病原 鉴定
一、实验目的
学习植物病害的诊断方法。 熟悉和掌握植物病害标本采集的方法和注意事 项。 学习和掌握植物病害病原鉴定的方法。 熟悉临时玻片的制作方法。
二、实验材料和用具
标本夹、剪刀、塑料袋、显微镜、载玻片、盖 玻片、切片用刀片、挑针、擦镜纸、吸水纸、 蒸馏水等。
1
2
3
1. 2. 3. 4. 5.
4
指梗霉属（Sclerospora) 盘梗霉属(Bremia) 单轴霉属(Plasmopara) 霜霉属(Peronospora) 假霜霉属 (Pseudoperonospora)
植物病理学实验实验半知菌类真菌及其所致病害
玉米纹枯病 (Maize Sheath Blight)
玉米纹枯病发病叶片
玉米纹枯病发病叶鞘
玉米纹枯病病 苞叶上的菌核
丝核菌属
水稻纹枯病菌
轮枝孢菌
作业
1.绘制芹菜斑枯病菌分生孢子器和分生孢子； 2.绘制高梁炭疽病菌分生孢子盘、分生孢子和
刚毛； 3.绘柑桔青霉病菌分生孢子梗和分生孢子。
植物病理学实验实验半知菌类真菌及其所 致病害
一、实验目的
掌握半知菌中主要病原菌丛根孢菌、球壳孢菌、 盘梗孢菌和丝核孢菌（芽孢纲、丝孢纲、腔孢 纲）的主要形态特征及其所致主要病害的症状 特点。
熟悉和掌握切片的制作方法。
二、实验材料和用具
半知菌病原玻片及其所致植物病害标本； 显微镜、载玻片、盖玻片、切片用刀片、挑针、
Rhizoctonia cerealis
小麦纹枯病基部叶鞘症状 小麦纹枯病中上部叶鞘症状 小麦纹枯病病茎
小麦根腐病症状
镰刀菌属
水稻恶苗病
玉米镰刀菌穗粒腐病
玉米茎腐病 (Maize Stalk Rot)
禾镰刀菌(Fusarium graminearum)、 串珠镰刀菌(F.moniliforme)和瓜果 腐霉菌(Pythium aphanidermatum) 混合侵染
麦类白粉病田间症状
麦类白粉病病叶
麦类白粉病病穗
麦类白粉病病原
Erysiphe graminis (D.C.) f.sp. tritici
麦类赤霉病 (Wheat Scab)
小麦赤霉病病粒
小麦赤霉病病穗
Fusarium graminearum
小麦纹枯病 (Wheat Sharp Eyespot)
擦镜纸、吸水纸、蒸馏水等。
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管平躺，30℃ 60rpm 2-3h。 酶解过程中应吸取菌液镜检，检查原生质体是否释放；酶液需现配现用，PH 值很
关键，需用低浓度（0.1M）的 NaOH 调 PH 至 5.8。 * 以下步骤于 4℃下完成，0.7M NaCl 溶液,1ⅹSTC 先放于 4℃预冷。 6、取出酶解液，加少许 0.7M NaCl 溶液，轻轻摇晃，倒于三层擦镜纸过滤，用 0.7M
CaCl2
4、TB3
Autoclave
3g
Yeast Extract
3g
Casamina Acids
20%
Sucrose
Add ddH2O to 1L for solid media add agar to 0.65-0.75% Autoclave 5、PTC
60% （w/v）
PEG4000 in 1ⅹSTC
第一部分 真菌学实验技术
实验一 稻瘟病菌转化（Transformation of Magnaporthe grisea）
一．原生质体的制备（Protoplasting） 1、活化菌株，接种菌丝块(2mm×2mm)于 CM 平板上生长 6d 左右，菌落直径约 3cm，
菌株不宜太老，最好不要超过 12 d。 2、切取直径约 3cm 的菌落，尽量切碎，置于约 100ml CM/5ⅹYEG 的液体培养基
Add ddH2O to 100ml Store in a dark glass bottle at 4℃
2、5ⅹ YEG
5g
Yeast Extract
10g
D-Glucose
3、1ⅹ STC
Add ddH2O to 1L Autoclave
20%
Sucrose
50mM
Tris•Cl PH 8.0
50mM
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静置时间不宜过长，PTC 对原生质体会有毒性。加好后去解冻 TB3 固体培养基 3、把原生质体加到 10ml 左右熔化后冷却至 45℃-55℃的 TB3 固体培养基中（含 50ug/ml Amp），轻轻混匀后倒入培养皿中 28℃黑暗培养 24h 培养基温度越低越好，解冻后放于 45℃水浴中防止其凝固；培养基的量也可多加， 分倒于多个皿中。 4、往培养皿中再倒入 10ml 含 300ug/ml HygromycinB 的 TB3 固体培养基（最好含 50ug/ml Amp） 5、28℃下黑暗培养 7-10d 后挑出转化子，一般 5d 后即可看出转化是否成功 6、在含 300ug/ml HygromycinB 的 TB3 固体培养基上再次筛选验证转化子。 ◆注意事项： 原生质体非常脆弱，操作过程中动作要轻 溶液配制要精确，需用ddH2O配制 器皿要绝对干净
在不同的细菌中，感受态的形成机制也有所不同。对于枯草芽孢杆菌来说，自然感 受态是对数生长后期在一种二元信号转导系统的调节下形成的，需要一系列相关基因的 表达。按照这些基因的功能和表达时间的先后，它们被分为早期感受态基因和晚期感受 态基因。其中早期基因主要对感受态的形成起调节作用，并进一步促使晚期感受态基因 的表达。而后者主要负责细胞对外源DNA的吸附、吸收和重组。在枯草芽孢杆菌中如果 感受态形成基因缺失则会导致转化的困难。 二、实验材料： 受体菌株：Bacillus subtilis 168 待转化质粒：pAD43-25（Cm+,Amp+）(此质粒是穿梭质粒，在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌 中都可以复制,并能组成性表达GFP) 培养基：LB液体和固体培养基 其他材料：（以下物品均需灭菌） 1.5mL 离心管，枪头，空试管，涂布棒，培养皿等
试剂： 1，SPI－A Salts Solution：（100 ml Solution） 0.2％ (NH4)2SO4 1.4% K2HPO4·3H2O 0.6% KH2PO4 0.1% Trisodium Citrate Dihydrate (柠檬酸三钠) pH=7.2 121 ℃灭菌20 min 2，SPI－B Salts Solution：（100 ml Solution） （1），5% MgSO4·7H2O （5 g MgSO4·7H2O加双蒸水定容到100 ml） 121 ℃灭菌20 min （2），100× CAYE Solution：（100 ml Solution） 2％ Casamino acid 2 g 10％ Yeast Extract 10 g 121 ℃灭菌20 min （3），50％Glucose（葡萄糖）（单配，50％W，即125g/250ml 溶液，115℃灭菌20 min） 3，50 mM CaCl2 （单配，121℃灭菌20 min）[100 ml: 0.073 g 的CaCl2·2H20（MW:147.02）
漏斗 烧杯 玻璃棒 培养皿等。以上器材全需湿热灭菌处理，全部操作于超净工作台中完成。
第二部分 细菌学实验技术
第二部分 细菌学实验技术
实验一 枯草杆菌化学感受态制备及转化方法
自然条件下，很多细菌均可以从外界环境中摄取外源DNA，使之获得新的遗传变异， 从而更好的适应环境条件。当然，枯草芽孢杆菌也不例外。在分子生物学高速发展的今 天，通过人工的方法也可以使细菌获得从外界摄取外源DNA的能力，从而使受体菌获得 新的遗传性状，这一过程叫做转化（Transformation）。枯草芽孢杆菌的转化有多种方 法，比如化学转化，电转化，原生质体转化等，但目前比较常用的是化学转化方法。 一、原理：
Ⅱ*、1000ⅹTrace Elements:
Store at 4℃
80ml
ddH2O
2.2g
ZnSO4•7H2O
1.1g
H3BO3
0.5g
MnCl2•4H2O
0.5g
FeSO4•7H2O
0.17g
CoCl2•6H2O
0.16g
CuSO4•5H2O
0.15g
Na2MnO4•2H2O
5g
Na4EDTA or 5.5gNa4EDTA•2H2O
Add ddH2O to 100ml Store at 4℃
Ⅲ*、Vitamin Solution
0.01g
Biotin
0.01g
Pyridoxin
0.01g
Thiamine
0.01g
Riboflavin
0.01g
PABA(P aminobenzoic acid)
0.01g
Nicotinic Acid
三、实验步骤：(感受态的制备及转化)
（1）前一天晚上挑取宿主菌接种于 25 ml 的 LB 液体培养基中，37 ℃，150 r/min 培养 过夜。 （2）第二天早上从过夜培养基中取 250 μl培养液，接种至用 50 ml 三角瓶配好的 24.75 ml SPⅠmedium中，37 ℃，200 r/min摇床培养，2 h后开始检测D600，当培养物生长到 对数生长末期时（D600~1.4），快速取 2.5 ml 菌液接种到 25 ml 的SPⅡ溶液中，于 37 ℃， 100 r/min摇床培养 1.5 h。 （3）加入 250 μl 的 100×EGTA 溶液，37 ℃，100 r/min 摇床培养 10 min，用 1.5 mL 离 心管分装成 500 μl 每管。 （4）向管中加入适当的pAD43-25（1μg，一般10-15 µl），轻轻混匀于37 ℃，100 r/min 摇床培养30 min。每管加500μlLB液体培养基，然后在200 r/min的摇床继续培养1.5 h。 （6）以4000 r/min 离心收集菌体，弃部分上清液，留100 µl 重悬菌体，涂相应的选择 性平板，37 ℃过夜培养（16 h），之后取出平板观察菌落,并挑取单菌落。[注：若涂平
转化过程所用的受体细胞一般都是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切 酶和甲基化酶的突变体，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体 细胞经过一些特殊的方法（电击法，化学法等）的处理后，细胞发生了暂时的改变，成 为了能允许外源DNA进入的感受态细胞（Competent cells）。进入受体细胞的DNA分子 通过复制，表达实现遗传信息的转移，是受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的 细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子。
板后放置时间超过24h，则所长菌落可能是污染所致]。 注意：在做转化时，需要做两个对照组：1，以同体积的无菌双蒸水代替质粒DNA溶液，其他操作与 上面相同。此组正常情况下在含氯霉素的LB平板上没有菌落出现。2，以同体积的无菌双蒸水代替质
植物病理学高级实验技术指导
（植物病理学专业研究生使用）
南京农业大学植保学院植物病理学系 2009-03
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植物病理学实验技术
Prepared freshly and filter sterilized 6、0.7M NaCl 溶液 Autoclave 用于溶解酶
7、酶液的配制：用 0.7M NaCl 溶液溶解酶，酶液浓度为 7.5mg/ml，过滤除菌，现配现用
其他实验器材
50ml 离心管 1.5ml EP 管 1ml, 200ul, 20ul 枪头 滤纸 擦镜纸 过滤器 过滤头 镊子
为 150ul/管。立即转化或保存于-70℃。最好立即转化，一般不保存。 二．转化（Transformation）
1、将 2ug DNA（5-10ul）加于 150ul 原生质体中，轻轻混匀，室温静置 25min DNA 浓度需足够大，且要干净