PCR相关技术在植物病原细菌检测和鉴定中的应用
PCR技术在植物检疫性病害鉴定中的应用
1、样品采集：选择具有典型症状的病害样本进行采集，并做好记录。
2、DNA提取：将采集的病害样本进行处理，去除蛋白质等杂质，提取出其中 的DNA。
3、引物设计：根据已知的病害基因序列，设计出特异性的引物。
4、PCR扩增：将DNA模板、引物、dNTP等反应液加入PCR反应管中，进行PCR 扩增。
5、产物检测：对PCR扩增后的产物进行电泳分析或荧光检测，观察是否有特 异性条带或荧光信号。
3、植物生物安全监测：qPCR技术可以用于植物生物安全监测，如监测外来 入侵植物的扩散情况和评估植物种质资源的遗传多样性。
然而，qPCR技术在植物检疫中的应用也存在一些不足，如对设备要求较高、 对实验条件和操作技能的要求严格，以及可能出现的假阳性和假阴性结果等问题。 因此，需要进一步改进和完善qPCR技术，以提高其准确性和可靠性。
PCR技术在植物检疫性病害鉴定中 的应用
目录
01
一、PCR技术在植物 检疫性病害鉴定中的 应用前沿研究
03 四、PCR技术在植物 检疫性病害鉴定中的 应用案例及评价
二、PCR技术在植物
02 检疫性病害鉴定中的 原理和流程
04 参考内容
植物检疫性病害是指对农业生产和植物生态环境造成严重危害的植物病害， 其鉴定与防治对保障农业生产和生态安全具有重要意义。近年来，随着分子生物 学技术的迅速发展，聚合酶链式反应（PCR）技术在植物检疫性病害鉴定中得到 了广泛应用。本次演示将从PCR技术在植物检疫性病害鉴定中的应用前沿研究、 原理和流程、实验方法和结果分析以及应用案例及评价等方面进物检疫中的应用实践
1、植物病原物检测：qPCR技术可以快速、准确地检测植物病原物，如病毒、 细菌、真菌等。例如，针对水稻矮缩病毒的qPCR检测方法，可以实现对病毒的特 异性识别和定量检测。
pcr技术在植物生物学中的应用研究
张宝华（朔州师范高等专科学校，山西朔州 036000）摘 要：PCR技术是近年来兴起的一项新型技术，具有成本低、效率快、可以对大样本进行分析鉴定等特点，在各个领域都得到了广泛的应用。
本文主要对PCR技术的基本原理和分类进行了简单的阐述，并对PCR技术在内参基因筛选、抗病毒基因检测以及植物病原物检测等方面的应用进行分析，对PCR技术的发展前景进行简单的总结。
关键词：植物生物学；应用；PCR技术中图分类号：Q943.2 文献标志码：AApplication of PCR in Plant BiologyZhang Bao-hua(Shuozhou Normal College, ShanXi shuozhou 036000)Abstract: As a new technology emerging in recent years, PCR technology has the characteristics of low cost, fast efficiency, and can analyze and identify large samples, and has been widely applied in various aspects. In this paper, the basic principle and classification of PCR technology were briefly described, and the application of PCR technology in internal reference gene screening, antiviral gene detection and plant pathogen detection was analyzed, and the development prospect of PCR technology was simply summarized.Key words: Plant biology; Application; PCR technology1 PCR技术原理PCR指的是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），而PCR技术就是一种将待检验的DNA序列于生物体细胞外在酶促作用下进行扩增的技术方法。
基于PCR技术的植物病原菌分子定量检测技术研究进展
基于PCR技术的植物病原菌分子定量检测技术研究进展作者：曹学仁周益林来源：《植物保护》2020年第04期摘要植物病原菌的菌源量是病害发生和流行的重要因子之一，对其精准的定量测定或检测可大大提高植物病害预测的准确性，本文对实时荧光定量PCR （qPCR）与数字PCR在植物病原菌定量检测、以及基于RNA水平的real-time PCR和基于核酸染料（EMA/PMA）与qPCR 相结合的技术在植物病原菌活体定量检测中的应用进行了综述，并展望其在植物病害流行和预测中的应用前景。
关键词植物病原菌; 定量检测; 实时定量PCR; 数字PCR; 活体检测中图分类号： S 432文献标识码： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2019463Research progress in quantitative detection of plant pathogens using PCR techniqueCAO Xueren1， ZHOU Yilin2*（1. Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute ofEnvironment and Plant Protection， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101， China; 2. StateKey Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）AbstractThe inoculum of plant pathogens is an important factor related with disease epidemics. Precise quantification of inoculum greatly help the prediction of diseases. This review summarized the applications of real-time quantitative PCR （qPCR） and digital PCR in the quantification of plantpathogens. The use of real-time reverse-transcriptase PCR and the combination of viability dyes and qPCR in viability detection of plant pathogens were also reviewed. The future perspectives of molecular quantitative detection of the pathogens in plant disease epidemics were discussed.Key wordsplant pathogen; quantitative detection; real-time quantitative PCR; digital PCR; viability detection在植物病害流行过程中，病原菌的菌源量是一种重要的驱动因子，是病害预测的一个重要参数，如土壤中芸薹根肿菌Plasmodiophora brassicae的含量与病害发生程度显著相关，小麦条锈菌Puccinia striiformis f.sp. tritici和白粉菌Blumeria graminis f.sp. tritici的越冬菌量和第二年早春的病情也存在显著的相关性等[1-3]，因此准确获得病原菌的菌源量对于一些病害的预测和治理有十分重要的作用。
聚合酶链式反应_PCR_技术在植物病害诊断中的应用
已用 PCR 进行检测的部分植物 病害见表 1。由表 1 可以得知, 类病毒、 病毒、 细菌、 真菌 都可以通过 P CR 的方法来研究。表中所列的 靶序列一栏, 指的是 P CR 扩增的目的片断。靶
1998 年 8 月 又有细微差别
[ 2]
热带农业科学
第4期
。真菌的 rDNA 有 17S( 18S) ,
PCR 技术是 80 年代中期建立的一项体外 迅速、 大量扩增目的基因经济等特点。已广泛地应用于分子 生物学、 医学、 农学等学科 , 进行基因的克隆、 遗 传分析和疾病诊断等。用于植物病害的诊断研 究是近几年兴起的, 由于它准确、 灵敏、 快速, 因 而特别适宜于检疫性病害的诊断。一旦获得其 特异的引物, 则可在最短的时间内对被检对象
1998 年 8 月
热带农业科学
第4期
olog iques. T hese dEtat, Vniversite Louis Pasteur . Strasboung. F rance 21 Van Den Bulcke, et al. V an M ontagu M and Vandek erckove J. Character ization of vacuolar and ex tracel lular - 1. 3- glueanases of T obacco: Evidence for a strictly co mpartmentalized plant defense system. Pr o. Nat Acad Sci. U SA. 1989, 86: 2673 22 Y oug D H, et al. T he action of tomato and verticilli um albo- atr um gly cosidases on the hyphal wall of V albo- atr um. P hysiol plant pathol. 1982, 21: 411 23 M auch F. M auch- M ani B. and Bo ller T . Antifungal hydrolases in Pea tissue . Inhibiton of fungal
大分子聚合酶链式反应技术在植物病原体检测中的应用
大分子聚合酶链式反应技术在植物病原体检测中的应用近年来，植物病原体的检测成为了农业生产中非常重要的一环，而大分子聚合酶链式反应技术（PCR）则是检测病原体的一种重要手段。
在这篇文章中，我们将探讨PCR技术在植物病原体检测中的应用。
一、 PCR的基本原理PCR技术是通过体外扩增DNA分子的手段来检测病原体的。
具体而言，PCR 过程中，通过引入一对引物来定位被检测的DNA分子，然后通过热循环的方式不断复制出大量的DNA分子，从而实现DNA分子的扩增。
PCR技术相对于传统的检测方式，具有高灵敏度、快速、准确的特点。
这使得PCR技术在病原体检测中得到了广泛应用。
二、 PCR技术在植物病原体检测中的具体应用1. PCR技术在病原体种类鉴定中的应用通过PCR技术，可以根据特定引物的选择来判定被检测样品中所含的病原菌种类。
例如，可以通过选择适当的引物，来鉴定样品中是否存在快速生长的革兰氏阴性菌。
并且，由于PCR技术的高灵敏度和高效性，可以检测出非常微小的DNA 片段，从而有效地避免了病原菌的漏检情况。
2. PCR技术在病原体数量检测中的应用除了在病原菌种类的鉴定中，PCR技术在病原菌数量检测中也具有广泛应用。
该检测方法可以通过对PCR扩增产物进行定量分析，进而实现病原菌数量的精确检测。
对于一些必须要进行数量检测的实践应用场景，PCR技术在这方面的应用是非常有价值的。
3. PCR技术在病原体检测中的其他应用此外，PCR技术还可以在诊断样品中不同的病原体菌株进行区分，为农业生产的全面提高和保障提供有力的技术支持。
三、 PCR技术在植物病原体检测中的优势相对于常规的检测方式，PCR技术在植物病原体检测中具有独特的优势。
首先，PCR技术具有非常高的检测灵敏度，可以检测出较低浓度的病原体。
其次，PCR技术不会受到样品中非目标DNA的影响，可以使得检测结果更加准确。
再者，PCR技术的操作也非常方便，并且操作流程相对简单，因此可以很好地节省实验人员的时间成本和样品成本。
PCR技术在植物病原细菌研究中的应用
PCR技术在植物病原细菌研究中的应用
姬广海;魏兰芳;张世光
【期刊名称】《微生物学通报》
【年(卷),期】2002(029)004
【摘要】利用rep-PCR、AFLP和RAPD等多种基因组指纹分析方法,指纹图谱结合计算机辅助分析,用于研究植物病原细菌群体遗传多样性;遗传多样性图谱有助于理解病原细菌的分类、群体结构,还有利于设计特异、灵敏、快速检测策略用于植物病原检测和病害诊断.已有许多以PCR为基础的检测技术如rDNA-PCR、ITS-PCR、ARDRA等,有很多特异性引物及检测程序,已在植物病原检测和病害诊断中广泛应用.PCR技术的应用和计算机的辅助分析,为植物病原细菌群体动态和生态学知识提供了基本框架,使植物病理学进入一个新时代.
【总页数】5页(P77-81)
【作者】姬广海;魏兰芳;张世光
【作者单位】云南农业大学云南省植物病理重点实验室,昆明,650201;云南农业大学资源与环境学院,昆明,650201;云南农业大学云南省植物病理重点实验室,昆明,650201
【正文语种】中文
【中图分类】S432.42
【相关文献】
1.PMA-PCR技术在植物病原细菌检疫中的应用前景 [J], 刘鹏;牛春敬;胡佳续;冯洁;王金成;黄国明
2.PMA—PCR技术在植物病原细菌检疫中的应用前景 [J], 刘鹏;牛春敬;胡佳续;冯洁;王金成;黄国明;
3.食品检测中PCR技术的应用研究 [J], 李宁;刘艳容;周帆
4.应用分子生物学技术检测布鲁氏菌抗原的研究——Ⅱ PCR技术在动物布鲁氏菌病早期诊断中的应用 [J], 唐浏英;邱海燕;李元凯
5.免疫金银染色技术及其在植物病原细菌研究中的应用 [J], 冯家望;莫晓凤
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pcr技术在植物病理研究中的应用
pcr技术在植物病理研究中的应用PCR技术在植物病理研究中的应用PCR（聚合酶链式反应）是一种分子生物学技术，被广泛应用于植物病理研究中。
PCR技术可以快速、敏感和特异地检测和鉴定病原体，为植物病理学的诊断和监测提供了重要的工具。
在本文中，将探讨PCR 技术在植物病理研究中的应用。
首先，PCR技术在植物病原体的检测中发挥了重要作用。
传统的病原体检测方法需要时间和复杂的步骤，而PCR技术可以在短时间内直接从植物样本中检测到病原体的DNA或RNA。
PCR技术可以用来检测各种病原体，包括细菌、病毒和真菌。
通过设计特异性的引物，PCR可以从复杂的植物组织中选择性地扩增目标序列，提高了检测的特异性和灵敏性。
其次，PCR技术可以用于鉴定植物病原体的种类和亚型。
通过设计不同的引物和扩增特定区域的序列，PCR可以区分不同病原体的基因组。
例如，PCR技术可以用于鉴定病毒家族或属的不同亚型，并确定它们之间的基因差异。
这对于病原体的分类和进一步的病理学研究具有重要意义。
此外，PCR技术在病原体的定量检测中也被广泛应用。
病原体的定量是研究病害发展和植物抗病性机制的重要指标。
PCR技术结合荧光探针或SYBR Green等荧光染料可以定量检测目标病原体的数量。
这种定量PCR技术可以用来评估病害严重程度、病害的扩散速度以及植物抗病性的遗传机制。
此外，PCR技术在病原体的变异分析中也具有重要的应用。
病原体的变异是病害流行和发展的基础，对于病害的预测和治疗也具有重要的意义。
PCR技术可以通过扩增病原体的基因组区域，进行突变分析和序列比较。
这些信息可以用来评估病原体的遗传多样性、进化关系以及抗药性的分子机制。
此外，PCR技术还可以用于植物抗性基因的鉴定和定位。
抗性基因对于植物抗病性的发展和改良具有重要作用。
PCR技术可以用来分离和扩增植物基因组中的抗性基因，进而进行其功能、表达模式和遗传机制的研究。
通过遗传定位和连锁分析，PCR技术也可以帮助我们了解抗性基因的位置和分布。
分子生物学技术在植物病害检测中的应用前景
分子生物学技术在植物病害检测中的应用前景植物病害是影响农业生产的重要因素之一，常常会导致严重的经济损失。
为了及时发现和控制病害的传播，科学家们通过不断创新研究，发展了许多基于分子生物学技术的病害检测方法。
这些方法不仅在精确度上远远超过传统的检测方法，而且在成本、时间和易用性方面也有很大的优势。
本文将探讨分子生物学技术在植物病害检测中的应用前景。
一、PCR技术PCR（聚合酶链反应）是一种通过体外扩增DNA片段的技术，在植物病害检测中具有广泛的应用前景。
该技术能够对微量的DNA进行扩增，从而在缩短检测时间的同时，提高检测灵敏度。
例如，通过PCR技术可以对感染葡萄白粉病的植株进行检测，从而筛选出有病害的植株，采取相应的措施来保护其他健康的植株。
此外，PCR技术还可以用于检测不同种类的病原体，例如细菌、真菌、病毒等等。
二、FISH技术FISH（荧光原位杂交）技术是一种通过用荧光标记的DNA探针与目标DNA序列结合的方法，用于定位和检测染色体中的特定序列。
在植物病害检测中，FISH技术已被广泛应用。
例如，FISH技术可以用于检测病原体在植物内部的分布情况，从而确定病害程度。
此外，FISH技术还可以用于检测植物基因的表达水平，从而深入研究植物病原体的致病机理。
随着FISH技术的不断发展，该技术在植物病害检测中的应用前景将更加广泛。
三、ELISA技术ELISA（酶联免疫吸附法）技术是一种通过用特异性的抗体或抗原与检测物结合，从而实现检测的方法。
ELISA技术在植物病害检测中的应用十分广泛，例如，用于检测病原体的感染状况、检测植物抗病基因的表达水平、甚至可用于检测植物对重金属等污染物的受损程度。
此外，ELISA技术的检测速度快、灵敏度高、操作简便等优点，使其成为植物病害检测中必不可少的技术。
四、NGS技术NGS（下一代测序）技术是近年来发展起来的一种高通量的DNA测序技术，在分子生物学领域中具有重要的应用前景。
PCR-SSCP技术在植物病理学上的应用
PCR-SSCP技术在植物病理学上的应用随着分子生物学技术的发展，检测鉴定基因变异的方法不断涌现。
尤其是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术问世以后，各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因变异研究。
限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)以及随机扩增片段长度多态性(ran-domam plified polymorphic DNA, RAPD)等方法已成为基因变异分析的有力工具。
但这些方法或实验条件要求较高，操作比较繁琐，局限性较大。
1989年Orita提出的单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism, SSCP)作为一种检测基因突变的方法, 经不断改进和完善, 更为简便、快速、灵敏, 可用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入。
1 SSCP技术的基本原理在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中，单链DNA的迁移率除与DNA长度有关外，更主要决定于DNA单链所形成的空间构象，相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异，所形成的构象就会不同，PCR产物经变性后进行DNA凝胶电泳时，每条单链处于一定的位置，靶DNA中若发生碱基缺失、插入或置换时，就会出现泳动变位，从而提示该片段的基因变异存在。
该法自1989年首次报告以来，已广泛用于人类癌基因、抑癌基因和遗传病相关突变的快速检测。
Amplified mutant and wild-type alleles of exon 8from the p53 gene. Separation by SSCP run at aconstant 30 W for 3.5 hours at 8 °C in 1x TBE on an8% acrylamide/bis gel (37.5:1) with 3.5% glycerol.Lane 1, undenatured mutant allele; lane 2, mutantallele; lane 3, wild-type allele; lane 4, undenaturedwild-type allele.2 PCR-SSCP技术的优点原理和操作简单，不需要特殊仪器，技术容易掌握；实验步骤少，周期短；成本低，所用试剂均价格低廉；可用非同位素法检测；适用于大样品筛选。
聚合酶链反应技术在病原菌检测中的应用
聚合酶链反应技术在病原菌检测中的应用病原菌是一种可能引起疾病或感染状况的生物体，它们可能存在于生活周围的许多物体中，例如水、食物和空气中。
传统的病原菌检测方法是通过培养和观察细菌来确定是否存在病原菌。
但是，这种方法存在着许多问题，比如需要很长的时间和耗费大量的资源。
聚合酶链反应技术(PCR)解决了这些问题，这种技术能够更加快速、准确地检测病原菌，因此在医学诊断、食品安全以及环境检测等领域得到广泛应用。
PCR技术的原理PCR技术是一种基于DNA分子互补匹配的技术，能够在体外复制DNA分子。
PCR技术的实现需要引入一种叫做聚合酶的酶，这种酶能够识别特定的DNA序列并在这些序列的两侧进行复制，从而使得该序列得以扩增。
此外，PCR技术还需要反向引物和正向引物，这些引物是针对特定区域的两个小分子。
在PCR反应中，这两个引物将与DNA序列的两端结合，确保只有位于特定位置的序列扩增。
PCR反应的结果是产生大量的复制子，扩增出了感兴趣的DNA序列。
PCR技术的应用PCR技术是一种高灵敏度、高专一性的技术，这种技术不仅能够检测病菌，同时还可以检测病菌的药物耐药性和基因变异性。
下面，我们将介绍PCR技术在不同领域的应用。
医学诊断PCR技术在疾病诊断领域得到了广泛应用。
病原菌的DNA序列能够明确识别病原菌，并且在感染期间其DNA形状也能够发生变化，因此，通过PCR技术能够确定病人是否被感染。
此外，PCR技术可以检测病原菌的抗药性和基因变异性，从而为治疗提供更加精确的信息。
食品安全食品中可能存在着大量的病原菌，如果食用这些食品将有可能导致感染。
采用PCR技术能够更加快速的检测食品中的病原菌，这将有助于及早防范食品安全风险。
环境检测PCR技术还能够用于环境检测，例如检测污染的水、空气以及土壤中是否存在病原菌。
此外，环境检测也可以运用PCR技术来检测是否存在特定的非病原菌微生物，这将有助于判断环境的安全性。
总结PCR技术通过体外复制DNA分子、引入聚合酶和引物等手段，在体外复制出感兴趣的特定DNA序列。
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2006年第4期(总第105期)广西热带农业45聚合酶链反应(p ol y m erase chain reaction,PCR)是1983年由美国PE—C etus公司的K ar y M ullis等[1]发明,1985年公开报道的一种体外核酸扩增系统。
PCR 及其相关技术具有快速、灵敏、操作简便等优点,已广泛应用于分子生物学、医学、微生物学等领域。
且在这些领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景。
传统的PCR技术在植物病原细菌学的检测应用已经非常广泛[2,3,4,5,6],但是由于植物病害的多样性以及植物病原细菌的复杂性,使传统的PCR技术较难满足需要,由此专家学者们研制出了许多以PCR技术为基础的相关技术,如Real-tim e fluorescent PCR,re p-PCR,Immuno-PCR,IT S-PCR等。
这些方法使植物病原细菌的检测更加方便、快捷、灵敏,本文简要介绍一些PCR相关技术的原理及其在植物病原细菌检测中的应用概况。
1Real-tim e fluorescent PCR其原理是在常规PCR的基础上,增加1条双荧光标记的核酸杂交探针,即T a q m an探针;随着实时PCR 反应体系的进行,每进行一次DNA扩增,就有一个探针被切断,同时荧光信号值被记录下来,且与扩增产物的量产生一对一的对应关系,产物的量越大,荧光信号就会越强,也即反应起始的模板数越高,就越容易达到一个荧光信号阈值,循环次数(Ct值)和反应体系的底物浓度就会形成一个严格的对应关系,根据标准曲线和Ct值,即可以准确地确定扩增基因的浓度[7]。
实时荧光PCR在全封闭状态下实现PCR扩增。
荧光探针杂交,信号检测不需电泳和E B染色,可以有效地降低污染和假阳性的产生,具有操作简单、省时省力、精确性高、特异性强、安全快速、准确灵敏等优点。
漆艳香等[8]将玉米细菌性枯萎病菌16S rDNA基因克隆测序,根据该细菌与其它待测细菌菌株16S rDNA序列差异,设计出对玉米细菌枯萎病菌具有稳定点突变的特异性探针。
进行实时荧光PCR检测,结果显示只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光,且灵敏度较高,反应体系中只要有2个活细菌,实时荧光PCR 就能检测到。
根据此技术原理与路线,漆艳香等又分别构建了苜蓿萎蔫病菌[9]、菜豆细菌性萎蔫病菌[10]和香蕉细菌性枯萎病菌[11]的实时荧光PCR检测体系。
朱建裕等[12]根据梨火疫细菌中独特含有质粒p EA29,设计了1对引物和3条探针,建立了梨火疫细菌实时荧光PCR的检测方法。
2REP-PCR原核与真核生物中普遍存在着散布的重复DNA 序列,这些序列由于发挥着生物体基本的功能作用,因此在进化中呈高度保守的状态。
REP(re p etitive ex2 tra g enic p alindrom ic)和ERIC(enterobacterial re p etitive in2 ter g enic consensus)属于这样的序列。
研究发现,REP、ERIC等序列在微生物中广泛存在,随机分布且在进化中呈高度保守状态。
因此,研究人员以REP、ERIC 等序列为引物,以基因组DNA为模板进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳得到不同带型,从而形成了被测菌基因组特异的指纹图谱,该技术称re p-PCR DNA指纹技术。
该技术方法简单、快速、敏感和分辨率高,现普遍应用于流行病学中的致病菌株鉴定和确定PCR相关技术在植物病原细菌检测和鉴定中的应用宋卡魏王星云张荣意(华南热带农业大学环植学院,海南儋州571737)摘要:PCR及其相关技术用于体外扩增DNA、RNA具有灵敏、快速、简便等优点,已经广泛应用于植物病原细菌的检测。
本文综述了real-tim e fluorescent PCR、REP-PCR、Immuno-RCR、RAPD-PCR、Nested-PCR等技术的原理及其在植物病原细菌检测和鉴定中的应用现状。
关键词:PCR植物病原细菌检测鉴定检测广西热带农业2006年第4期(总第105期) 46细菌间的亲缘关系。
S.V.T s yg ankova等[13]对Xanthomonas、p seudumonas、Erwinia等病原菌进行鉴定时,发现所有被测的X. cam p estris均能通过引物K RPN2扩增出一段约600b p 的片段,接着用引物SCAR进行扩增,在所有的X. cam p estris上出现一条特异性条带,而在其他的被测菌株上不能出现.他利用这特点,进行re p-PCR,结果能有效、迅速地对被测菌株进行鉴定。
J.Louws等[14]在对339个Xanthomonas进行鉴定时,也成功地应用了re p-PCR技术获得理想结果。
在日本,Ralstonia solanacearum小种4和小种1广泛存在于西红柿、马铃薯等植物上,除非进行致病性测试,否则很难将两者区分,Mitsuo H orita等[15]人利用小种4中存在特异性序列(AK IF-AK IR)和(21F-21R),并将其作为引物,利用re p-PCR技术,最后得到了特异带型。
该方法能够准确、快速、灵敏地进行致病菌株的鉴定。
3Immuno-PCR免疫PCR是在酶联免疫吸附实验基础上建立起来的一种新方法,由S ano等[16]在1992年首次报道,它同时具备抗原抗体反应的专一性和PCR的强特异扩增能力。
它是将一段已知序列的DNA片段标记到抗原抗体复合物上,用PCR扩增代替E LISA的酶催化底物显色,根据扩增产物存在与否判断抗原存在情况。
其一般程序是这样的,首先在酶联板上包被捕获抗原的抗体,然后加入待检抗原,再加入DNA分子标记的检测抗体,温育后充分洗涤,PCR扩增黏附于抗原/抗体复合物上的DNA分子,最后对PCR产物进行分析[17]。
在该项技术的基础上,张红[18]等采用了免疫磁珠吸附与PCR相结合的技术,对瓜类细菌性果腐病病原快速检测,经研究表明,其技术检测时间周期为4h,最低菌悬液检出量为1×10cfu/m l,而且不需进行细菌DNA提取。
该技术方法省时、快捷、准确,估计会在口岸检疫工作中起到重要的作用。
4RAPD-PCRRARD技术由William s和W elsh首先提出(William s等1990),是利用一个随机序列的寡核酸作引物,通常为10个核甘酸,以生物基因组的DNA作模板进行PCR扩增反应,扩增产物经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离,所得多态性可反映基因组DNA相应区域的多态性,因而可用于对不同类群细菌和不同致病变种亲缘关系的鉴定、系统进化发育的研究等等。
姬广海等[19]用40个引物对中国水稻条斑病菌、稻短条斑病菌和李氏禾条斑病菌等14个代表菌株进行了RAPD分析。
H oc q uellet A等[20]应用RAPD方法检测了柑桔黄龙病亚洲种与非洲种基因的多态性并获得4个鉴别基因。
X iaotin g Q in等[21]在研究柑橘和咖啡上的致病菌X y lella f astidiosa时,发现传统的PCR法较难鉴别,他们应用了RAPD-PCR法,扩增产物存在C foⅠ多态性,利用这特点较好的鉴别了该致病菌。
K hoodoo等[22]也充分使用了该方法,对天南星科等植物的细菌性枯萎病病原物不同致病变种Xanthomonas axono p odis p v.die ff enbachiae进行遗传多态性分析,从而进行鉴定。
5Nested-PCR巢式PCR(nested PCR)是一种PCR改良模式,它由两轮PCR扩增和利用两套引物对所组成,首先对靶DNA进行第一步扩增,然后从第一次反应产物中取出少量作为反应模板进行第二次扩增,第二次PCR引物与第一次反应产物的序列互补,第二次PCR扩增的产物即为目的产物。
王茂华等[23]根据玉米细菌性枯萎病病菌IT S区域序列,选择特异性序列,设计了一对引物,该引物能从参试菌株中扩增出特异性条带,然后与扩增IT S区域的通用引物结合,建立了检测和鉴定该病菌的nested-PCR技术,该技术检测灵敏度达到了4个细菌细胞。
吴琼等[24]在研究该病菌时,通过对该病原菌及其近似种的16S rDNA的序列测定和分析,设计了该病原菌的特异性引物,最后采用nested-PCR技术,准确区分了该病菌及其近似种,且检测灵敏度在DNA水平上达到10-3n g,检测纯培养细菌达到2CFU/m l的水平。
6展望PCR及其相关技术的进步极大的促进了植物细菌病害研究的发展,为植物细菌病害的研究注入了新鲜的血液,植物细菌病害的检测由最初的症状观察、形态观察、生理生化分析、到血清学、免疫学的发展,再到今天的PCR检测,经历了由宏观到分子水平的过渡,检测技术的准确性、灵敏性、快捷性都在不断地提高。
但是,PCR技术发展的同时,其在植物病原细菌检测方面也存在着一些不足,如PCR反应绝大部分只能利用病原物的核酸或纯培养物作为PCR模板,若以受侵染植物组织的核酸粗提液或材料浸泡液作为模板, PCR反应将会受到严重抑制;另外,一些尖端的PCR 技术方法还需要特配的仪器,这只能满足一些条件较好的单位,若想在全国的检疫系统、大学、研究院配备,还是有一定的难度,这就大大阻碍了应用PCR技2006年第4期(总第105期)广西热带农业47术检测细菌性病害的发展。
总的来说,PCR技术将向短时间、高精度、自动化、微量化、尽量减少人为因素的方向发展,这就需要根据实际情况实际操作,因为不同的研究目的需要适合的方法,然而任何一种方法都有其使用范围,对于不同目的的检测,所要得到的灵敏度、可靠性和高效性的最优组合,以及如何制定标准化方案,这都是我们面临的重要问题。
不过,随着PCR及其相关技术进一步的完善,我们有理由相信,它会为植物病原细菌的研究创造更辉煌的未来。
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