高效液相色谱法测定饮料中咖啡因含量
高效液相色谱法测定咖啡因
四、注意事项
1、流动相和样品溶液需过滤后使用。 2、流动相还进样器。 5、实验结束后要冲洗系统和色谱柱。
五、数据处理
1、根据标准溶液色谱图进行咖啡因成分的定性；
2、绘制标准曲线并打印；
2、计算样品中咖啡因含量。
End！
O H3C N CH3 N N CH3
O
定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。
二、实验原理
色谱法
利用混合物不同组分在固定相和流动相中 分配系数(或吸附系数、渗透性等)的差异，使不
同组分在作相对运动的两相中进行反复分配，
实现分离的分析方法。
色谱法分类
色谱法
气体
超临界流体
液固色谱 （LSC）
液体
液液色谱 （LLC） 胶束电动色谱 （MEKC）
气固色谱 超临界流体色谱 （GSC） (SFC) 气液色谱 （GLC）
键合相色谱 亲和色谱 吸附色谱 (BPC) (AC) （LSC） 尺寸排阻色谱 离子交换色谱 毛细管电色谱 (SEC) (IEC) (CEC)
进样口 高压泵
色谱柱 检测器
流动相溶剂
仪器分析实验
高效液相色谱法测定饮料中的 咖啡因
主要内容
一、实验目的 二、实验原理
三、实验步骤
四、注意事项
五、数据处理
一、实验目的
1、学习高效液相色谱法分离咖啡因的原理。
2、练习高效液相色谱仪的基本操作。
3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析
的基本方法。
二、实验原理
咖啡中含咖啡因约1.2～1.8%，茶叶中含2.0～4.7%，可 乐饮料和APC药片中均含有咖啡因。 其分子式为C8H10O2N4，结构式：
废液
高效液相色谱法测定茶饮料中的咖啡因含量
高效液相色谱法测定茶饮料中的咖啡因含量作者：宁炜来源：《食品安全导刊》2022年第08期摘要：建立了高效液相色谱法测定茶饮料中咖啡因含量的分析方法。
试样经预处理后，过0.45 μm微孔水相滤膜，经Promosil C18色谱柱分离，以甲醇和纯水为流动相，等度洗脱，二极管阵列检测器检测。
结果表明，咖啡因在0.059～1.960 μg/mL与4.91～196.30 μg/mL时线性关系良好，线性系数均大于0.999，加标回收率为96.43%～103.31%，方法的重复性RSD为1.56%，检出限为0.059 mg/kg，定量限为0.2 mg/kg。
该方法前处理简便，定性定量准确，可用于茶饮料中咖啡因含量的批量快速检测。
关键词：咖啡因;茶饮料;高效液相色谱法Determination of Caffeine in Tea Drinks by HPLCNING Wei（Shanxi Inspection and Testing Center Shanxi Institute of Standard Measurement Technology， Taiyuan 030012， China）Abstract： The method for the determination of caffeine in tea beverage by high performance liquid chromatography was established. After pretreatment， t he sample passes 0.45 μm microporous aqueous phase filter membrane， separated by Promosil C18 chromatographic column， eluted with pure water and methanol as mobile phase， and detected by diode array detector. The results showed that caffeine ranged from 0.059～1.960 μg/mL and 4.91～196.30 μg/mL， the linear relationship within was good， the linear coefficients were greater than 0.999， the recovery was 96.43%～103.31%， the repeatability RSD of the method was 1.56%， the detection limit was0.059 mg/kg， and the quantitative limit was 0.2 mg/kg. The method is simple in pretreatment，accurate in qualitative and quantitative analysis， and can be used for rapid batch determination of caffeine in tea drinks.Keywords： caffeine; tea drinks; high-performance liquid chromatography咖啡因，又稱咖啡碱，是一种从咖啡或茶叶中提取的黄嘌呤生物碱化合物，具有使人体中枢神经系统兴奋的作用，适度使用可以祛除疲劳、振奋精神，然而长期或超剂量摄入会对人体肝肾功能造成损害，而且其具有成瘾性，停用后会出现身体疲乏、精神不振等症状[1-4]。
饮料中咖啡因含量的高效液相色谱分析
实验八饮料中咖啡因含量的高效液相色谱分析一、实验目的1．进一步熟悉和掌握高效液相色谱议的结构。
2．巩固对反相液相色谱原理的理解及应用。
3．掌握外标法定量及Origin软件绘制标准曲线。
二、实验原理咖啡因又称咖啡碱，属于黄嘌呤衍生物，化学名为1，3，7－三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，是使人精神亢奋。
咖啡因在咖啡中的含量约为1.2％～1.8％，在茶叶中约为2.0％～4.7％。
可乐饮料、止痛药片等均含咖啡因。
咖啡因的分子式为C8H10O2N4，结构式为：NN N NOO3H3C CH3在化学键合相色谱中，对于亲水性的固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，这种情况称为正相化学键合相色谱法。
反之，若流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相化学键合相色谱法，该方法目前的应用最为广泛。
本实验采用反相液相色谱法，以C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，再根据试样中的咖啡因峰面积，由其标准曲线算出其浓度。
三、实验仪器和试剂1.岛津LC-20A高效液相色谱仪2. 咖啡因（AR），超纯水由纯水机制得，甲醇为色谱纯，配溶液的甲醇为分析纯。
3. 咖啡因标准溶液的配制（1）标准贮备液配制含咖啡因1000 ug/mL的甲醇溶液（实验室准备）。
（2）标准系列溶液用上述贮备液配置含咖啡因10 ug/mL，20 ug/mL，40 ug/mL，50 ug/mL，60 ug/mL的甲醇溶液，备用。
4. 试样市售的可口可乐和百事可乐四、实验条件）颗粒度为5 um的固定相，长150 mm 内径4.6 mm1. 色谱柱（XDB-C182. 流动相甲醇 : 水 = 60 : 40，流量 0.5-1 mL/min3. 检测器紫外光度检测器，270 nm4. 进样量 10 uL五、实验步骤1.制备所需的流动相，有机溶剂用0.45µm的有机滤膜过滤，水溶液用0.45µm 的水滤膜过滤，于超声波发生器上脱气20 min.2. 将配置好的分析试样分别过滤后于超声波发生器上脱气15 min.3. 打开A泵、B泵、检测器、柱温箱及电脑的电源开关。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量
烷烃）键合到硅胶基质上，分离过程中以极性溶剂为流 动相，实现弱极性化合物的分离。与其他组分（如：单 丁酸、咖啡酸、蔗糖等）相比，咖啡因为弱极性化合物 。
高效液相色谱法测定饮 料中咖啡因的含量
2020年8月1日星期六
102.2 实验原理
• 咖啡又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称 为l,3,7-三甲基黄嘌呤，是由茶叶或咖啡中提取而得的 一种生物碱。它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡 中含咖啡因约为l.2%～1.8%，茶叶中约为2.0%～4.7%。 可乐饮料、APC药片均含咖啡因。其分子式为C8H10O2N4, 结构式为：
•102.4 注意事项
• （1）钢瓶的工作压力，一定要控制在所规定范围 内，不得超压工作。必须切记，保障安全。 • （2）实验结束后，检查仪器是否正常，关闭是否 正确。
•102.5 问题讨论
•
（1）解释用反相柱n-C18测定咖啡因的原理。
•
（2）在色谱分析中为什么常采用相对校正因子
fi？
•102.6 参考答案
• 5．将进样阀从装载（LOAD）位转向进样（ 1NJECT0位，同时按标记钮(MARKER)，使在记录纸上打 开进样信号。 • 6．当咖啡因的色谱峰出完后，按照步骤4～5连续 操作2次，使最低浓度的标准试液获得3张色谱图。 • 7．按标准试液浓度增加的顺序，按步骤4～6操作 ，使每一种标准样获得3个数据。 • 8．取2 mL咖啡饮料试液放入25 mL容量瓶中（或 取5 mL茶液放入50 mL容量瓶中），分别用流动相稀释 至刻度。 • 9．按步骤4～6操作，分析饮料试液（咖啡或茶） 。
作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量【开题报告】
毕业设计开题报告应用化学高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量一、选题的背景和意义咖啡因（Caffeine ）是从茶叶、咖啡果中提炼出来的一种生物碱。
茶、咖啡、可乐这三大非酒精饮品和许多功能饮料都有咖啡因成分。
适量摄入咖啡因对人体是有益的，如可以缓解工作压力，起到提神醒脑作用等。
但是，大剂量或长期使用也会对人体造成损害，特别是它也有成瘾性，一旦停用会出现精神萎顿、浑身困乏疲软等各种戒断症状，虽然其成瘾性较弱，戒断症状也不十分严重。
因此也被列入受国家管制的精神药品范围。
所以每人每天咖啡因的摄入量不宜过高。
摄入咖啡因量可分为以下等级:成人每天摄入80 ～250 mg 咖啡因( 1.1 ～3.5 mg/kg·d- 1 ) 为低摄入量, 300 ～ 400 mg ( 4 ～6 mg/kg·d- 1 )为中摄入量，超过500 mg(7mg/kg·d- 1 )为高摄入量。
滥用咖啡因通常也有吸食和注射两种形式，其兴奋刺激作用及毒副反应、症状、药物依赖性与苯丙胺相近。
咖啡因是受国家管制的精神药品。
作为中枢兴奋药中的清醒药,低、中摄入量时能够振奋精神、提高注意力、增强自信心、提高工作效率、减少疲乏感、增强识别能力、提高瞬时口头记忆力。
而高摄入量的咖啡因可引起焦虑、烦躁、失眠、易怒及精细运动功能受损。
作为中枢神经系统兴奋药，小剂量能兴奋大脑皮质，改善思维活动,提高对外界的感应性。
大剂量则可兴奋延髓的呼吸中枢和血管运动中枢,增加呼吸频率和深度。
已有研究表明大量摄入咖啡因容易上瘾 ,导致慢性中毒,引起众多严重后果,如影响睡眠, 引起局部缺血性心脏病，出现心律不齐、心悸及心动过速，降低女性受孕率，提高孕妇自然流产率和致畸率，引发阵发性惊厥和骨骼震颤，损害肝脏、胃、肾等器官,诱发呼吸道炎症、妇女乳腺瘤疾病等。
目前测定咖啡因的方法很多,如薄层色谱法、紫外分光光度法和高效液相色谱法。
前两种方法样品预处理过程比较复杂； HPLC法灵敏、快速、准确,样品预处理较简单,可广泛用于咖啡因含量的测定，对于确保人类健康有着重要的意义。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量在日常生活中，饮料是我们常见的饮品之一。
而咖啡因作为许多饮料中的一种重要成分，其含量的测定具有重要的意义。
高效液相色谱法（HPLC）是一种广泛应用于分析化学领域的技术，它能够准确、快速地测定饮料中咖啡因的含量。
咖啡因，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤，是一种天然存在于咖啡、茶、可可豆等植物中的生物碱。
由于其具有兴奋神经中枢、提高警觉性和缓解疲劳等作用，被广泛添加到各种饮料中，如咖啡、茶饮料、可乐等。
然而，过量摄入咖啡因可能会对人体健康造成一定的影响，如失眠、焦虑、心悸等。
因此，准确测定饮料中咖啡因的含量对于保障消费者的健康和权益至关重要。
高效液相色谱法是一种基于液体流动相和固定相之间的分配作用来分离混合物中各组分的方法。
它具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、重复性好等优点，适用于各种复杂样品的分析。
在测定饮料中咖啡因的含量时，高效液相色谱法通常采用反相色谱模式，即以非极性的固定相和极性的流动相进行分离。
首先，样品的前处理是测定的关键步骤之一。
对于饮料样品，一般需要进行适当的稀释和过滤，以去除其中的杂质和颗粒物，避免对色谱柱造成堵塞和污染。
对于一些含有较多色素和糖分的饮料，可能还需要进行萃取或固相萃取等净化处理，以提高分析的准确性和可靠性。
在进行高效液相色谱分析时，需要选择合适的色谱柱、流动相、检测波长等条件。
常用的色谱柱有 C18 柱，其具有良好的分离性能和稳定性。
流动相通常由水和有机溶剂（如甲醇、乙腈）组成，并添加适量的酸（如磷酸、乙酸）来调节 pH 值，以改善色谱峰的形状和分离效果。
检测波长一般选择在 270 280nm 之间，因为咖啡因在这个波长范围内有较强的吸收。
仪器设备方面，高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、色谱柱、检测系统和数据处理系统组成。
输液系统负责输送流动相，使其以稳定的流速通过色谱柱；进样系统用于将样品准确地引入色谱柱；色谱柱是分离的核心部件；检测系统用于检测分离后的组分，并将其转化为电信号；数据处理系统则对检测信号进行采集、处理和分析，最终给出样品中咖啡因的含量。
高效液相色谱法测定咖啡因含量的研究与探讨
Ｅｋｂｅ ｒ ｇＢ． Ｔｒ ｅ ｎｄｓ Ｂｉ ｏｔ ｅ ｃ ｈｎｏｌ ． １９９５， １３： ４７～５１．
［ ８］ Ｓｅ ｌ ｌ ｅ ｒ ｇｒ ｅ ｎ Ｂ． Ｔｒ ｅ ｎｄｓ Ａｎａ ｌ ． Ｃｈｅ ｍ． １９９９ ，
１８（ ３） ： １６４～１７４．
［ ９］ Ｍｅ ｎｇ Ｚｉ ｈｕｉ （ 孟子晖） ， Ｗａ ｎｇ Ｑｉ ｎｇｈａ ｉ （ 王清海） ，
目前测定咖啡因的方法很多， 如薄层色谱法、 碘量法、高效液相色谱法、重量法、分子印迹毛 细 管整体柱液相色谱法和紫外分光光度法等。本文 采用高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量， 具有快速、准确、处理简便的特点， 对碳酸型饮 料 只需超声波脱气、稀释、过滤即可。
实验部分 仪 器 和 主 要 试 剂 。 高 效 液 相 色 谱 仪 、检 测 器 、 甲醇、醋酸铵、醋酸、咖啡因（熔点 ２３７℃标准品）。 色谱条件。固定相为 ＮＯＶＡＰＡＫ Ｃ－ １８ 的不锈 钢柱 （３．９×１５０ｍｍ）； 流动相为 ０．０２ｍｏｌ／ｌ 醋酸铵溶 液－ 甲 醇（８０： ２０）； 检 测 波 长 为 ２５６ｎｍ； 流 速 １１０ｍｌ／ ｍｉｎ； 柱温 ３０℃。 标准系列配制。取咖啡因标准储备液适量， 加 水 配 成 每 毫 升 含 咖 啡 因 ５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、 ２５μｇ 的标准溶液， 各取 １０ｍｌ， 用微 孔 滤 膜 过 滤 弃 去最初 ５ｍｌ， 保留 ５ｍｌ 备用。 样品的处理。取适量的汽水、可乐等饮料样品 于 １００ｍｌ 烧杯中超声脱气 １０ｍｉｎ， 准确吸取 ５ｍｌ 于
关键词： 高效液相色谱法； 咖啡因； 测定。
咖啡因的含量是饮料和茶叶中重要的品质指 标， 其含量测定一直受到分析工作者的关注。咖啡 因又称咖啡碱， 化学名为 １， ３， ７－ 三甲基黄嘌呤， 溶 于水、醇、氯仿、二氯甲烷等溶剂， 是一种中枢神经 兴奋剂。人体和动物实验认为咖啡因是一种较弱 的致突变和致畸物， 可引起局部缺血性心脏病、心 律不齐。
高效液相色谱法测定茶饮料中的咖啡因含量
分析检测高效液相色谱法测定茶饮料中的咖啡因含量宁 炜（山西省检验检测中心(山西省标准计量技术研究院)，山西太原 030012）摘 要：建立了高效液相色谱法测定茶饮料中咖啡因含量的分析方法。
试样经预处理后，过0.45 μm微孔水相滤膜，经Promosil C18色谱柱分离，以甲醇和纯水为流动相，等度洗脱，二极管阵列检测器检测。
结果表明，咖啡因在0.059～1.960 μg/mL与4.91～196.30 μg/mL时线性关系良好，线性系数均大于0.999，加标回收率为96.43%～103.31%，方法的重复性RSD为1.56%，检出限为0.059 mg/kg，定量限为0.2 mg/kg。
该方法前处理简便，定性定量准确，可用于茶饮料中咖啡因含量的批量快速检测。
关键词：咖啡因；茶饮料；高效液相色谱法Determination of Caffeine in Tea Drinks by HPLCNING Wei(Shanxi Inspection and Testing Center Shanxi Institute of Standard Measurement Technology, Taiyuan030012, China)Abstract: The method for the determination of caffeine in tea beverage by high performance liquid chromatography was established. After pretreatment, the sample passes 0.45 μm microporous aqueous phase filter membrane, separated by Promosil C18 chromatographic column, eluted with pure water and methanol as mobile phase, and detected by diode array detector. The results showed that caffeine ranged from 0.059～1.960 μg/mL and 4.91～196.30 μg/mL, the linear relationship within was good, the linear coefficients were greater than 0.999, the recovery was 96.43%～103.31%, the repeatability RSD of the method was 1.56%, the detection limit was 0.059 mg/kg, and the quantitative limit was 0.2 mg/kg. The method is simple in pretreatment, accurate in qualitative and quantitative analysis, and can be used for rapid batch determination of caffeine in tea drinks.Keywords: caffeine; tea drinks; high-performance liquid chromatography咖啡因，又称咖啡碱，是一种从咖啡或茶叶中提取的黄嘌呤生物碱化合物，具有使人体中枢神经系统兴奋的作用，适度使用可以祛除疲劳、振奋精神，然而长期或超剂量摄入会对人体肝肾功能造成损害，而且其具有成瘾性，停用后会出现身体疲乏、精神不振等症状[1-4]。
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实验一、高效液相色谱法测定饮料中咖啡因含量
一、实验目的：
1、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理；
2、掌握高效液相色谱仪的操作；
3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量的基本方法；
4、掌握标准曲线定量法。
二、实验原理：
咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。
咖啡中含咖啡因1.2%－1.8％，茶叶约含2.0%－4.7％。
可乐、APC药片中均含有咖啡因。
其分子式为C8H10O2N4，分子量为结构式：
用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其他组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统，以紫外检测器进行检测。
在整个实验过程中，流动相流速和泵的压力是恒定的，测定他们在色谱图上的保留时间和峰面积后，可直接用保留时间定性，用峰面积作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
三、仪器和试剂
1、仪器
Agilent 1200高效液相色谱仪；
色谱柱（C18）：4.6mm×150mm、粒径5μm；
平头微量进样器：10μl
2、试剂：
1 咖啡因（A.R.）、甲醇（色谱纯）、超纯水、可口可乐（瓶
装）、雀巢咖啡
②1000μg/mL咖啡因储备液：将咖啡因在110℃下烘干1小时，准确
称取0.1000g咖啡因，用超纯水溶解，转移至100mL容量瓶中，定容至刻度，待用。
四、实验内容：
1、色谱条件：
柱温：室温；流动相：甲醇／水＝60：40
流速：1.0mL/min 检测波长：275nm
2、咖啡因标准系列溶液配制：
分别用吸量管吸取1000μg/mL咖啡因储备液1.0、2.0、2.0、4.0、5.0mL于5只50mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，浓度分别为20、40、60、80、100 μg/mL
3、样品前处理：
①将25mL可口可乐置于100mL烧杯中，剧烈搅拌30min或用超声波脱气5min，以赶净二氧化碳。
2 准确称取咖啡0.2g，用水溶解定容至50mL。
3 将2份样品溶液分别进行干过滤（即用干漏斗、干滤纸过滤），
弃去前过滤液，取续滤液，待用。
4 分别取5mL可乐、咖啡溶液用0.4
5 μm 的滤膜过滤，然后注入
2mL自动进样瓶备用。
4、绘制工作曲线：
待液相色谱仪基线平直后，分别注入咖啡因标准系列溶液10μl，重复两次，要求两次所得的咖啡因色谱峰面积基本一致，记下峰面积与保留时间。
5、样品测定：分别注入样品溶液10μl，根据保留时间确定样品中咖啡因色谱峰的位置，重复两次，记下咖啡因色谱峰峰面积。
五、结果处理：
1、确定标准样咖啡因和样品中咖啡因的保留时间及记录不同浓度下其峰面积；
2、根据咖啡因标准系列溶液的色谱图，绘制咖啡因峰面积与其浓度的关系曲线。
3、根据样品中咖啡因色谱峰的峰面积，由工作曲线计算可口可乐、
咖啡中咖啡因含量（分别用μg/mL和mg/g表示）
六、注意事项：
1、液体样品必须经过处理，不能直接进样，虽然操作简单，但会影响色谱柱的寿命。
2、不同牌号的茶叶、咖啡中咖啡因含量不大相同，称取样品可酌量增减。
3、为获得良好结果，样品和标准溶液的进样量要严格保持一致。
七、思考题：
1、用标准曲线法的优缺点是什么？
2、解释用反相色谱柱测定咖啡因的理论基础。
3、在样品干过滤时、为什么要弃去前过滤液？这样做会不会影响实验结果？为什么？。