一个新的色谱分离度公式
色谱分离度及其优化简介
色谱分离度及其优化简介黄秋鑫（学号：200728016537055）中国科学院广州地球化学研究所摘要： 本文介绍色谱分离度的含义、影响分离度因素及常用优化离子色谱分离度方法，对实际应用色谱法有一定的启发与帮助。
关键词： 色谱法 分离度 优化一、分离度的定义分离度（resolution ）又称分辨率[1]，为了判断难分离物质对在色谱柱中的分离情况，常用分离度作为柱的总分离效能指标，是全面反映两峰分离程度的参数。
分离度等于相邻两峰保留时间之差与两组分色谱峰的峰底宽度之和的一半的比值： ())()()()(21B b A b A R B R t t R ωω+-= 或 ⎪⎪⎭⎫ ⎝⎛+-=)(21)(21)()(699.1)(2B A A R B R t t R γγ相邻两组分保留时间的差值反映了色谱分离的热力学性质；色谱峰的宽度则反映了色谱过程的动力学因素。
因此分离度概括了这两方面的因素，并定量地描述了混合物中相邻两组分的实际分离程度，因此用它作为色谱柱的总分离效能的指标。
当两峰等高，峰开对称且符合正态分布时，可以从理论上证明，若R=0.8时，分离程度89％；R=1.0时，4δ分离（峰间距4δ），分离度达98%；R=1.5时，6δ分离，分离度达99.87%。
一般采用R=1.5作为相邻两峰完全分离的标志。
图1从图1中可以看出，(c)中A/B 两峰完全分离。
实现分离的条件：相对保留值a 增大（组分分配比之差△K D 增大），分离的可能性增大，其峰间距也增大；柱效能n 增大，峰宽减小。
二、色谱基本分离方程式假设相邻两峰的峰底宽度相等，即ωb(1)=ωb(2)()()()⎪⎭⎫ ⎝⎛-⎪⎭⎫ ⎝⎛+=⎪⎪⎭⎫ ⎝⎛-⎪⎭⎫ ⎝⎛+=-⎪⎭⎫ ⎝⎛+=⎪⎭⎫ ⎝⎛+=∴⎪⎭⎫ ⎝⎛+===∴⎪⎪⎭⎫ ⎝⎛=-=-=-=-=+-=ααωωωωωωωωω1'1'411'1'411'1'41'1'41','1'4116','161''1'''''''2122,12,122,122)2()2(2)2()2(22,1)2()2()2()2(2,1)2()2()2()1()2()2()2()1()2()1()2()1()2(k k n r r k k n r k k n R k k n t k k n n n n t t n r t t r t t t t t t t t t R b R effeff eff b R b R effb R R b R b R R R R b R R b b R R 又 其中：n 为色谱柱效；k ’为分配比；α=r 1,2为相对保留值；t 为保留时间；t ’为相对保留时间；ω为峰宽。
2-3色谱分析导论-2学时-√分离度及分离条件选择-09-9-22
② 分离极性组分，一般选用极性固定液。各组分按极性大小顺序 流出色谱柱，极性小的先出峰。
③分离非极性和极性（或易被极化的）混合物，一般选用极性固 定液。此时，非极性组分先出峰，极性的(或易被极化的)组分后出 峰。
④分离醇、胺、水等强极性和能形成氢键的化合物，通常选择极 性或氢键性的固定液。
四、气化温度的选择：
色谱仪进样口下端有一气化器，液体试样进样后，在此瞬间气化; 气化温度一般较柱温高30~70℃防止气化温度太高造成试样分解。
五、检测器选择
检测器 灵敏度、适用范围、操作难易、稳定性等各不相同。 根据分析对象和分析要求合理选择。
2.4.2、分离条件选择
一. 固定相的选择：
对气－固色谱一般根据样品性质，参照常用固体吸附剂的使用 范围选择；对气－液色谱，则根据“相似相溶”的原则进行选择：
∴R =
n ×(
k2
α -1 )×( )
4 1+k2 α
n
=
16R
2 s
×(
α )2 α -1
1 ×(
+ k2 k2
)2
n = 1+k 2 k
n eff
∴ n 有效
=
16R
2 s
•( α )2 α -1
∴R =
n eff
α -1 ×( )
4α
∴R =
n α -1 k
•( )•(
) 色谱分离方程式
4 α 1+k
可合理地假设 k1 ≈k2 =k， Y1≈Y2 =Y。
由n = 16( tR )2 Y
Y=
16t
HPLC分离条件的优化步骤以及定量计算公式的选择
不同柱子其保留性差异很大，相同条件，不 同柱子比例会不一样。 不同色谱柱需合适的pH范围，一般在2.57.5之间，有的色谱柱比较耐碱，kromasil可以到 10，而杂化xterra在1－12,XDB在pH3-11.
3.分离条件的优化
3.1 容量因子和死时间的测量
在HPLC分析中，容量因子k′是一个非常重要的 参数，对如何选择流动相的溶剂组成、改善多组分 分离的选择性都发挥着重要的作用。 k′=t ′R／t M
式中，Ai—组分i的峰面积；
ƒ′i—i组分的质量校正因子
4.定量计算公式的选择
二、标准曲线法（外标法 / 直接比较法） 在HPLC中比较常用，是一种简便、快速的绝对 定量方法（归一化法是相对定量方法） 测定样品中组分含量时，根据峰面积和峰高在标 准工作曲线上直接查出进入色谱柱中样品组分的浓度 ，也可通过下式计算 pi / % = f i / A i(h i) 式中，A i(h i) —i组分的峰面积（峰高） f i—i组分标准工作曲线的斜率
3.分离条件的优化
2.由色谱柱的操作参数进行计算 t M =ΦηL2/△pd p2 式中，Φ为阻抗因子；η为流动相的动力黏度；L 为柱长； △p为柱压力降；d p为固定相粒径 3.依据经验公式计算 当dc/dp≥10 时，可按下述公式计算 t M： t M =L / u 对全多孔固定相 对非多孔固定相 u=1.5F/dc2 u=3F/dc2
3.分离条件的优化
对组成复杂、由具有宽范围k′值组分构成的 混合物，需用梯度洗脱技术，才能使样品中每个组 分都在最佳状态下洗脱出来。（采用梯度洗脱通常 能将组分的k′值减小至原来的1/10~1/100，从而 缩短了分析时间。）
3.4 相邻组分的选择性系数和分离度的选择
液相色谱计算公式
液相色谱计算公式
液相色谱（Liquid Chromatography，简称LC）的计算公式包括保留时间和保留率的计算公式。
1.保留时间（Retention Time）的计算公式：
保留时间是指化合物在液相色谱柱中停留的时间，它是液相色谱中最常用的性能参数之一。
保留时间（t_R）的计算公式为：
t_R = t_m - t_0
其中，t_m表示化合物在色谱柱中出现的时间，称为终点时间（即化合物在色谱柱中运行的总时间）；
t_0表示无保留物（即溶剂前端）出现的时间，称为起点时间（即样品注入柱后到出现第一个色谱峰的时间）。
2.保留率（Retention Factor）的计算公式：
保留率是指化合物在色谱柱中停留时间与无保留物停留时间之比，用于评估化合物在液相色谱中的保留能力。
保留率（k）的计算公式为：
k = (t_R - t_0) / t_0
其中，t_R表示化合物的保留时间，t_0表示无保留物的保留时间。
在实际的液相色谱分析中，需要根据所使用的色谱柱、流动相组
成和流速等参数来选择适当的计算公式和相应的数值，以获得准确的
结果。
另外，液相色谱还有其他常用的计算公式，如峰面积的计算公式、分离度的计算公式等，这些公式可以用于进一步量化和评估色谱分离
效果和样品组成。
高效液相色谱涉及的数据处理基本公式解析
高效液相色谱涉及的数据处理基本公式解析（宁波大学海洋学院赵百添）1.保留时间t R2.调整保留时间t'R扣除死时间后的保留时间,也称折合保留时间。
在实验条件（温度、固定相等）一定时，t'R只决定于组分的性质，因此，t'R（或t R）可用于定性分析。
反映了被分析的组分与色谱柱中固定相发生相互作用，而在色谱柱中滞留的时间，它更确切地表达了被分析组分的保留特性。
3.死时间t M不被固定相滞留的组分，从进样到出现最大峰值所需的时间。
关系：t R=t'R+ t M4.保留体积V R从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积,又称为洗脱体积。
V R＝F × t R5.死体积V M不被固定相滞留的组分，从进样到出现最大峰值所需的流动相体积。
V M＝F × t M6.调整保留体积V'R扣除死体积后的保留体积。
V'R＝V R－V M或V'R＝F×t'R7.分配系数K指一定温度下,处于平衡状态时，组分在固定相中的浓度和在流动相中的浓度之比，以K表示。
分配系数反映了溶质在两相中的迁移能力及分离效能，是描述物质在两相中行为的重要物理化学特征参数。
分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。
在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（Cs、Cm 很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。
这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。
因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。
在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K 值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。
混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。
第四章 色层分离法
HETP m1u 考虑u、d对HETP的影响，有下列关系式：HETP ＝mdb1ub2 b2 0.2 ~ 0.6 b1 1.4 ~ 2.0
HETP m2 d
a2
a1
§4.4离子交换色层
§ 4.4.1 分配容量
[ RA] [ A] K [ RB] [ B ]
A B
以 W S 表示色层柱内交换剂的质量，Vm表示流动相 （淋洗剂）的体积
t R2 t R1
,
因 t R t R ，且 与 总是大于1， 与
,
1 k2 1 k1
选择性越高。
越大，柱子的
§4.3 基本理论
§ 4.3.1 平衡塔板理论
（Martin塔板理论） 1.基本假设
实际情况:流动相在色层柱内 不断向下移动时，组分在两相间 发生分配，此时柱内的组分浓度 在两相中的变化是连续的，分配 是不平衡的。
2）α影响
若α＝1两组分不可能分离，略α大于1就可能实现分离，α ＝2分离就相当容易实现。当α＞1，式4－23中（α－1）／α， 可从0.001一直增加到1，变化范围达103，相比之下若k从1增加 到50，k/(1+k)只从0.5变到接近于1，变化范围只有0.5，显然相 对保留值是提高分离度更重要的因素。
1 2
W 4
§ 4.2.3 保留值
保留值反映了溶质与固定相作用力的大小，是 色谱过程热力学特性的重要参数。通常用保留时间 和保留体积表示。 1.比移值
溶质谱带平均迁移速度UX小于流动相迁移速度U，定义 UX与U之比值为比移值Rf.
溶质谱带平均移动速度 UX Rf 溶剂（流动相）的移动速度 U
§ 4.3.2 色层分离理论 1、 分离度（分辨率）
气相色谱法分离条件的选择
三、样品预处理
对于一些挥发性或热稳定性很差 的物质，需进行预处理，才能用 于分离分析。
1.分解法 2.衍生化法：酯化法，硅烷化法
第五节 毛细管气相色谱法
一、毛细管气相色谱法的特点和分类 (一)毛细管气相色谱法的特点 1.分离效能高。 2.柱渗透性好（载气流动阻力小）
3.柱容量小，允许进样量小。一般采用 分流进样技术和柱后尾吹。
4.易实现气相色谱-质谱联用。
5.总柱效高。
6.应用范围广。
(二)毛细管柱的分类
• 毛细管柱的内径一般小于1mm,可分为 开管型和填充型；常规、小内径、大 内径毛细管柱等。
1.填充型毛细管柱 填充毛细管柱：先在玻璃管内松散地 装入载体，拉成毛细管再涂固定液。 微型填充柱:柱径细,载体颗粒细到几 十到几百微米。
(二)毛细管色谱操作条件的选择
1.毛细管柱的直径 2.载气的选择 3.液膜厚度
1.毛细管柱的直径
H 2Dg r2 (1 6k 11k2 ) u
2kd
2 f
u
u
24Dg (1 k)2
3(1 k)2 Dl
H径与成柱反内比径。平方r2成正比，uopt与柱内
内径以100～300μm为宜。 快速分析采用细内径、短
程序升温可以是线性的，也可以是 非线性的。
例: 程序升温与恒定柱温分离沸程为 225℃的烷烃与卤代烃9个组分的混合物 的差别。
• 图a,恒定柱温 Tc=45℃,
• 图b,恒定柱温，但 Tc=120℃
• 图c：为程序升温。
4、柱长和内径的选择
• 分离度正比于柱长的平方根，即
( R1 )2 n1 L1
分离度的计算及其影响因素
分离度的计算及其影响因素Bruce Lee1.分离度定义在HPLC或者GC色谱中，分离度用以衡量相邻洗脱组分的分离情况，是将色谱柱分离效率与流动相效率综合在一起的一个参数，分离度越大，相邻两组分分离地越好。
一般地，分离度小于1时，两色谱峰重叠较严重；分离度等于1(4σ)时，两组分被彻底分离部分占98%，对每个色谱峰来说，其峰纯度亦为98%；分离度为1.5(6σ)时，两组分被彻底分离部分占99.7%，通常以R=1.5作为相邻两组分完全分离的标志。
对于色谱峰积分面积比为1：1的两组分的分离情况与分离度的关系，如下图1A与1B所示。
1.1.分离度的计算对于分离度的计算有以下几种方法：(1)利用保留时间以及基线峰宽，按照下式1进行计算；(2)利用保留时间以及半峰宽，按照下式2进行计算；各参数意义详见下图2所示。
(3)利用色谱柱柱效(N)，分离因子(α)以及保留时间较长的组分的容量因子(K)，按照下式2进行计算；上述三个公式，理论上都可以对分离度进行计算，但公式3需要得到色谱柱的柱效，而对色谱柱而言，针对不同的化合物其柱效是不一样的，尽管仪器操作条件完全相同。
因此，该式更多应用于理论推导。
上述公式1与公式2则更多应用于实际色谱图中相邻洗脱组分色谱峰分离度的计算。
对于公式1，其应用范围是两色谱峰基本基线分离及其以上的情况，因为该式需要测定明确的基线峰宽；当基线峰宽不能明确测量时(如两相邻组分色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度比值小于50%时，如图3所示)，则比较适宜选择公式2计算分离度，因为该式测量的是半峰高处的峰宽。
1.2.峰高比法预测分离度公式1以及公式2可解决基线分离以及色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度比值小于50%时，对于两相邻色谱峰分离度的计算需求。
当两相邻组分色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度比值大于50%时(如图4所示)，由于无法精确测量基线峰宽以及半峰高峰宽，使用公式1以及公式2计算分离度受到很大程度的限制。
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式（6）和式（7）为本文得到的新色谱分离度表达式。
2 不同分离度公式的比较与应用
（7）
图 2 是庆大霉素注射液的实际分离色谱图，选择其中三 对相邻组分，如图 2 所示，第一对组分是组分 1 和组分 2；第 二对相邻组分是组分 3 和组分 4；第三对相邻组分是组分 5 和 组分 6，每个组分的色谱峰参数见表 1，分 0.23 0.37 0.52 0.50 0.53
分离因子 a 1.146 1.108 1.135
备注：上表中 N1，N2，N3，N4，N5，N6 代表组分 1，组分 2，组分 3，组分 4，组分 5，组分 6 的柱效
从图 2 可以看出，组分 1 和组分 2 没有分开，如果按第一组和第二组分离度公式计算，分离度居然达 到 1.5，认为他们完全分开，显然与事实不符。如果按第三组公式和新公式计算，分离度为 1.44，符合两 组分没有完全分开的实际情况。组分 3 和组分 4 刚刚完全分离开，如果按第一组和第二组分离度公式计算， 有些公式计算的分离度结果居然还小于 1.5，认为他们没有分开。按第三组公式和新公式计算，分离度结 果为 1.64，说明两组分完全分离。组分 5 和组分 6 完全分离开，用第一组公式和第二组公式计算分离度结 果与分离度定义公式计算的结果也有一定差别，但不明显。第三组公式和新公式，计算的分离度结果与分 离度定义公式计算的结果一致。
摘要1：推导出一个新的分离度公式，新公式既保证了计算分离度结果的准确性，同时又体现了分离度与柱效，容
量因子和分离因子三者之间的相互关系。
关键词：色谱；分离度公式；柱效
中图分类号：O658
文献标识码：A
文章编号：1007-984X(2007)04-0001-04
分离度和柱效是色谱学中的两个重要概念。柱效用于描述在特定操作条件下分离系统的总体分离能力， 是评价整个色谱分离系统的主要参数之一。分离度是描述两种组分被分离程度的指标，其不仅与柱性能有 关，也与样品的结构、性质有关。不同柱系统对特定结构样品的分离选择性不同，可能导致分离度有很大 的差异。
1.44
1.44
1.44
第二对组分 RS 1.64
1.97
1.40 （N3 ）2.00 （N4）1.54 （N3 ）1.81 （N4）1.39 （N3 ）1.90 （N4）1.46 （N3 ）1.90 （N4）1.46 （N3）1.90 （N4）1.46
1.64
1.64
1.64
·３·
第三对组分 2.67
第4期
定 义 式
第 1 组
第 2 组
第 3 组
一个新的色谱分离度公式
表 2 分离度公式汇总及应用
分离度公式
文献
第一对组分 RS
RS
=
t2 − t1 w1 / 2 + w2
/2
[1]
1.44
Rs=
N1 (a −1) k1
4
1 + k1
Rs =
N2 ( a −1) k2 4 a 1+ k2
Rs =
N (a −1) k
2.75
2.60 （N5 ）2.79 （N6）2.92 （N5）2.46 （N6）2.57 （N5 ）2.61 （N6）2.73 （N5）2.61 （N6）2.73 （N5）2.61 （N6）2.73
2.67
2.67
2.67
新 公
Rs =
N × (a −1) × k1 =
4
k +1
N × a −1× k2 4 a k +1
常见的分离度公式很多，按不同分离度公式计算庆大霉素 注射液中这三对相邻组分的分离度，计算结果，加以系统汇总见 表 2。
图 2 庆大霉素注射液的实际分离色谱图
分类分组 第一对组分 第二对组分 第三对组分
组分编号 组分 1 组分 2 组分 3 组分 4 组分 5 组分 6
死时间 t0(min) 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50
已知分离因子 a = k2 / k1 ，则： k2 − k1 = k1a − k1 。令 k = (k1 + k2 ) / 2 ，整理式（2）得
t1 + t2
t1 + t2
Rs
=
2 w1 + w2
× k1a − k1 k +1
=
2 w1 + w2
× (a −1) × k1 k +1
2
2
（3）
收稿日期：2007-03-21 基金项目：国家自然科学基金资助（20675083）。 作者简介：余盛刚（1974-），湖北英山人，齐齐哈尔大学 2005 级分析化学专业硕士研究生，Email:weibingzhang@。
·４·
齐齐哈尔大学学报
2007 年
[11] Suematsu , K.,and Okamoto,T., [J] .Chromatogr.sci.,1989,27:13~17 [12] Eppert, G.. , [J] Z.Chem.,1986,26:325
A New resolution equation YU Sheng-gang1,2, WEI Yuan-long3, LI Tong2,3, ZHANG Wei-bing1,3
(t2 + t1) / 2 = t0 (k1 + k2 + 2) / 2 ，这样式(1)可以被改写成：
t1 + t2
t1 + t2
RS =
2 w1 + w2
2
×
(
(k2 k1 +
2
− k1)t0 k2 + 1)t0
=
2 w1 + w2
×
k2 − k1 k1 + k2 + 1
2
2
（2）
图 1 两组分的分离色谱图
4
1+ k
Rs =
N ( a −1) k 4 a 1+ k
Rs =
N (a −1) k 2 a +1 1+ k
Rs =
N (a −1) k1
4
1+ k
Rs =
N ( a −1) k2 4 a 1+ k
Rs =
N a −1 k ()
2 a +1 1+ k
Rs =
N1
a (
−1 )
2k
2
a +1 (1 + k1 ) + (1 + k2 )
Abstract: A new resolution equations are compared with others previously introduced and are shown to be considerably more accurate than the most commonly employed resolution equations . The new equation are identical in form with the most commonly employed equations ,a distinct advantage over previously introduced alternatives. Key words: chromatography, resolution equation, column efficiency
88:26 [3] Foley , J. P., [J]. Analyst ,1991,116:1275~1279 [4] 张玉奎，张维冰，邹汉法. 分析化学手册(第 2 版)第六分册：液相色谱分析[M]. 北京：化学工业出版社，2000. [5] Knox, J. H., J.Chem.soc.,1961，1: 433~441 [6] Purnell, J. H., [J]. Chem .soc.,1960，2: 1268~1274. [7] Robinson, J. W. Undergraduate Instrumental Analysis, 4 rd ed[M]. New York: Marcel Dekker, 1987:421. [8] Karger,B.L ., [J].Gas Chromatogr.,1967,5: 161~169. [9] Veronika R. Mexer. Practical high liquid chromatography 4 rd ed[M] . New York : wiley ＆Sons , 2004: 32 [10] Said A.S., [J]. Gas Chromatogr.,1964,2:60~71
表.1 色谱峰型参数
保留时间 tR(min) 4.62
保留因子 k 0.848
4.93
0.972
9.26
2.704
9.99
2.996
12.70
4.08
14.08
4.632
柱效 N (N1) 8537.76 (N2) 7351.198 (N3)10021.633 (N4)5905.331 (N5)10322.56 (N6)11292.054
·２·
色谱分离的有效塔板数 如果定义平均有效塔板数 将式（5）带入式（3）中有
及
齐齐哈尔大学学报
Neff = 16(t / w)2
N = 16( t1 + t2 )2 w1 + w2
Rs =
N × (a − 1) × k1
4
k +1
2007 年
（4） （5） （6）
Rs =
N × a −1 × k2 4 a k +1
1 公式推导
考虑图 1 所示的色谱分离谱图。组分 1 和组分 2 的保留时间分别为