致泻大肠埃希氏菌

ETEC
157
171
766
EAEC
102 400 1111 1487
通用
刮取 5.3.1 中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔 1 环～2 环，至装有 1 mL0.85%灭菌 生理盐水的 Eppendorf 管内，混匀。4 ℃～8 ℃，12 000 r/min 离心 15 min，弃去上清。沉 淀加入 100 µL 灭菌去离子水中，混匀。100 ℃煮沸 12 min，12 000 r/min 离心 5 min，上清 即为 PCR 扩增模板，可直接用于 PCR 反应。 8.4 多重 PCR 五种致泻大肠埃希氏菌目的基因多重 PCR 扩增加样体系见表 5。PCR 反应条件：预变 性 94 ℃ 5 min。变性 94 ℃ 30 s，复性 63 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 1.5 min，30 个循环。最 后 72 ℃延伸 5 min。
3.13 缓冲葡萄糖蛋白胨水（MR-VP 试验用）：见附录 A 中 A. 11。 3.14 致病性大肠埃希氏菌诊断血清、侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清、产肠毒素大肠埃希氏 菌诊断血清、出血性大肠埃希氏菌诊断血清。 3.15 生化鉴定试剂盒。 3.16 PCR 反应试剂盒。
第一法 常规培养方法
4 检验程序 检验程序如下：
8000～10000r/min 均质；液体样本震荡均匀即可。于 44.5℃± 0.2℃培养 18h～24h。 5.2 分离 取增菌后的 EC 增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板； 污染严重的检样， 可 将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板， 于 36℃± 1℃培养 18 h～24h， 观察各个平 板上生长的菌落形态。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵 的菌落。致泻大肠埃希氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落形态特征见表 1。 选择性平板 MAC 琼脂 EMB 琼脂 致泻大肠埃希氏菌的菌落特征 无色至粉红色，光滑、湿润、突起、圆形、边缘整齐 紫红色具黑心，有或无金属光泽，光滑、湿润、圆形、边缘整齐
五种致泻大肠埃希氏菌目的基因引物序列 引物序列 5′-ATT CTG GCT CTC TTC TTC TTT ATG GCT G-3′ 5′-CGT CCC CTT TTA CAA ACT TCA TCG C-3′ 5′-GAC ACC TCA TTG CTG AAG TCG-3′ 5′-CCA GAA CAC CTC CGT TAT GC-3′ 5′-CGA TGT TAC GGT TTG TTA CTG TGA CAG C-3′ 5′-AAT GCC ACG CTT CCC AGA ATT G-3′ 5′-GTT TTG ACC ATC TTC GTC TGA TTA TTG AG-3′ 5′-AGC GTA AGG CTT CTG CTG TGA C-3′ 5′-GAA CAG GAG GTT TCT GCG TTA GGT G-3′ 5′-CTT TCA ATG GCT TTT TTT TGG GAG TC-3′ 5′-CCT CTT TTA GYC AGA CAR CTG AAT CAS TTG-3′ 5′-CAG GCA GGA TTA CAA CAA AGT TCA CAG-3′ 5′-TGT CTT TTT CAC CTT TCG CTC-3′ 5′-CGG TAC AAG CAG GAT TAC AAC AC-3′ 5′-CGA TCA AGA ATC CCT AAC AGA AGA ATC AC-3′ 5′-CGA TAG ATG GCG AGA AAT TAT ATC CCG-3′ 5′-TGC CAT CAA CAC AGT ATA TCC G-3′ 5′-ACG GCT TTG TAG TCC TTC CAT-3′ 5′-ACG CAG AGT TGC CTG ATA AAG-3′ 5′-AAT ACA GAA TCG TCA GCA TCA GC-3′ 5′-AAA TGT CAG TGA ACC GAC GAT TGG-3′ 5′-AGC CGT TTC CGC AGA AGC C-3′ 5′-AAA GTG TGG GTC AAT AAT CAG GAA GTG-3′ 5′-ATG CCA GTC CAG CGT TTT TGC-3′ 片段大小 （bp） 544 910 244 324 655
检样 25g样品＋225mL EC增菌肉汤 44．5℃±0.2℃，18h～24h 麦康凯或EMB 36℃±1℃，18h～24h 挑取可疑菌落
TSI、pH7.2尿素、营养琼脂斜面
第一法 生化鉴定 PCR实验
第二法
血清学实验 报告
血清学实验 报告
图 1 致泻大肠埃希氏菌检验程序
5 操作步骤 5.1 增菌 样品采集后应尽快检验。除了易腐食品在检验之前预冷藏外，一般不冷藏。以无菌操 作取检样 25g(mL)，加入装有灭菌 225mL EC 增菌液的均质杯中，用旋转刀片式均质器以
表4 目标菌 EPEC、STEC EPEC STEC 目标基因 escV–F escV–R bfpB–F bfpB–R stx1A–F stx1A–R stx2A–F stx2A–R Elt–F Elt–R estIa–F estIa–R estIb–F estIb–R EIEC invE–F invE–R astA–F astA–R aggR–F aggR–R Pic–F Pic–R uidA–F uidA–R 8.3 标本处理
表5 试剂
五种致泻大肠埃希氏菌目的基因多重 PCR 扩增加样体系 加样体积（µL） 8.3 2.5 2.5 3.0 0.4 0.4 0.1 0.1 0.2 0.2 0.4 0.4 0.1 0.1 0.4 0.4 0.2 0.2 0.2 0.2 0.4 0.4 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.7 2.0
1 可采用商品化的 PCR 检测试剂盒。
标准号 CMCC 44155
标准菌株一览表 来源 中国食品药品检定研究院 中国疾病预防控制中心传染病所 中国食品药品检定研究院 中国食品药品检定研究院 中国疾病预防控制中心传染病所 WHO
具有 stx1、stx2 毒力基因 CMCC 44815 CMCC 44825 042 血清型 ATCC 25922
（一）
1 范围
致泻大肠埃希氏菌检验标准操作程序
本操作程序规定了食品中致泻大肠埃希氏菌的检验方法。 本操作程序适用于食品中致泻大肠埃希菌的检验。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 冰箱：0～4℃。 2.2 恒温培养箱：36± 1℃。 2.3 恒温水浴锅：44.5± 0.2℃。 2.4 显微镜：10-100× 。 2.5 均质器。 2.6 天平，感量为 0.1g。 2.7 灭菌广口瓶：500mL 或无菌均质袋。 2.8 灭菌锥形瓶：500mL，250mL。 2.9 灭菌吸管：1mL(具 0.01mL 刻度)、5mL(具 0.1mL 刻度)或微量移液器及吸头。 2.10 灭菌培养皿：直径 90mm。 2.11 灭菌试管：10mm× 75mm。16mm× 160mm。 2.12 1.5 mL Eppendorf 管。 2.13 全自动微生物生化鉴定系统。 2.14 PCR 仪。 2.15 电泳仪。 2.16 凝胶成像系统。 3 培养基和试剂 3.1 EC 肉汤：见附录 A 中 A.1。 3.4 麦康凯琼脂（MAC）：见附录 A 中 A.2。 3.5 伊红美蓝琼脂(EMB)：见附录 A 中 A.3。 3.6 三糖铁琼脂(TSI)：见附录 A 中 A.4。 3.7 营养琼脂斜面：见附录 A 中 A.5。 3.8 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录 A 中 A.6。 3.9 尿素琼脂(pH7.2)：见附录 A 中 A.7。 3.10 蛋白胨水（靛基质试验）：见附录 A 中 A.8。 3.11 半固体琼脂：见附录 A 中 A.9。 3.12 革兰氏染色液：见附录 A 中 A.10。
dH2O 10× PCR Buffer 25 mM MgCl2 2.5 mM dNTPs 25 µM escV–F 25 µM escV–R 25 µM bfpB–F 25 µM bfpB–R 25 µM stx1A–F 25 µM stx1A–R 25 µM stx2A–F 25 µM stx2A–R 25 µM elt–F 25 µM elt–R 25 µM estIa–F 25 µM estIa–R 25 µM estIb–F 25 µM estIb–R 25 µM invE–F 25 µM invE–R 25 µM astA–F 25 µM astA–R 25 µM aggR–F 25 µM aggR–R 25 µM pic–F 25 µM pic–R 25 µM uidA–F 25 µM uidA–R 3 U/µL Taq 酶 DNA 模板 8.5 检测结果的判定
5.3 初步生化试验 5.3.1 自选择性琼脂平板上直接挑取 5～10 个菌落分别接种 TSI、pH7.2 尿素琼脂和营养琼 脂小斜面各一管，置 36℃± 1℃培养 18h～24h，分别观察结果。 5.3.2 凡是 TSI 斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S 阴性和尿素阴性的菌株，挑取用 5.3.1 中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验、血清学分型。 5.4 生化试验 5.4.1 用 5.3.1 中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验，即靛基质、甲基红 和 VP 实验，大肠埃希氏菌的培养物 VP 实验为阴性结果，靛基质实验和甲基红实验应为阳 性结果；肠侵袭性大肠埃希氏菌还需加做赖氨酸脱羧酶试验和动力试验，赖氨酸脱羧酶试 验应为阴性，动力试验应为阴性（O124 动力阳性或阴性）。必要时做氧化酶和革兰氏染色 检查，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。 5.4.2 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据 5.3.2 的初步判断结果， 用 5.3.1 中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化 鉴定系统进行鉴定。 5.5 血清学鉴定 5.5.1 假定试验： 挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌琼脂培养物， 用致病性大肠埃希氏菌、 侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价 O 血清和出血性大肠埃希氏菌 O157 血 清做玻片凝集试验。当与某一种多价 O 血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价 O 血清 做试验。致泻大肠埃希氏菌所包括的 O 抗原群见表 2。如与某一个单价 O 血清呈现强凝集 反应，即为假定试验阳性。
表 2 致泻大肠埃希氏菌所包括的 O 抗原群 大肠埃希氏菌的种类 EPEC EHEC EIEC ETEC 所包括的 O 抗原群 O26 O55 O86 O111ab O128ab O142 O158 O157 O28ac O29 O112ac O115 O124 O143 O144 O152 O164 O167 O135 O136 O114 O119 O125ac O127
第二法 PCR 方法1
7 操作步骤 增菌、分离、初步生化试验同 5.1-5.3。 用 5.3.1 中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，采用 PCR 检测特异毒力基因方法鉴 别 5 种致泻大肠埃希氏菌，然后再进行血清学分型实验。 8 PCR 试验 8.1 标准菌株 标准菌株一览表见表 3。 表3 菌株名称 EPEC STEC Baidu NhomakorabeaTEC EIEC EAEC 大肠埃希氏菌 8.2 引物合成 多重 PCR 引物序列见表 4。
O6 O11 O15 O20 O25 O27 O63 O78 O85 O114 O115 O126 O128ac O148 O149 O159 O166 O167 5.5.2 证实试验：制备 O 抗原悬液，稀释至与 Mac Farland 3 号比浊管相当的浓度。原效价 为 1： 160～1： 320 的 O 血清， 用 0.5%盐水稀释至 1： 40。 稀释血清与抗原悬液在 10mm× 75mm 试管内等量混合，做单管凝集试验。混匀后放于 50℃水浴锅内，经 16h 后观察结果。如出 现凝集，可证实为该 O 抗原。 6 结果与报告 综合以上生化试验、血清学试验报告结果。