食品中大肠杆菌的快速检测方法

其中酶联免疫吸附（ＥＬＩＳＡ）法在食品检测中运用 较广泛， 而且还出现了一些改进了的检测技术。酶 联免疫分析 （ ＥＬＩＳＡ） 法是 ２０ 世纪 ６０ 年代出现的， 最近几年出现了更灵敏的显色剂和底物， 提高了 ＥＬＩＳＡ 的有效性。将抗原或抗体吸附于固相载体的 表面， 酶标记物与相应的抗体或抗原反应后， 形成 酶标记抗原抗体复合物， 在遇到相应底物时， 结合 物上的酶催化底物产生水解、氧化或还原等反应， 从而生成可溶性或不溶性的有色物质， 可用肉眼或 酶标测定仪判定结果。颜色的深浅与相应的抗体或 抗原量成正比， 因此， 可根据颜色的深浅来定量抗 体或抗原。ＥＬＩＳＡ 不同于 ＰＣＲ 之处在于他能够检测 致病微生物的表型特点。此外， 葛萃萃等设计的双 抗夹心 ＥＬＩＳＡ 对纯培养菌液检出限为 １０５ ｃｆｕ ／ ｍＬ， 具有良好的敏感性及特异性； 接种量为 ０．１ｃｆｕ ／ ｍＬ ￣１ｃｆｕ ／ ｍＬ培 养 １２ ｈ 后 可 检 出 阳 性 反 应 ， １ｃｆｕ ／ ｍＬ ￣１０ ｃｆｕ ／ ｍＬ的样品培养 ８ ｈ 后可检出阳性反应。
生物传感器的分子识别元件的载体可采用多种 材料， 利用较多的是光纤、荧光计等。Ａｌｏｃｉｌｊａ 等用 硅制成多孔性的生物传感器载体对大肠杆菌进行检 测， 通过增加反应物的接触面积从而达到提高检测 灵敏性的目的， 而且从单晶体状的硅合成为多孔性 硅载体也比较容易。葛晶等在 ＳＰＲ 生物传感器中采 用亲和素－ 生物素系统放大检测的响应信号， 并引 入复合抗体作为二次抗体， 使检测限由 １０６ ｃｆｕ ／ ｍＬ 下降到 １０５ ｃｆｕ ／ ｍＬ。殷涌光等利用抗体免疫吸附反 应， 采用一次抗体－ 抗原－ 二次抗体的夹心法增加 质量， 将胶体金复合抗体作为二次抗体大幅度增加 质量， 并延长胶体金复合抗体与微生物的结合过 程， 稳定和放大信号， 从而显著提高了检测精度。
肠 杆 菌 （ＥＴＥＣ）、 致 病 性 大 肠 杆 菌 （ＥＰＥＣ）、 出 血 性 大 肠 杆 菌 （ＥＨＥＣ）、 侵 袭 性 大 肠 杆 菌 （ＥＩＥＣ）和 粘 附 性 大 肠 杆 菌（ＥＡＥＣ）。 大 肠 杆 菌 是 温 血 动 物 肠 道 的 正 常 寄 居菌 ， 所以在卫生学 上 ， Ｅ．ｃｏｌｉ 作 为 饮 水 、 食 品 等 的粪源性污染卫生细菌学指标； 而且其在外界存活 时间与一些主要肠道病原菌相近， 他的出现也可能 预 示 某 些 肠 道 病 原 菌 （如 沙 门 氏 菌 、 志 贺 氏 菌 ）的 存 在， 是国际上公认的卫生监测指示菌， 因此相应出 现了大量的大肠杆菌的检测方法， 以下将介绍几种 快速检测方法。
大肠埃希氏菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）习惯称为大肠 杆 菌， 分类于肠杆菌科， 归属于埃希氏菌属， 与人类 疾病有关的大肠杆菌一般包括五种， 即肠毒素性大
＊ 陈盼， 女， １９８４ 年出生， 西南大学食品科学学院食品微生物与 发酵工程在读硕士研究生。 收稿日期： ２００７ － １１ － ２８
目前 ＰＣＲ 技术广泛地用于生命科学的许多学科 中。在食品微生物领域中， ＰＣＲ 用于快速检测或鉴 定食品中的微生物。常用的有实时荧 光 定 量 ＰＣＲ、 免 疫 ＰＣＲ、 反 转 录 ＰＣＲ、 多 重 ＰＣＲ 和 实 时 定 量 ＰＣＲ 等。史云等建立了用于肉及肉制品中大肠杆菌 的两重 ＰＣＲ 检测方法， 以 ＥＰＥＣ 的微绒毛粘连基因 （ｅａｅ ｇｅｎｅ）和菌毛束形成编码基因（ｂｆｐ ｇｅｎｅ）作为特异 性基因， 最低检出量为 １０ ｃｆｕ ／ ｇ， 检出时间为 ８ ｈ～ １７ ｈ。王升启等建立的复合探针实时荧光 ＰＣＲ 的灵 敏度可达 １０ ｃｆｕ ／ ｍＬ， 能快速准确、特异、灵敏地 对大肠杆菌进行定量分析。多重 ＰＣＲ 由于引物的相 互影响、引物退火的影响等导致灵敏度一般较低， 对于细菌量较少的检测标本， 如果不经过增菌， 采 用多重 ＰＣＲ 有可能出现假阴性结果， 特别是对于较 少 菌 量 即 可 致 病 的 Ｏ１５７ ∶Ｈ７， 应 考 虑 使 用 单 一 ＰＣＲ 技术。朱水荣等利用单一 ＰＣＲ 和多重 ＰＣＲ 对 待检菌株的毒力基因进行检测， 该方法能弥补血清 分型技术在确定大肠杆菌致病性方面的不足。郑桂 丽 等 用 单 一 ＰＣＲ 扩 增 大 肠 杆 菌 Ｏ１５７ 的 ｒｆｂＯ１５７， 检测灵敏度为 ６０ ｃｆｕ ／ ｇ， 时间仅为 ３ ｈ～４ ｈ。ＰＣＲ－ 聚合酶链式反应， 包 括 模 板 ＤＮＡ 的 变 性 、 退 火 成 单一的片段， 在聚合酶的作用下延伸， 克隆出病原
４ 生物传感器
生物传感器是以生物学和传感技术为基础，
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食 品工 程
２００７ 年第 １ 期
３ 月出版
用酶、抗体、细胞等作为识别元件， 与信号转换器 和电子测量仪共同构成的分析工具。目前已经商品 化的传感器有酶传感器、免疫传感器、微生物传感 器 、ＤＮＡ 杂 交 传 感 器 、 细 胞 器 传 感 器 、 仿 生 传 感 器、分子印迹传感器等。生物传感器具有诸多优 点， 如高选择性、高灵敏度、较好的稳定性、低成 本、能在复杂的体系中进行快速在线连续监测。目 前用于信号传导的方法主要有电气化学方法、表面 声波传导和光学传导。用于食品微生物检测的主要 是基因传感器和免疫传感器， 其原理分别是利用 ＤＮＡ 杂交和抗原抗体反应进行检测， 再将其转换为 光信号或电信号并通过仪表放大和输出。
５ 基因芯片技术
基因芯片（ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ） 技术是 ２０ 世纪 ９０ 年代兴 起 的 前 沿 生 物 技 术 ， 也 叫 ＤＮＡ 微 阵 列 （ＤＮＡ ｍｉ－ ｃｒｏａｒｒａｙ）、寡核苷酸阵列（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙ）。采用 原位合成（ｉｎ ｓｉｔｕ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ） 或显微打印手段， 将数 以万计的 ＤＮＡ 探针 固 化 于 支 持 物 表 面 上 ， 产 生 二 维 ＤＮＡ 探针阵列， 然 后 与 标 记 的 样 品 进 行 杂 交 ， 通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、 高效地检测或医学诊断， 由于常用硅芯片作为固相 支持物， 且制备过程运用了计算机芯片的制备技 术， 所以称之为基因芯片技术。
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食品工程
ＦＯＯＤ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ
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·食品分析·
食品中大肠杆菌的快速检测方法
Ｒａ ｐｉｄ ｍｅ ｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅ ｔｅ ｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓ ｃｈｅ ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
２００７ 年第 １ 期 ３ 月出版
陈 盼 ＊ 贺稚非 龚 霄 伍先绍
（ 西南大学食品科学学院， 重庆 ４００７１６）
１ ＡＴＰ 生物发光技术
ＡＴＰ 生物发光技术是近年来发展较快的微生物 快速检测方法。ＡＴＰ 是活细胞中最普遍的能量代谢 物， 为细胞提供各种生理活动所需能量， 而且其在 生物体内含量相对稳定。检测 ＡＴＰ 含量的一种方法 是用荧光光度计法， 生物发光是活细胞在荧光素酶 催化下发出的荧光， 目前使用的荧光素酶来源于北 美的萤火虫， 相对分子质量为 ６２ ０００ 的蛋白质， 他 催化荧光素的氧化反应， 这种反应的终产物不稳 定， 很快分解产生荧光。
ＣＨＥＮ Ｐａｎ＊ ＨＥ Ｚｈｉ－ ｆｅｉ ＧＯＮＧ Ｘｉａｏ ＷＵ Ｘｉａｎ－ ｓｈａｏ
（ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４００７１６， Ｃｈｉｎａ）
摘 要 大肠杆菌是人及各种动物肠道中的正常寄 居菌， 食物或水中大肠杆菌的检出意味着直接或间 接的近期粪便污染。大肠杆菌作为饮水、食品等的 粪源性污染卫生细菌学指标； 而且他在外界存活时 间与一些主要肠道病原菌相近， 它的出现也可能预 示 某 些 肠 道 病 原 菌 （如 沙 门 氏 菌 、 志 贺 氏 菌）的 存 在 。 大肠杆菌是国际上公认的卫生监测指示菌， 因此大 肠杆菌的检测技术显得十分重要， 相应出现了大量 的大肠杆菌的各种检测方法。 关键词 大肠杆菌； 快速检测； 食品 Ａｂｓｔｒ ａｃｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｓ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎ－ ｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔｓ ｏｆ ａｌｌ ｗａｒｍ－ ｂｌｏｏｄｅｄ ａｎｉｍａｌｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｈｕｍａｎｓ． Ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｅ． ｃｏｌｉ ｉｎ ｆｏｏｄ ｏｒ ｗａｔｅｒ ｂｅｃｏｍｅｓ ａｃｃｅｐｔｅｄ ａｓ ｄｉｒｅｃｔ ｏｒ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ ｒｅｓｅｎｔ ｆｅｃａｌ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ． Ｅ． ｃｏｌｉ ｉｓ ｔｈｅ ｈｙｇｉｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎｄｅｘ ｏｆ ｆｅｃａｌ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｒｉｎｋｉｎｇ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｆｏｏｄ． Ｉｔｓ ｓｕｒ－ ｖｉｖａｌ ｔｉｍｅ ｉｓ ｅｑｕａｌ ｔｏ ｓｏｍｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ． ｃｏｌｉ ｍｅａｎｓ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｓｏｍｅ ｉｎ－ ｔｅｓｔｉｎａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ， ｓｕｃｈ ａｓ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｎｄ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ． Ｅ． ｃｏｌｉ ｉｓ ａ ｒｅｃｅｉｖｅｄ ｈｙｇｉｅｎｉｃ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｉｎｄｉ－ ｃａｔｏｒ， ｉｔｓ ｄｅｔｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｒｅ ｖｅｒｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ． ｋｅｙｗｏｒ ｄｓ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ； ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ； ｆｏｏｄ
２ ＰＣＲ 检测技术
ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）即 聚 合 酶 链 反 应 技术， 该技术是在 １９７１ 年首先被 Ｋｌｅｐｐｅ 等提出来 的， 作为一种检测方法在 ２０ 世 纪 八 、 九 十 年 代 才 获得认可。ＰＣＲ 是指利用耐热 ＤＮＡ 聚合酶的作用， 通过变性 － 延伸 － 复性的循环操作， 在体外迅速将 ＤＮＡ 模板扩增数百万倍的一种克隆技术。理论上可 在 ２ ｈ 内将一个 ＤＮＡ 分子扩增到 １０６￣１０９ 倍， 采用 琼脂糖凝胶电泳检测 ＰＣＲ 扩增产物的荧光条带。