茯苓紫外线诱变育种
种植茯苓的技术
种植茯苓的技术茯苓为兼性寄生菌，是我国传统的名贵中药材，下面是店铺为你整理的种植茯苓的技术，希望对您有用。
种植茯苓的技术选地整地茯苓种植场地宜选择排水良好的东、南、西向的10～25°的山坡为宜。
土壤以黄砂土为好，粘土、砂砾土不宜种植，且不宜连作。
选好地后，深翻时要除净杂物，有白蚁危害的地区需用杀白蚁药进行土壤消毒。
在茯苓接种前10天再翻地1次，打碎土块，彻底除净杂物。
备料茯苓菌生长要依赖松木提供养分，因此，栽培茯苓要以松树为材料。
在生产上主要分为干段木栽培和树蔸栽培两种。
1.干段木备料法选择直径12cm以上不成材的松树砍倒(或取材后留下的头尾)，砍去其部分枝条，留下树尾的树叶，然后用铲刀按树的大小铲去4～5面树皮(以铲至木质部为宜)，铲面间要留下两指宽的树皮4～5条，从上至下不宜有断痕，留下的树皮称为引线(俗称“留筋”)。
经10～15天，待树干晒干至出现有裂口后将其锯成长70～80cm的小段，并按“井”字形堆垛于干燥向阳处。
段木垛上盖草料，垛的四周开好排水沟，地面上撒杀白蚁药。
2.树蔸备料法在秋、冬季砍伐松木时，选择直径12cm以上的树桩，将其周围1?5m范围内的杂草、表土铲除干净，灌木砍掉，深挖0.8m左右，让树桩和根部暴露在土外。
然后在树桩上铲去4面树皮，留下4条两指宽的引线。
露出地面的树根最多留4～6条，将其余的根截断。
对树根也要铲皮3面，左右侧各留1条手指粗的引线，留根长度1～1.5m。
上述各项工作，宜在上年冬季进行。
接种1.接种季节茯苓接种分春、秋两季。
春植是在清明至立夏进行。
桂南、桂东南、桂西地区气温回升较早，在清明前后接种较适宜;桂北、桂西北地区宜到立夏前后接种。
秋季各地气温相差不大，茯苓可在立秋前后接种。
2?接种方法茯苓栽培是以菌种或鲜茯苓个(菌核)作为“种子”进行繁殖。
菌种是用小松木段片装瓶(塑料)消毒，加适量培养基质，接上茯苓原种培养后，在瓶内长出白色旺盛的菌丝体。
食用菌复习题
食用菌复习题一、名词解释1、初生菌丝体: 由初生菌丝组织成的群体2、次生菌丝体: 由次生菌丝组织成的群体3、培养基:根据食用菌对营养、水分、酸碱度的要求，人为配制成的供食用菌生长发育的基质。
4、菌种: 是指以适宜的营养培养基为载体进行纯培养的菌丝体，也就是培养基质和菌丝体的联合体。
或者说是指人工培养，并供进一步繁殖的食用菌的纯菌丝体。
5、同宗结合: 单个担孢子萌发形成的菌丝，可以配对融合，且具有产生子实体的能力就是同宗配合6、异宗结合: 由两个不同性别的菌丝交配后才能完成生育的现象，称为、异宗结合，又叫自交不育。
7、腐生: 从动植物尸体上或无生命的有机物中获取营养的方式是腐生8、母种:由孢子、子实体或基内菌丝经过人工培养获取的纯菌丝称为母种9、原种: 将母种接转到原种培养基上培育的菌丝体称之为原种。
10、栽培种: 将原种接转到栽培种培养基上培育的菌丝体称之为栽培种。
11、单核菌丝（初生菌丝）: 由担孢子萌发所形成的菌丝是初生菌丝。
12、双核菌丝（次生菌丝）: 两条初生菌丝经过质配而形成的菌丝是次生菌丝13、根状菌索: 外由拟薄壁组织构成，内由疏丝组织构成的绳索状结构，外由拟薄壁组织构成，内由疏丝组织构成的绳索状结构，起着固着和吸收作用，并能抵御不良环境，在适宜条件下又能恢复生长并分化形成子实体。
14、菌核：是由菌丝体和贮藏物质组成的不定型的结构15、菌丝束：由无数的菌丝沿着长轴（纵向）方向编织而成的线状体16子实体：子实体是食用菌的繁殖器官，也就是被我们称为“菇菌、覃菌、蘑、莪”的部分。
17菌环：在幼小子实体上，菌盖边缘与菌柄有时连接着一层膜，叫内菌幕。
随着子实体长大，这层膜与菌盖脱离，其残留在菌柄上的部分则形成菌环。
18菌托：子实体发育的前期，在其外表包着一层膜，即菌膜，也称外菌幕。
菌膜有厚薄之分，随着子实体的生长发育，这层外膜（较薄的）常不留痕迹地消失。
但一些较厚的菌膜常能残留在菌柄的基部，形成袋状物或杯状物，这就是菌托。
茯苓优良栽培菌株选育试验初报
长期 以来 ，茯 苓栽 培 菌株 由有关 院校 、科 研 单
位 及产 区 乡 （ ） 专 业 技 术 人 员 应 用 微 生 物 “ 镇 组 织 分离 ” 的方 法 ，由鲜 菌 核 中分 离 、培育 。 由于各
通过 初 步试验 观察 ，茯 苓 菌 丝原 生 质 体经 紫 外
线照射诱变后 ，均能产生菌核 ， 从其平均单产分析 看 ，Ａ系列中 ，除 Ａ 外 ，其余均呈现正向诱变。ｗ ， 系列处理 中，正负变率各占 ５ ％。 ０
“ 十一五” 国家科技支撑计划课题 “ 茯苓规范化种植关键技术研究 ” （ ０６ Ａ０ Ａ１ ４— ） ２ ０ Ｂ １６ ５— ５ 王 克勤 ，Ｔ ｌ ０ ７ ７０ １０ ｅ：（ ２ ）８ ５ ７ ０ 。Ｅ— ｉ ｂ ｈ ｋ ＠ １３ ｅｍ。 ｍａ ：ｈｗ ｗ ｑ ６ ． ｏ ｌ
前 全 国茯 苓 的主要 栽培 模式 。
平板内，置紫外灯下照射 ，照射时间分别为 ６ ， ０ ０ ９，
１０ ５ ２ ，１０，１０， １ ，２０ ７ ，３０ 。取 照 射 后 的 ８ ２０ ４ ，２０ ０ｓ 原生质悬 浮 液涂 布 于平 皿 培 养 基上 ，每 一 照射 时间
分别涂 布 ５个 培 养皿 ，观 察 再 生情 况 ，并 挑取 再 生 菌落 。对 不 同处理 的再 生 菌株 及 菌 落 ，经优 选 ，扩 大培育 成 栽 培 菌 株 Ａ 、Ａ 、Ａ 、Ａ 、Ａ 、Ａ 、Ａ 、 ， 。
再 加上 各地 菌株 多年交 叉 混用 ，导致 全 国产 区茯 苓 种 质混 乱 ，栽 培 用种质 量 下 滑 ，药 材 生产 质 量 、产
１２２栽培方式 ．．
紫外线诱变育种高产纤维素菌实验方案
紫外线诱变育种高产纤维素菌实验方案诱变方案：纤维素酶活力较高菌株→紫外线诱变→初筛→复筛→稳定性试验.实验目的：对有一定能力产纤维素酶的菌种进行紫外线诱变，诱变出高产纤维素酶的菌种。
实验原理：紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。
DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。
材料和器皿：（1）菌种：木霉单孢子（2）培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（液体和固体），生理盐水。
（3）器皿：无菌培养皿，无菌试管，无菌移液管（5ml,1ml）,150ml三角瓶（内装有玻璃珠），无菌离心管等。
（4）仪器：紫外灯（装在无菌操作箱内），磁力搅拌器等。
实验步骤：紫外线诱变育种单孢子悬液制备：用生理盐水洗下出发菌株的斜面孢子摇床上震荡分散30min，4 层无菌擦镜纸过滤，制备单孢子悬液。
稀释对照菌液（未照射菌液）将未经照射的菌液稀释成10-1~10-6，然后从10-5,10-6两管中各吸取0.1ml菌液于牛肉膏蛋白胨平板上（每个稀释度做三个皿），用无菌涂布棒土布均匀后，倒置于32度条件下培养过夜，第二天取出，计算菌落数，将记得的结果记录于表格中。
UV 诱变：取单孢子悬液5mL 于直径9cm 的培养皿内，同时放入无菌搅拌子，在磁力搅拌器．．．．．的搅拌下置于15W 紫外线灭菌灯下30cm 处分别处理0s.30s、1min、2min、3min、5min、7min、9min、11min。
在红灯下稀释适当倍数，0.1mL 涂PDA 平板，30℃避光培养过夜。
诱变致死率检测：分别取等量的不同诱变时间的菌液和未诱变菌液涂布于PDA 平板，30℃培养72h。
微生物诱变育种的方法
微生物诱变育种的方法微生物，这小小的生物世界里的居民，有着大大的能量。
而诱变育种呢，就像是给微生物来一场奇妙的变身之旅。
物理诱变是一种常见的法子。
紫外线就像是微生物世界的严厉教官。
微生物们在紫外线的照射下，就如同小士兵接受艰苦的训练。
紫外线那强烈的能量，会打乱微生物内部的基因结构。
比如说一些细菌，原本规规矩矩地按照自己的基因蓝图进行生长繁殖，紫外线一照，就像打乱了建筑图纸一样，基因里的一些部分发生了错乱。
有的微生物在这错乱中就产生了新的特性，也许原本不会产生某种特殊酶的，经过紫外线照射后就有了这种能力。
还有X射线，这可是更厉害的家伙。
如果把微生物比作是一个精密的小机器，X射线就像一把强力的干扰器。
它能深深钻进微生物的内部，对基因进行破坏和重组。
就像把小机器里的一些零件拆下来又重新组装，只不过这里是在基因层面。
有的微生物经X射线诱变后，抗逆性变强了。
原本在稍微恶劣一点的环境里就奄奄一息的，现在能坚强地活下去，而且还活得挺好。
化学诱变也不甘示弱。
化学诱变剂就像是给微生物的基因施魔法的小巫师。
像亚硝酸，它悄悄地接近微生物的基因，把基因里的一些碱基偷偷换掉。
这就好比在密码锁上换了几个密码数字，整个密码锁的开锁方式就可能完全变了。
微生物的基因表达也就随之改变。
一些霉菌经过亚硝酸诱变后，产孢子的能力可能大大增强，原本产一点点孢子的，现在像开了挂一样大量产孢子。
再说说碱基类似物，它们是伪装高手。
它们混入微生物的基因大厦里，伪装成正常的碱基。
可是一旦到了基因复制的时候，就开始捣乱了。
就像一个假零件混进了真零件堆里，在机器组装的时候就会出问题。
这种捣乱会导致基因复制出错，从而产生突变。
有的酵母菌经过碱基类似物的诱变后，发酵能力变得超强，能产生更多的酒精或者其他有用的代谢产物。
复合诱变就像是给微生物来一套组合拳。
先给微生物来点物理诱变，就像先给它一个下马威，打乱它的基因阵脚。
然后再用化学诱变，进一步在混乱的基因里搞点新花样。
诱变育种流程及紫外诱变育种的详细步骤
诱变育种流程及紫外诱变育种的详细步骤(总4页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--诱变育种的一般步骤：1.首先是天然菌种的选育：调查研究及查阅充分的资料↓设计实验方案↓确定采集样品的生态环境采样↓确定特定的增殖条件增殖培养确定特殊的选择培养基及可能的定性或半定量快速检出法平板分离↓原种斜面↓确定发酵培养基础条件筛选↓初筛（1株1瓶）↓复筛（1株3～5瓶）↓结合初步工艺条件摸索再复筛（1株3～5瓶）↓3～5株↓单株纯种分离生产性能试验→毒性试验菌种鉴定2.诱变菌种：出发菌株----菌种纯化(出发菌株性能测定)----制备斜面孢子----制备单孢子悬液(悬液进行活菌计数)----诱变剂处理(存活菌数的测定并计算存活率)----平板分离(测定变异率)----挑取变异菌落并移植至斜面上----初筛(初筛数据分析，生产性状的粗测)----斜面传代----复筛(复筛数据分析，精确测定生产性状)----变异菌株(菌株参数分析)----小型或中型投产试验----大型投产试验。
诱变育种应把握的主要原则有以下几点：1)选择简便有效的诱变剂。
在选用理化因素作诱变剂时，在同样效果下，应选用最简便的因素；在同样简便的条件下，应选用最高效的因素。
2)挑选优良的出发菌株。
最好采用生产上已发生自变的菌株，选用对诱变剂敏感的菌株，选取有利于进一步研究或应用性状的菌株。
4)处理单细胞或孢子悬液。
单细胞悬液应均匀而分散，孢子、芽孢等应稍加萌发。
5)选用合适的诱变剂量。
一般正变较多出现在低剂量中，负变较多地出现在高剂量中。
6)选用高效的筛选方法。
紫外线诱变育种：紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253-265nm．灯与处理物的距离为30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。
一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。
被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个 /ml。
《茯苓高效栽培技术与实践指南》
温馨小提示：本文主要介绍的是关于《茯苓高效栽培技术与实践指南》的文章，文章是由本店铺通过查阅资料，经过精心整理撰写而成。
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感谢支持！(Thankyou for downloading and checking it out!)《茯苓高效栽培技术与实践指南》一、茯苓概述茯苓概述：茯苓是一种珍贵的药用真菌，学名Poriacocos，隶属于担子菌门蘑菇纲茯苓属。
茯苓在我国有着悠久的栽培历史和丰富的药用文化，早在《神农本草经》中就被列为上品。
茯苓的生物学特性茯苓菌丝体白色，有横隔，多核，生长温度范围为2535℃。
茯苓的生长发育可以分为菌丝生长期、原基形成期、子实体形成期和成熟期四个阶段。
茯苓菌丝对土壤、水分、养分等环境因素有较强的适应性，但在人工栽培过程中，需要对这些因素进行精细调控，以保证茯苓的高效生长。
茯苓的药用价值及市场需求茯苓味甘、淡，性平，归心、脾、肾经，具有渗湿利水、健脾益胃、宁心安神等功效，被誉为“中药里的神仙草”。
茯苓的主要药用成分为多糖和三萜类化合物，具有显著的抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、免疫调节等药理作用。
随着人们对茯苓药用价值的认识加深，茯苓市场需求逐年增长。
茯苓产品在国内外市场具有广泛的应用前景，尤其在中医药、保健食品、化妆品等领域表现出巨大的潜力。
为了满足市场对茯苓的需求，提高茯苓产量和质量，研究茯苓的高效栽培技术和实践指南具有重要意义。
综上所述，茯苓作为一种具有丰富药用价值和市场潜力的药用真菌，其生物学特性和药用价值受到了广泛关注。
通过深入研究茯苓的高效栽培技术和实践指南，有望为茯苓产业的可持续发展提供有力支持。
二、茯苓高效栽培技术茯苓高效栽培技术包括地理位置与气候条件、土壤选择与改良、菌种选择与培育、栽培基质选择与处理、播种时间与播种方法、温湿度控制、光照管理、病虫害防治、采收时间与方法以及加工工艺流程。
紫外线诱变育种高产纤维素菌实验方案
紫外线诱变育种高产纤维素菌实验方案诱变方案： 纤维素酶活力较高菌株→紫外线诱变→初筛→复筛→稳定性试验.实验目的：对有一定能力产纤维素酶的菌种进行紫外线诱变，对有一定能力产纤维素酶的菌种进行紫外线诱变，诱诱变出高产纤维素酶的菌种。
变出高产纤维素酶的菌种。
实验原理：紫外线诱变处理的有效波长为200~300×200~300×10nm10nm ，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。
DNA 和RNA 的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA 分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA 的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。
材料和器皿：（1） 菌种：木霉单孢子 （2） 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（液体和固体），生理盐水。
（3） 器皿：无菌培养皿，无菌试管，无菌移液管（5ml,1ml ）,150ml 三角瓶（内装有玻璃珠），无菌离心管等。
（4） 仪器：紫外灯（装在无菌操作箱内），磁力搅拌器等。
实验步骤：紫外线诱变育种单孢子悬液制备：单孢子悬液制备： 用生理盐水洗下出发菌株的斜面孢子用生理盐水洗下出发菌株的斜面孢子摇床上震荡分散摇床上震荡分散30min 30min 30min，，4 4 层无菌擦镜纸过滤，制备单孢子悬液。
层无菌擦镜纸过滤，制备单孢子悬液。
层无菌擦镜纸过滤，制备单孢子悬液。
稀释对照菌液（未照射菌液）稀释对照菌液（未照射菌液）将未经照射的菌液稀释成将未经照射的菌液稀释成将未经照射的菌液稀释成10-1~10-610-1~10-610-1~10-6，，然后从然后从10-5,10-610-5,10-6两管中各吸取两管中各吸取0.1ml 0.1ml 0.1ml菌液于牛肉膏蛋白胨平板上（每个稀释度做三个菌液于牛肉膏蛋白胨平板上（每个稀释度做三个皿），用无菌涂布棒土布均匀后，倒置于3232度条件下培养过夜，度条件下培养过夜，度条件下培养过夜，第二第二天取出，计算菌落数，将记得的结果记录于表格中。
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药 物 生 物 技 术Pharmaceutical Biotechnology 2008,15(1):44～47茯苓紫外线诱变育种3李 羿1,万德光23(11成都医学院药学系,四川成都610083;21成都中医药大学药学院,四川成都610075)摘 要 为了探讨紫外线诱变育种在茯苓优良菌种选育中的应用,将茯苓孢子悬液经紫外线照射后,通过茯苓优良菌种筛选模型筛选得到茯苓优良菌株P6。
菌株P6摇瓶液体发酵后每升发酵液中菌丝体干重达11.92g/L,较出发菌株P0菌丝体干重提高了7.58%。
菌株P6传代培养后,用摇瓶液体发酵验证其遗传稳定性,实验结果表明其遗传稳定性良好。
关键词 茯苓;紫外线诱变;育种中图分类号:Q949.329+.7;Q345 文献标识码:A 文章编号:100528915(2008)0120044204 茯苓[Poria cocos(Schw.)wolf]始载于《神农本草经》,其药性平和,“利水而不伤正,补而不助邪”,为利水渗湿之要药。
近代医学研究表明,茯苓的药理作用主要表现在利尿、镇静、抗肿瘤、增强免疫等方面,其主要活性成分为茯苓多糖和三萜类化合物。
目前,茯苓已被广泛地应用于医药保健产业。
茯苓优良菌种的选育是茯苓生产的基础和关键。
我国科学工作者在茯苓菌种的选育上也进行了一些有益的探索[1～4]。
本研究应用紫外线诱变育种,通过构建的茯苓优良菌种筛选模型筛选出茯苓优良菌株。
1 材 料1.1 菌种茯苓(Pori a cocos)斜面菌种为四川省农科所提供。
斜面菌种4℃低温保存,6个月转管一次。
由斜面菌种制作甘油菌,-30℃冷冻保藏。
1.2 主要仪器与试剂超净工作台(苏净集团安泰公司),全温振荡器(哈尔滨东联电子技术开发有限公司),离心机Beckman J22HS,电子天平Sartorius B P121S。
酵母浸膏、蛋白胨为Oxoid产品,葡萄糖、K2HPO4和MgSO4・7H2O均采用国产分析纯。
1.3 培养基基本培养基(MM培养基):(N H4)2SO41g, K2HPO47g,KH2PO43g,MgSO4・7H2O 0.1g,葡萄糖5g,蒸馏水1L。
完全培养基(T YEG培养基):胰蛋白胨10g,酵母浸膏5g,K2H PO43g,葡萄糖1g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,p H7.0。
摇瓶液体发酵种子培养基:葡萄糖20g,酵母浸膏4g,蛋白胨5g,K2H PO41g,MgSO4・7H2O 0.5g,初始p H5.5,蒸馏水1L。
摇瓶液体发酵培养基:葡萄糖20g,酵母浸膏3.5g,蛋白胨4.5g,K2H PO41g,MgSO4・7H2O0.5g,初始p H5.5,蒸馏水1L。
以上培养基均经1.05kg/cm2,121.3℃灭菌20min。
2 方 法2.1 紫外线诱变致死率曲线2.1.1 平板制作 将完全培养基熔化后,冷却至45℃左右时倒平板,凝固待用。
2.1.2 孢子悬液制取 取已培养好的新鲜斜面菌种,用无菌生理盐水洗下,倒入盛有玻璃珠的小三角瓶中,充分摇动10min,使孢子均匀分散,用灭菌脱脂棉过滤,即为孢子悬浮液。
取上述孢子悬浮液计数,调整孢子悬浮液浓度为106个孢子/ml。
2.1.3 紫外线照射 将紫外灯开关打开预热20min。
取直径6cm无菌平皿5套,分别加入上述孢子悬液3ml,并将无菌搅拌棒放于平皿中。
将盛有菌悬液的平皿置磁力搅拌器上,在距离为30cm,功率为15W的紫外灯下分别照射30、60、443收稿日期:2007206228 修回日期:2007209218作者简介:李羿,1969年生,男,四川成都人,副教授,博士,主要从事微生物发酵及中药品种、品质方面的研究。
Tel:028*********;E2mail:lychengdu@。
3通讯作者:万德光,女,教授,博士生导师,主要从事中药品种、品质方面的研究。
Tel:028*********;E2mail:wdg@。
90、120、150s。
2.1.4 稀释 在红灯下,将上述处理菌悬液以10倍稀释法稀释成1021、1022、1023、10244个不同的稀释度。
2.1.5 涂平板 在红灯下,取1022、1023和10243个稀释度涂平板,每个稀释度涂平板3只,每只平板加稀释菌液0.1ml,用无菌玻璃刮棒涂匀。
以同样操作,取未经紫外线处理的孢子稀释液涂平板作对照。
2.1.6 培养 将上述涂匀的平板用黑布包好,置28℃恒温培养箱倒置培养2d。
2.1.7 计数 将培养2d的平板取出进行菌落计数。
2.1.8 致死率计算 根据对照平板上菌落数,计算出每毫升菌液中的活菌数。
同样计算出紫外线处理30、60、90、120、150s的存活细胞数,计算出成活率,再由公式(致死率+成活率=100%)计算出致死率。
2.2 紫外线诱变育种2.2.1 孢子悬液的制取 同2.1.2孢子悬液的制取。
2.2.2 紫外线处理 选择致死率为80%,紫外线照射时间为77s,其余同紫外线诱变致死率曲线操作。
2.2.3 诱变后处理(差别杀菌法、菌丝过滤法) 红灯下,取诱变后的孢子悬液2ml加入18ml基本培养基中。
振荡培养3h,然后在58℃水浴加热2min,过滤除去菌丝。
重复上述操作2次。
2.2.4 稀释 稀释度为1021、1022、10-3,其余同紫外线诱变致死率曲线操作。
2.2.5 涂平板 在红灯下,取1021、1022、10-33个稀释度的0.1ml孢子悬液涂在含2mg/ml茯苓胞外多糖的浓度梯度完全培养基平板上,用无菌玻璃刮棒涂匀。
剩余稀释孢子悬液放冰箱贮藏。
2.2.6 培养 将上述涂匀的平板用黑布包好,置28℃恒温培养箱倒置培养。
2.3 优良菌株的筛选2.3.1 耐茯苓胞外多糖较高菌株的筛选 在浓度梯度平板上筛选出耐茯苓胞外多糖较高的菌株,分别逐步接种在含4、8、16mg/ml茯苓胞外多糖的浓度梯度完全培养基平板上,经不断驯化筛选出耐受性突变株。
进一步用液体摇瓶发酵复证,择优留取,从而筛选出优良的茯苓生产菌株。
2.3.2 种子液的制备 从平板菌种上挑取一环耐较高茯苓胞外多糖的菌株,接种到盛有50ml液体种子培养基的250ml锥形瓶中。
在25℃, 150r/min摇瓶振荡培养5d作为液体菌种备用,称为第一代种子液。
2.3.3 摇瓶液体发酵 分别吸取已制备的耐较高茯苓胞外多糖菌株的第一代种子液3.5ml,接种于盛有50ml液体摇瓶发酵培养基的250ml锥形瓶中(按7%的比例接种)。
在培养温度26℃,培养基初始p H值5.5,摇瓶转速150r/min的培养条件下,摇瓶振荡培养7d。
2.3.4 菌丝干重的称量 取发酵液50ml,经6000r/min离心15min,收集沉积的菌丝球,60℃烘干至恒重,用电子天平精确称重。
2.4 优良菌株稳定性试验用无菌移液器吸取250μl优良菌株的第一代优良菌株种子液,接种到盛有50ml液体种子培养基的250ml锥形瓶中(按0.5%的比例接种)。
在培养温度25℃,150r/min摇瓶振荡培养2d得到第二代优良菌株的种子液。
再将第二代优良菌株种子液接种到液体种子培养基中,在培养温度25℃,150r/min摇瓶振荡培养2d得到第三代优良菌株种子液。
依此类推,可得到第十代优良菌株种子液。
将第十代优良菌株种子液接种到摇瓶液体发酵培养基中,同时以第一代优良菌株的种子液作对照,进行摇瓶液体发酵(参照2.3.3摇瓶液体发酵)。
摇瓶液体发酵结束后离心收集菌丝球,60℃烘干至恒重,用电子天平精确称重。
3 结 果3.1 紫外线诱变致死率曲线以紫外线照射时间为横坐标,以茯苓成活率为纵坐标绘制紫外线诱变致死率曲线图(图1)。
Fig1 Ultraviolet ray lethal rate curve of Poria cocos spore54李 羿等:茯苓紫外线诱变育种3.2 紫外线诱变育种为了进一步加大突变体出现率,紫外线诱变后用差别杀菌法和菌丝过滤法富集营养缺陷型。
在含有2mg/ml茯苓胞外多糖的浓度梯度完全培养基平板上,挑选出生长较好的耐较高浓度茯苓胞外多糖的茯苓菌株171株。
3.3 优良菌株的筛选将耐较高浓度茯苓胞外多糖的茯苓菌株171株用无菌牙签挑到含4mg/ml茯苓胞外多糖的完全培养基平板上,挑选出生长较好的菌落63株,用无菌牙签接种到含8mg/ml茯苓胞外多糖的完全培养基平板上,挑选出生长较好的菌落22株,用无菌牙签接种到含16mg/ml茯苓胞外多糖的完全培养基上,从中挑选出生长较好的6株,每株5瓶进行摇瓶液体培养(同时以诱变前的菌株P0作对照),结果见表1。
Tab1 Effect s on Erlenmeyer flask liquid fermentation of different Poria cocos strains by ultraviolet ray induced mutationStrain P0P1P2P3P4P5P6Dry weight ofmycelium(g/L)11.0811.7111.0311.4211.6311.8311.92 Ratio of theincreasing dryweight ofmycelium(%)5.69-0.45 3.07 4.966.777.58 将每升发酵液中菌丝干重含量最高的菌株P6作为紫外线诱变后的优良菌株。
P6摇瓶发酵后,每升发酵液中菌丝体干重达11.92g/L,较出发菌株P0提高了7.58%。
3.4 优良菌株稳定性试验优良菌株P6通过传代培养,用摇瓶液体发酵验证其遗传稳定性,结果见表2。
P6第一代的菌丝干重为11.86g/L,P6第十代的菌丝干重为11.95g/L,表明优良菌株P6具有良好的遗传稳定性。
T ab2 E ffects on stability of strain P6subculture of Poria cocos The number ofgeneration12345 Dry weight ofmycelium(g/L)11.8611.8111.9211.9711.79The number ofgeneration678910Dry weight of mycelium(g/L)11.8411.7511.8711.9011.954 讨 论4.1 诱变材料的处理茯苓适合在偏酸性环境下生长,碳源丰富容易造成生理酸性的营养环境。
笔者选择麦芽汁琼脂培养基作为生孢培养基。
斜面培养基制作时应注意斜面坡度相近,斜面厚度大体以3～5mm为宜。
斜面培养基制备好后,应在适当温度放置若干天,使表面的冷却水蒸发掉后再使用,水分过多过少均不利于生孢。
因为一般孢子是单核的,而菌丝是多核的。
用孢子作诱变材料,不但能均匀地接触诱变剂,还可以减少菌株由于分离产生不纯现象发生。