不同浓度重组登革病毒1型病毒样颗粒免疫效果的评价
登革病毒初次感染患者循环登革病毒NS1抗原和抗体的动力学分析以及非标记技术对NS1单克隆抗体亲和力的测定
登革病毒初次感染患者循环登革病毒NS1抗原和抗体的动力学分析以及非标记技术对NS1单克隆抗体亲和力的测定登革热是一种由登革病毒(DengueVirus，DENV)引起的虫媒传染病，通过蚊子（以埃及伊蚊和白纹伊蚊为主）的叮咬在人群中传播。
人类感染DENV后将产生从轻到重的很大范围的临床症候群。
尽管绝大多登革热患者显示为一种类似流感样的自限性疾病，如登革热(DengueFever，DF)，然而患者的病情有可能发展到重症登革热，如登革出血热(DengueHemorrhageFever,DHF)或登革休克综合征(DengueShockSyndrome，DSS)。
在未能得到及时、有效治疗的情况下，重症登革热将对患者的生命造成巨大的威胁。
目前，登革热被认为是世界上最为关注的公共卫生问题，其原因主要在于该病的发病率高，流行范围广，并且缺乏行之有效的防治方法。
近50年来，尽管全世界在登革热的防治方面做了很多的努力，但是登革热的发病率还是呈现出急剧上升的趋势，给流行国家的卫生防控体系以及患者的家庭带来了沉重的经济负担。
DENV属于黄病毒科，黄病毒属，是一种有包膜的单股正链的RNA病毒，基因组大约11kb 长，包含一个开放性的阅读框，编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。
三种结构蛋白分别是衣壳蛋白(capsidprotein，C)，膜蛋白(membraneprotein，M)和包膜蛋白(envelopeprotein，E)。
7种非结构蛋白依次为NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5。
根据不同的E蛋白基因序列，DENV可被划分为四种血清型，DENV-1～4。
各种DENV的血清型之间存在60-70％的同源序列。
DENV的初次感染可以产生针对感染血清型的终生免疫保护反应，但对其它三型DENV仅有短暂而微弱的交叉免疫保护作用。
当二次感染的血清型不同于初次感染的血清型时，患者体内存在的非中和交叉反应性抗体或亚中和浓度的中和抗体可促进DENV进入Fc受体容受细胞，增加病毒的复制，容易导致严重的DHF/DSS的发生。
呼吸道合胞病毒新型表位的鉴定及免疫效果评估
呼吸道合胞病毒新型表位的鉴定及免疫效果评估第一部分呼吸道合胞病毒预防性肽疫苗的设计目的: 尝试运用理论设计和分子模拟技术确定和优化呼吸道合胞病毒的肽疫苗。
方法: 首先检索蛋白质晶体结构数据库中呼吸道合胞病毒相关蛋白晶体结构数据和呼吸道合胞病毒中和抗体- 识别肽段的复合物晶体结构数据。
后采用分子模拟, 分析了中和抗体与表位肽间作用方式;通过分子动力学模拟技术评估FFL-001 抗原蛋白的各个部分对其稳定结构的作用及与中和抗体结合的影响;通过理性设计优化得到抗原肽, 并评估其与中和抗体的作用,最终通过实验来验证其效果。
结果:1.成功从蛋白质晶体结构数据库中获取RSV F蛋白变构前后高级结构晶体数据,抗体Motavizumab 与其表位肽的共晶结构数据。
2. 对F 蛋白变构前后的高级结构分析可知,F 蛋白的结构中存在高级结构相对稳定的肽段，该肽段受F蛋白变构影响较小。
该肽段亦是已开发的RSV中和抗体的靶标。
3. 结构和能量分析Motavizumab-FFL<sub>0</sub>01 作用表明,FFL-001 与抗体Motavizumab的结合区仅局限于H2和H3螺旋连接转角区（氨基酸65-89）, 在此相互作用界面上, 存在9 个氢键和一条盐桥作用。
4. 分子动力学结果表明, 完整FFL-001能在整个动力学模拟时段内能维持稳定的空间结构，而缺少H1螺旋束的FFL<sub>0</sub>01的结构出现明显变构;H2和H3螺旋连接转角区（即Motavizumab结合位点肽段（氨基酸65-89））肽段结构只有其N端的一小段螺旋结构维持着，而其C-端和中间的氨基酸序列呈完全的无序状态。
5. 能量评估显示,全长的FFL-001产生的结合能△ Gtotal为-23.6kcal/mol;其中可分解为FFL-001与Motavizumab有益作用能△ Gint=-110.8kcal/mol, 和不益的去溶剂化作用△ Gslv=71.5kcal/mol以及一部分较弱的熵惩罚作用-T △S=15.7kcal/mol;双螺旋束H2-H3和Motavizumab结合位点肽段与完整的FFL-OO1相比呈现出完全不同能量变化；在与Motavizumab结合时,这两个肽段出现了较大的熵惩罚（-T △ S分别为47.2和27kcal/mol ）和不利的去溶剂化作用（△ Gslv 分别为52.6 和58.8kcal/mol ）。
Ⅰ型登革病毒prM抗体的制备及初步鉴定
ＷＡ Ｎ Ｇ Ｐ ｅ ｉ ， Ｚ Ｈ Ａ Ｎ Ｇ Ｂ ａ ｏ ， Ｘ Ｉ Ｅ Ｑ ｉ ａ ｎ ， Ｙ Ｕ Ｊ ｉ ａ ｎ— ｈ ａ ｉ ， Ｈ Ｅ Ｘ ｉ ａ ｏ— ｅ ｎ ， Ｚ Ｈ Ａ Ｏ Ｗｅ ｉ
Ｂ Ｓ Ｌ一 ３ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｏ ｆＳ ｃ ｈ ｏ ｏ ｌ ｆＰ ｏ ｕ ｂ ｌ ｉ ｃ Ｈ ｅ ａ ｌ ｔ ｈ ａ ｎ ｄ Ｔ ｒ ｏ ｐ ｉ ｃ ａ ｌ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ ， Ｓ ｏ ｕ ｔ ｈ ｅ ｒ ｎ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，
ｔ ｙ ｐ ｅ １ （ Ｄ Ｅ Ｎ Ｖ １ ）ｐ ｒ Ｍ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ．Ｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｔ ｈ ｅ ｗ ｈ ｏ ｌ ｅ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ｏ ｆ Ｄ Ｅ Ｎ Ｖ １ ｐ ｒ Ｍ ｗ ｅ ｒ ｅ ａ ｍ ｐ ｌ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ ｗ ｉ ｔ ｈ Ｒ Ｔ—Ｐ Ｃ Ｒ ａ ｎ ｄ ｉ ｎ ｓ ｅ ｒ ｔ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ
Ｒ Ｔ—
Ｐ Ｃ Ｒ扩增 Ｉ 型登革病毒 全长 ｐ ｒ Ｍ 基 因， 转入克 隆载体 和构建重组 表达载体 ， 以原核表 达及纯化后 的 ｐ ｒ Ｍ 蛋 白作为免疫 原分别免疫新 西兰大 白兔和 Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃ小 鼠， 采 集免疫兔血清 ， 制备抗 ｐ ｒ Ｍ 蛋 白多克隆抗体 ； Ｉ Ｒ小 鼠脾 细胞与骨 髓瘤细胞 融合 ， 经Ｈ Ａ Ｔ选 择培养 、 间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ筛选 阳性克隆 ， 获得特异性单克隆抗体 的杂 交瘤 细胞株 ， 制备抗 ｐ ｒ Ｍ蛋 白单克 隆抗 体， 应用亲和层析法纯化抗 体 ， Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ —ｂ ｌ ｏ ｔ 鉴定抗体特异性 ， 间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ检测抗体效价 。结果 获得全长 ｐ ｒ Ｍ 的多 克
重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞和酵母)及其序贯免疫的效果评价
重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞和酵母）及其序贯免疫的效果评价目的评价不同类型基因重组乙型肝炎疫苗（Hepatitis B Vaccine，HepB）及其序贯免疫的免疫效果。
方法将观察对象分为3组，按照0、1和6个月免疫程序分别接种重组HepB（CHO细胞），重组HepB（酵母）及两种疫苗序贯免疫，全程免疫1年后，检测血清抗-HBs阳转率和抗-HBs几何平均浓度（Geometrical mean concentration，GMC）。
结果3个免疫组抗体阳性率和GMC差别均没有显著性。
结论重组HepB（CHO细胞）及HepB（酵母）序贯免疫免疫原性良好。
标签：重组乙肝疫苗疫苗；免疫效果接种乙型肝炎疫苗（Hepatitis B Vaccine，HepB）是预防和控制乙型肝炎最有效的手段，我国目前使用较为广泛的是重组HepB（CHO细胞）[以下简称HepB （CHO）]和重组HepB（酵母）[以下简称HepB（酵母）]。
且由于省级采购的疫苗种类时有变化，为比较接种HepB（CHO）、HepB（酵母）和两种HepB疫苗序贯免疫的免疫效果，在保定市进行了有效性观察，现报告如下。
1材料与方法1.1疫苗华北制药生产的HepB（CHO）疫苗，规格10μg/剂，北京天坛生产的HepB（酵母）疫苗，规格5μg/剂。
1.2观察对象及分组选择保定市8个县（市、区）为观察地区，107名新生儿，按照随机性原则编入3个不同的观察组，注射不同种类的HepB疫苗：第1组接种HepB（CHO）；第2组接种HepB（酵母）；第3组第1或第1、2针接种HepB（酵母），第2、3或第3针接种HepB（CHO）。
比较各组抗体阳转率和几何平均浓度（Geometrical mean concentration，GMC）。
1.3免疫程序及接种方法以上观察对象均按照0、1、6个月程序接种，接种部位为上臂三角肌肌内。
1.4血清学检测对每一观察对象收集免疫后1年的血清，用雅培Abbott AXSYM全自动免疫发光仪对乙肝病毒表面抗体（抗-HBS）（试剂批号：10367LF01）和乙肝病毒核心抗体（抗-HBc）（试剂批号：05238LFOO）进行检测。
登革热诊疗指南
实验室检查
3.血生化检查：
超过半数的患者转氨酶、乳酸脱氢酶升高，部分患者心 肌酶、尿素氮和肌酐升高等。
丙氨酸氨基转氨酶 (ALT) 和天门冬氨酸氨基转氨酶 (AST) 呈轻中度升高，少数患者总胆红素升高，血清白蛋白降低
部分患者可出现低钾血症等电解质紊乱
出凝血功能检查可见纤维蛋白原减少，凝血酶原时间和 部份凝血活酶时间延长，重症病例的凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、 Ⅸ和Ⅹ减少。
体液中的抗体可促进病毒在上述细胞内复制，并可与病毒形 成免疫复合物，激活补体系统，导致血管通透性增加
同时抑制骨髓中的白细胞和血小板系统，导致其减少，出血 倾向。
五、登革热临床表现
登革热的潜伏期一般为3～15天，多数5～8天。 登革病毒感染可表现为无症状隐性感染、非重症感染及重 症感染等。
登革热是一种全身性疾病，临床表现复杂多样。
登革热诊疗指南 （2014年版）
周维俊
一、关于登革热定义问题
1
登革热是由登革病毒引起的急性传染病
主要通过埃及伊蚊或白蚊伊蚊叮咬传播
2
其临床特征为突起发热，头痛，全身肌肉、 骨骼和关节痛 ，极度疲乏，皮疹，淋巴结肿 大及白细胞减少，部分病人有出血倾向。
3
主要发生在夏秋季节，居家待业和离退休人员较多
二、登革病毒的特性
出血的 治疗
严重出血者，根 据病情及时输注 红细胞；
严重出血伴血小 板显著减少应输 注血小板
其他治疗
在循环支持治疗及出血治疗的同时，应 当重视其他器官功能状态的监测及治疗； 预防并及时治疗各种并发症。
十、中医辨证治疗
（一）辨证选择口服中药汤剂
1.卫气同病证
临床表现：发热恶寒，头痛，身骨疼痛，颜面潮红，四肢倦 怠，口微渴。舌边尖红，苔白或黄而浊，脉浮数或濡数。
成人接种重组乙型肝炎疫苗后免疫效果的评价
成人接种重组乙型肝炎疫苗后免疫效果的评价发表时间：2017-04-24T17:04:06.417Z 来源：《中国蒙医药》2017年4月第4期作者：龙丽莲[导读] 成人注射国产重组乙型肝炎疫苗免疫原性以及安全性较高，其中20ug接种剂量免疫效果更佳，应予以推广使用。
湘乡市疾病预防控制中心湖南湘乡 411400【摘要】目的：观察并研究成人接种不同剂量重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）后的免疫效果。
方法：将276例健康接种人员分为低剂量组（140例）与高剂量组（136例），两组均给予国产重组乙型肝炎疫苗，其中低剂量组注射剂量为10ug，高剂量组注射剂量为20ug，对比两组表面抗体阳转率和几何平均滴度。
结果：免疫接种后6月，高剂量组表面抗体阳转率和几何平均滴度明显高于低剂量组，二者差异具有统计显著性（P＜0.05）；低剂量组20~29岁、30~39岁、40~49岁中HBs-Ab阳转率分别为82.9%、80.0%、75.0%，高剂量组20~29岁、30~39岁、40~49岁中HBs-Ab阳转率分别为91.2%、93.9%、89.5%，两组内不同年龄分布的表面抗体阳转率差异无统计显著性（P＞0.05）。
结论：成人注射国产重组乙型肝炎疫苗免疫原性以及安全性较高，其中20ug接种剂量免疫效果更佳，应予以推广使用。
【关键词】乙肝疫苗接种；国产重组乙肝疫苗；表面抗体阳转率；几何平均滴度乙型肝炎是一种高发性传染病，接种乙肝疫苗是乙型肝炎的一种有效防控措施。
测定表面抗体则是乙型肝炎预防成效的首要评估指标[1]。
本研究主要观察分析成人接种不同剂量重组乙型肝炎疫苗后的免疫效果，现将结果报告如下：1资料与方法1.1 一般资料随机纳入2015年4月~2016年4月我市某企业的276例新员工为研究对象，入组对象既往无乙肝疫苗接种史和本次研究用药禁忌症。
按照接种剂量不同将其分为两组，低剂量组140例，其中男80例，女性患者60例；年龄最小20岁，最大49岁，平均年龄（31.4±6.7）岁；高剂量组136例，其中男79例，女性患者57例；年龄最小20岁，最大49岁，平均年龄（30.3±5.9）岁。
牙鲆淋巴囊肿病核酸疫苗的免疫效果评价
（ 浓度为１２ 升） ． 克／ 的海水中，待牙鲆体色稍微变黑并反
应迟钝时取 出并迅速进行疫苗肌肉注射 。试验共分１个 １
处理组：①未注射组，②肌 肉注射磷酸盐缓冲液 （Ｂ ） Ｐ Ｓ 组 （Ｏ Ｍ Ｈ ７ ４ １ｍ ，ｐ ． ，过滤 灭菌） ，③肌 肉注射空载体组 （ 每条鱼５ 微克） ，④肌 肉注射重组质粒组 （ 每条鱼０ １ ． 微
＿ 圈
堕 鱼ｌ 旦 塑旦 夔
牙 淋 囊 病 酸 苗 鲆 巴肿 核 疫 的瘥
核酸疫苗是将编码某种抗原蛋 白的外源 基因 （Ｎ ＤＡ 或ＲＡ 直接导入动物体内，并通过宿主细胞的表达系统 Ｎ） 条鱼５ 克） 微 ，⑨ 皮下注射 重组质 粒组 （ 每条鱼０ １ 。 微
合成抗原蛋 白，诱导宿主产生对该抗 原蛋 白的免疫应
答 ，以达到预防和治疗疾病的目的。动物实验证 明，在 合适的条件下，Ｄ Ａ Ｎ 接种后既能产生细胞免疫又能引起 体液免疫，核酸疫苗可诱导机体产生全面的免疫应答 ， 并具有安全 、可靠、生产方便及免疫持续 时问长等优 点，核酸疫苗的出现是疫苗发展史上的第三次革命。随 着集约化养殖程度 的提高 ，鱼类病毒性疾病频繁发生 ， 牙鲆淋巴囊肿病 （ｙ ｐ ｏ ｙ ｔ ｄ ｓ ａ ｅ Ｃ ） 由 Ｌ ｍ ｆ ｃ ｓ ｉ ｉ ｅ ｓ ，Ｌ Ｄ 是 Ｓ 淋 巴囊肿病毒 （ｙｐ ｏ ｙ ｔ Ｓ ｄ ｓ ａ ｅ ｖ ｒ ｓ Ｃ Ｖ Ｌｍ ｈ ｃ ｓ ｉ ｉ ｅ ｓ ｉ ｕ ，Ｌ Ｄ ） 感染引起 的一种病毒性疾病 ，淋 巴囊肿病毒能够感染百 余种海水鱼及淡水鱼，给养殖者造成很大 的经济损失。 该文将本实验室构建的牙鲆淋巴囊肿病毒主要核衣壳蛋
发展计划 （６ 计划） 目资助本实验室完成 。 ８３ 项 ２ 实验动物及处理 选取健康的养殖 牙鲆 （ ． 体长 １ ￣２厘米 ，体重６ ￣８ 克） ５ ０ ０ ０ ，运 回实验室后 ，保持水 温在２ ￣２ ℃，充气喂养３ 天以适应新环境。为了避 ０ ２ ～４ 免鱼体受伤，疫 苗注射前将 牙鲆放入含麻醉剂Ｍ 一 ２ Ｓ２ ２
人巨细胞病毒结构蛋白p150_p38的原核表达纯化及免疫性鉴定
收稿日期:2006204211;修回日期:2006205204作者简介:范行良(19702),男,硕士,助理研究员,主要从事分子生物学和诊断试剂的研究。
E 2mail:fxl@ .cn人巨细胞病毒结构蛋白p150、p38的原核表达纯化及免疫性鉴定范行良,邢宇坤,李长贵,王剑锋(中国药品生物制品检定所,北京100050)摘 要:应用聚合酶链式反应(PCR )扩增HC MV 结构蛋白p150aa595～aa614/aa1006～aa1048和p38aa117～aa373基因片段,将其分别克隆于表达载体pGEX 24T 21和pET30a 2Set B 中,转化大肠杆菌BL21(DE3),I PTG 诱导表达,重组质粒经酶切鉴定及DNA 测序证实pGEX 24T 21/p150aa595～aa614/aa1006～aa1048和pET30a 2Set B /p38aa117～aa373构建正确;通过优化表达和纯化,分别获得分子量约为35k D 和43k D 纯化的表达产物。
经亲和层析纯化以免疫印迹实验对纯化的重组蛋白进行免疫反应性检测,证实重组蛋白p150aa595～aa614/aa1006～aa1048、p38aa117～aa373能够与抗HC MV I g M 阳性血清反应,说明表达的重组蛋白p150aa595～aa614/aa1006～aa1048、p38aa117～aa373具有良好的免疫性,对HC MV 的原发感染具有潜在的应用价值。
关键词:巨细胞病毒;结构蛋白;免疫性中图分类号:R373.1+1文献标识码:A文章编号:100525673(2006)0320009204Expressi on,pur i f i ca ti on and i den ti f i ca ti on of reco m b i n an t v i ra l structura l prote i n s p150and p38of hum an cyto 2m ega lovirus FAN X ing 2liang,X I N G Yu 2kun,L I Chang 2gui,et al .(N ational Institute for the Control of Phar m aceutocal and B iological Products,B eijing 100050,China )Abstract:Both gene frag ments of P150(a m ino acids aa 595t o 614and 1006t o 1048which were fused t ogether )and p38(aa 117t o 373)were a mp lified by PCR fr om te mp late DNA of hum an cy to m ega lovirus .The t w o targetDNA frag ments were cl oned int o exp ressi on vect or pGEX 24T 21and pET30a 2Set B separately .After transf or med int o competent E .coli BL21(DE3)cell and induced by I PTG,the recombinant fusi on p r oteins p150aa595～aa614/aa1006～aa1048and p38aa117～aa373were exp ressed and then purified by an affinity chr omat ography .Restricti on enzy mes cleavage and DNA sequencing confir med that the p las 2m id p150aa595～aa614/aa1006～aa1048and pET30a 2Set B /p38aa117～aa373were correctly constructed .T wo purified recombinantp r oteins with molucular weight about 35k D and 43k D were obtained by op ti m izing the conditi ons f or both exp ressi on and purifica 2ti on .W estern bl ot showed that these t w o recombinant p r oteins could be recognized by positive I g M seru m of hu man cyt o 2megal ovirus .These t w o recombinant p r oteins showed good i m munity and had a potential value f or diagnosis of p ri m ary HC 2MV infecti on .Key words:Hum an Cy to m ega lovirus ;viral structural p r otein;I m munity 人类巨细胞病毒(Hum an cy to m ega lovirus,HC 2MV )属疱疹病毒科β属的双螺旋DNA 病毒,是人类疱疹病毒中最大的一组病毒。
Scirpusin A和scirpusin B体外抗人类免疫缺陷病毒1型的作用
生
壁
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｅ ｓ ａ ｎ ｄＩ ｎ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ， Ｓ ｅ ｐ ｔ ｅ ｍｂ ｅ ｒ ２ ５ ， ２ ０ １ ４ ， ９ （ ３ ） ： １ ５ ７ — １ ６ ２ ｈ ｔ ｔ ｐ ： ／ ／ ｊ ｍｉ ． ｆ ｕ ｄ ａ ｎ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ａ
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｓ ｃ ｉ ｒ ｐ ｕ ｓ ｉ ｎ Ａ ａ ｎ ｄ ｓ ｃ ｉ ｒ ｐ ｕ ｓ ｉ ｎ Ｂ，ｓ ｔ ｉ ｌ ｂ ｅ ｎ ｅ ｄ ｉ ｍｅ ｒ ｓ ｐ ｕ ｒ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ａ ｌ ｐ ｌ ａ ｎ ｔ ｓ ，ｓ ｈ ｏ ｗｅ ｄ ｐ ｏ ｔ ｅ ｎ ｔ ａ ｎ ｔ ｉ －
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Ａ ａ ｎ ｄ ｓ ｃ ｉ ｒ ｐ ｕ ｓ ｉ ｎ Ｂ ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ
ＶＳ Ｖ－ Ｇ包膜假病毒 ， 提示其作用 可能与病毒在细胞 内的复制过程 相关 。Ｓ ｃ ｉ ｒ ｐ ｕ ｓ ｉ ｎ Ａ 在病毒进 入细胞后 仍可 发 挥抑制作用 ， 但具体 机制 尚待深入研究 。
关 键词 ： 人 类 免 疫 缺 陷 病 毒 １型 ； Ｓ ｃ ｉ ｒ ｐ ｕ ｓ ｉ ｎＡ； Ｓ ｃ ｉ ｒ ｐ ｕ ｓ ｉ ｎ Ｂ； 芪类化合物 ； 中药 ； 水 疱 性 口炎 病 毒 Ｇ 蛋 白
狂犬病病毒强、弱毒株糖蛋白调节I_型干扰素作用的差异分析
华南农业大学学报 Journal of South China Agricultural University 2024, 45(2): 190-198DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202211015肖宇, 吴凡, 张宝石, 等. 狂犬病病毒强、弱毒株糖蛋白调节I型干扰素作用的差异分析[J]. 华南农业大学学报, 2024, 45(2): 190-198.XIAO Yu, WU Fan, ZHANG Baoshi, et al. The different regulatory effect of glycoproteins from virulent and attenuated strain of rabies virus on type I interferon signaling pathway[J]. Journal of South China Agricultural University, 2024, 45(2): 190-198.狂犬病病毒强、弱毒株糖蛋白调节I型干扰素作用的差异分析肖 宇，吴 凡，张宝石，徐孟磊，龙家慧，罗 均，郭霄峰，罗永文(华南农业大学 兽医学院/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室, 广东 广州 510642)摘要: 【目的】狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)引起的一种高致死性人兽共患传染病。
I型干扰素(IFN-I)通路在抵抗RABV感染中发挥重要作用。
RABV可通过磷蛋白及核蛋白的功能逃逸IFN-I的抗病毒作用，本研究旨在探讨对RABV的致病性有重要影响的糖蛋白(Glycoprotein，G)在调节IFN-I通路方面扮演怎样的角色。
【方法】将RABV弱毒株Hep-Flury的G基因替换成致病株CVS-11的G基因，拯救得到重组病毒HepG，分析Hep-Flury、CVS-11和HepG这3种毒株在体内和体外感染对IFN-I通路激活和调控的差别，比较它们在神经细胞中对抗IFN-I抗病毒作用的差异性。
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基金项目：广州市高校科技基金（10A173）作者简介：汤云霞（1977－），女，博士，讲师，主要从事病毒感染与免疫的研究通讯作者：袁竹青，女，博士，副教授，E-mail ：yuanbamboo＠hotmail．com登革热是由白蚊伊蚊和埃及伊蚊传播的急性病毒性疾病，为热带和亚热带地区严重的公共卫生问题之一［1］。
近年来在澳洲、南美洲和东南亚地区时有流行，我国的海南、广东沿海和台湾也是高危不同浓度重组登革病毒1型病毒样颗粒免疫效果的评价汤云霞1，麦瓂莹2，苏丹虹1，卓超1，袁竹青2（1．广州医科大学附属第一医院，广东广州510120；2．广州医科大学病原生物学教研室，广东广州510230）摘要：目的评价毕赤酵母表达的登革病毒1型（DENV-1）病毒样颗粒（VLPs ）不同浓度条件下的免疫效果，为登革多价疫苗的研究奠定基础。
方法采用毕赤酵母系统构建两种DENV-1VLPs （即DENV-1prME-VLPs 和DENV-1CprME-VLPs ），鉴定、纯化后比较其表达量，选择表达量高的VLPs 以不同剂量免疫BALB ／c 小鼠（试验组分别注射经弗氏佐剂乳化的VLPs 10、25、50μg ；对照组分别注射PBS 和弗氏佐剂）。
通过间接ELISA 及中和试验测定免疫小鼠血清特异性抗体效价和中和抗体效价；用VLPs 体外刺激免疫小鼠的脾淋巴细胞，MTT 法测定其增殖指数；ELISPOT 检测IL-4、IFN-γ及TNF-α的抗原特异性淋巴细胞数量。
结果以电镜下观察到成功表达的直径约为30nm 、形态无明显差异的两种VLPs 。
两种表达体系中，以DENV-1prME-VLPs 表达量较高。
经较高表达量的VLPs 免疫小鼠后发现，初次免疫后1周，即可检测到针对DENV-1的抗体，随着时间延长，抗体效价逐渐上升，5周达峰值；其中，VLPs 25μg 剂量组与50μg 剂量组特异性抗体效价及中和抗体效价均显著高于PBS 组、佐剂对照组及VLPs 10μg 剂量组，差异有统计学意义（P＜0．05）。
VLPs 25μg 剂量组与50μg 剂量组免疫后的小鼠淋巴细胞增殖指数及其分泌IL-4、IFN-γ及TNF-α抗原特异性淋巴细胞数目，均显著高于对照组及VLPs 10μg 剂量组，差异有统计学意义（P＜0．05）。
结论毕赤酵母表达的DENV-1VLPs 免疫剂量为25μg 时即可诱导高效价的中和抗体和显著的细胞免疫效应。
关键词：登革病毒1型病毒样颗粒；中和抗体；抗原特异性淋巴细胞中图分类号：R373．33文献标识码：A文章编号：1672-3619（2014）07-0842-04Assessment of effects of immunity of different doses of DENV-1VLPsTANG Yun-xia 1，MAI Jing-ying 2，SU Dan-hong 1，ZHUO Chao 1，YUAN Zhu-qing 2（1．The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University ，Guangdong ，Guangzhou 510120；2．Department ofParasotology ，Guangzhou Medical University ，Guangdong ，Guangzhou 510230，China ）Abstract ：ObjectiveTo assess the effects of immunity of recombinant dengue virus type-1（DENV-1）virus-like particles（VLPs ）and lay a foundation for developing ployvalent VLPs vaccines．MethodsDENV-1CprME-VLPs （CprME-VLPs ）and DENV-1prME-VLPs （prME-VLPs ）were prepared from Pichia pastoris （P．pastoris ）expression system ，and were purified by sucrose density gradient centrifugation．High-yielded VLPs were selected and used in conjunction with Freund adjuvant （FA ）formulations at 10，25，or 50μg dose －1to vaccine mice．Control animals received phosphate buffered saline（PBS ）or FA alone．The mice were tested for both humoral and cellular immune responses by ELISA and virusneutralization test ，and by lymphocyte proliferation and detection of the number of IL-4，IFN-γand TNF-αproducing cells（IL-4，IFN-γand TNF-α）．ResultsOur data demonstrated that CprME-VLPs and prME-VLPs were both sphericalparticles with a diameter of approximately 30nm and prME-VLPs were produced in higher yield．Mice immunized withVLPs began to produce antibodies on the day 7post-prime．The neutralization titers reach 1∶40．And the antibody titer and neutralization titers of 25μg dose －1group and 50μg dose －1group were higher than that of the control groups （P ＜0．05），while no difference between the two groups．The proliferation level and detection of the number of IL-4，IFN-γand TNF-αproducing cells from 25μg dose －1group and 50μg dose －1group were higher than that of the control groups （P ＜0．05），whileno difference between the two groups．ConclusionThree immunizations with the recombinant DENV-1VLPs at 25μgdose －1could efficiently induce neutralizing antibodies and cellular immune responses in mice．Key words ：dengue virus type-1virus-like particles ；neutralizing antibodies ；antigen-specific lymphocytes·实验研究论著·地区，每年均有散发流行［2］。
该病的病原体是登革病毒（dengue virus，DENV），属黄病毒科，包括四个血清型（DENV-1～4）。
由于登革病毒致病机制尚未明了，缺乏合适的动物模型及四型病毒免疫血清间无交叉保护作用，迄今尚未有登革疫苗面市［3］。
登革病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）是仅表达病毒结构蛋白并可组装成为病毒样的颗粒，其中不包含病毒的核酸成分，因而是较好的研究机体与登革病毒相互作用的模型。
研究证明，包含黄病毒主要结构基因的重组病毒样颗粒在动物模型中可诱导免疫应答［4］。
我们已构建了登革病毒2型病毒样颗粒（DENV-2VLPs），在动物模型中诱导了体液免疫反应。
但由于四种血清型间登革病毒免疫血清无交叉保护作用，并在再次感染异型病毒时，会由于抗体依赖增强作用（antibody-dependent enhancement，ADE）产生而使患者出现威胁生命的登革出血热／登革休克综合征（DHF／DSS），因此，只有包含所有四种血清型的疫苗（四价疫苗）才真正安全有效［3］。
本研究采用毕赤酵母表达载体构建prME-VLPs及CprME VLPs两种DENV-1VLPs，纯化后测定浓度，选择产量较高的prME VLPs免疫小鼠，并观察不同浓度VLPs的免疫效果，从而确定最佳免疫剂量。
1材料与方法1．1材料pGAPZαA及X-33购自Invitrogen公司；重组质粒pGAPZA-CprME及pGAPZA-prME为本室构建，其中pGAPZA-CprME在表达载体pGAPZαA的序列上，下游插入DENV-1全长的CprME基因（不包括载体的信号肽），pGAPZA-prME在表达载体pGAPZαA的序列上，下游插入DENV-1全长的prME基因（不包括载体的信号肽）。
DENV-1GZ01／95株（GeneBank accession No．EF032590）为本室从登革热患者血清中分离，具有乳鼠神经毒力。
DENV-1E单抗由美国疾病控制中心惠赠；FITC-羊抗鼠IgG购自武汉博士德公司；小鼠IL-4、IFN-γ及TNF-αELISPOT检测试剂盒购自达科为公司；BALB／c小鼠，8周龄，雄性，购自中山大学北校区实验动物中心。
1．2方法1．2．1VLPs的表达将来自DENV-1GZ01／95株的结构基因，分别构建重组质粒pGAPZA-CprME及pGAPZA-prME，其中，CprME、prME均重组到酵母质粒启动子（P GAP）下游的多克隆位点，受启动子控制。
重组质粒的构建、电转化、筛选，以及重组酵母的培养、筛选、表达的具体方法参见文献［5］。
1．2．2VLPs鉴定及纯化参见文献［5］。
1．2．3免疫方案将BALB／c小鼠随机分成5组，每组8只。
试验组分别注射经弗氏佐剂乳化的VLPs10、25、50μg。