人脂肪间充质干细胞向表皮细胞表型转化的研究
《脂肪间充质干细胞促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化》
《脂肪间充质干细胞促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化》篇一一、引言近年来，脂肪间充质干细胞（ADSCs）在再生医学和免疫调节领域的研究日益受到关注。
巨噬细胞作为机体免疫系统的重要组成部分，其极化状态对炎症反应和伤口愈合等生理过程具有重要影响。
M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞是巨噬细胞的两种极化状态，分别在炎症反应和抗炎、修复过程中发挥重要作用。
因此，探索如何调控巨噬细胞的极化状态对于治疗多种疾病具有重要意义。
本文旨在研究脂肪间充质干细胞如何促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化，为相关疾病的治疗提供新的思路。
二、材料与方法1. 材料实验所需材料包括脂肪间充质干细胞、M1型巨噬细胞、相关培养基及试剂等。
2. 方法（1）培养ADSCs和M1型巨噬细胞；（2）将ADSCs与M1型巨噬细胞共培养，观察其相互作用；（3）通过荧光定量PCR、免疫组化等方法检测M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化的相关基因和蛋白表达；（4）设立对照组，分析ADSCs对M1型巨噬细胞极化的影响。
三、实验结果1. ADSCs与M1型巨噬细胞的相互作用实验结果显示，ADSCs与M1型巨噬细胞共培养后，M1型巨噬细胞的形态发生改变，逐渐向圆形转变，且细胞活性有所提高。
2. M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化通过荧光定量PCR和免疫组化等方法检测，发现共培养后M1型巨噬细胞相关基因和蛋白表达降低，而M2型巨噬细胞相关基因和蛋白表达升高。
这表明ADSCs促进了M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化。
3. 对照组分析与对照组相比，ADSCs对M1型巨噬细胞的极化具有显著的调控作用，能够有效地促进其向M2型巨噬细胞转化。
四、讨论本实验结果表明，脂肪间充质干细胞能够促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化。
这一现象可能与ADSCs分泌的多种生物活性分子有关，如细胞因子、生长因子等。
这些分子可能通过与M1型巨噬细胞表面的受体结合，从而调控其极化状态。
《脂肪间充质干细胞促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化》
《脂肪间充质干细胞促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化》篇一一、引言在生物学和医学领域，巨噬细胞作为重要的免疫细胞，其在机体内的免疫调节和炎症反应中起着至关重要的作用。
巨噬细胞分为多种亚型，其中M1型和M2型巨噬细胞是两种主要的亚型。
M1型巨噬细胞通常与炎症反应和免疫防御有关，而M2型巨噬细胞则更多地参与组织修复和免疫调节。
近来的研究表明，脂肪间充质干细胞（ADSCs）对巨噬细胞的极化过程具有显著影响，尤其是促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化。
本文旨在探讨脂肪间充质干细胞如何促进这一转化过程，并阐述其潜在的应用价值。
二、脂肪间充质干细胞与巨噬细胞的相互作用脂肪间充质干细胞（ADSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，能够分泌多种生物活性分子，如生长因子、细胞因子和趋化因子等。
这些分子在免疫调节和细胞极化过程中起着关键作用。
当ADSCs与巨噬细胞相互作用时，它们能够通过分泌特定的信号分子来影响巨噬细胞的极化状态。
三、M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化的机制M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化是一个复杂的生物学过程，涉及多种信号通路和分子的相互作用。
ADSCs通过分泌特定的细胞因子和生长因子，如IL-4、IL-10和TGF-β等，来激活巨噬细胞的信号转导途径，从而促进其从M1型向M2型的转化。
这一过程不仅涉及巨噬细胞的表型变化，还包括其功能和活性的改变。
四、实验研究为了进一步探讨ADSCs促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化的机制，我们进行了以下实验研究：1. 培养ADSCs和M1型巨噬细胞，并观察ADSCs对M1型巨噬细胞的相互作用；2. 通过流式细胞术和免疫荧光染色等方法检测M1型和M2型巨噬细胞的表型变化；3. 分析ADSCs分泌的细胞因子和生长因子对巨噬细胞极化的影响；4. 探讨ADSCs促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化的信号转导途径。
五、结果与讨论实验结果显示，ADSCs能够显著促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化。
脂肪干细胞在组织修复中对血管化影响的研究进展
脂肪干细胞在组织修复中对血管化影响的研究进展在创面愈合、组织移植的过程中，如何能构建新生血管，建立新的血液循环，起着至关重要的作用。
因此，学者们进行了大量的研究，试图了解并寻求在血管化建立的过程中，发挥作用的各个环节及影响因素，通过控制这些因素提高组织的血管化进程及再生修复能力。
近年来的研究显示间充质干细胞（menchymal stem cells，mscs）对血管化具有明显的促进作用。
mscs最早是由friedenstein[1]在骨髓中发现的，此后研究发现mscs可以广泛分布于体内其他组织中，包括脂肪、肌肉、肝脏、胰腺、肾脏和脐血等处，其中脂肪来源的mscs（adipose-derived stem cells,adscs，adscs)因其来源广泛、取材方便等优势逐渐受到重视，adscs对血管化的影响更是很多专家学者研究和致力的方向。
本将就近年来adscs对血管化促进作用的研究状况进行综述。
1 脂肪干细胞的生物学特性adscs是从脂肪组织中分离出来的具有多向分化潜能的成体干细胞。
2001年，zuk等[2]首次从人吸脂术抽取的脂肪组织悬液中分离提取到adscs，此后人们对adscs的研究就一直在不断深入。
作为一种多能干细胞，adscs和骨髓间充质干细胞（bone menchymal stem cells，bmscs）在细胞生长增殖方式、多向分化潜能等方面都无显著差异[3]，在体外可以诱导分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经细胞、肝细胞、胰岛细胞、表皮细胞、真皮细胞和牙齿相关细胞等。
在表型上，其阳性表达cd9，cd29，cd49，cd54，cd105，cd106，cd166，cd44，cd71，cd10，cd13.cd73，cd90，cd146，cd55，cd59，ⅰ和ⅲ型胶原，骨桥蛋白，α平滑肌肌动蛋白，ⅰ型组织相容性抗原hla-abc，阴性表达的分子有cd11b，cd18，cd50，cd56，cd62，cd14，cd31，cd45，ⅱ型组织相容性抗原hla-dr[4]。
人骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养后的类髓核分化效应及其对髓核细胞表型的调节作用
１Ｄｅ ａｔ ｎ ｆＯｒｈ ｐ ｅ ｉｓ ｔｅＳ ｃ ｎ ｓ ｉ ｌｏ ｈ ｎ ｉＭｅ ｉａ ｉｅｓｔ， ｉｕ ｎ ０ ０ ０１ Ｃ ｉ ａ ２Ｄｅ ａ ｍｅ ｔｏ ． ｐ ｒｍｅ ｔ ｔｏ ａ ｄｃ ，ｈ ｅ ｏ ｄ Ｈｏｐｔ ｆＳ ａ ｘ ｄ ｃｌＵｎｖ ｒｉ Ｔａｙ ａ ３ ０ ， ｈ ｎ ； ． ｐ ｒ ｎ ｆ ｏ ａ ｙ ｔ Ｏｒｈ ｐ ｅ ｉｓ ｈ ｎ ｉ ａ ｅ ｆＭｅ ｉａ ｃｅ ｃ ｓ＆ Ｓ ａ ｘ ｅ ｔＨｏｐ ｔ ，Ｔ ｉｕ ｎ ０ ０ ０１ Ｃｈｎ ｔ ｏ ａ ｄｃ ，Ｓ ａ ｘ Ａｃ ｄ ｍｙｏ ｄ ｃ Ｓ ｉｎ ｅ ｌ ｈ ｎ ｉＧｒａ ｓ ｉａ ａｙ ａ ３ ０ ． ｉａ ｌ
Ⅱ型胶 原蛋 白的 ｍＲ Ａ表 达均 明显 增 加 （ Ｎ Ｐ＜００ ） 结 论 Ｂ Ｃ 与 ＮＰ ｓ ．１ 。 ＭＳ ｓ Ｃ 共培 养 时的 相互 作 用能 促 使 Ｂ Ｃ ＭＳ ｓ向
类髓 核 表 型分化 ， 较之 正常 Ｎ Ｃ ， 变 Ｎ Ｃ Ｐ ｓ退 Ｐ ｓ与 Ｂ Ｃ 共 培养 时 能更 明显地 促进 Ｂ Ｃ ＭＳ ｓ ＭＳ ｓ向类髓 核 表 型分 化 。同 时
７ ｄ ｙ． ｓ ｌ ｏ ｐ ｒｄ ｗ ｔ ｒ ｕ ，ｈ Ｎ ｘ ｒｓｉｎ ｆ ｏ ａ ｅ ， Ｏ － ｎ ｇ ｒｃ ｎｓ ｎ ｆ ａ ｔ ｐ ｅ ｕａｅ ａ ｓ Ｒｅ ｕｔ Ｃ ｍ ａｅ ｉ Ａ ｇｏ ｐ ｔｅｍＲ Ａ ｅ ｐ ｅ ｓ ｓ ｌ ｇ ｎＩ Ｓ Ｘ ９ａ ｄ ａ ｇｅ ａ ｉ ｉ ｃ ｎ ｙｕ ｒｇ ｌｔ ｓ ｈ ｏ ｏｃ ｌ Ｉ ｇ ｉ ｌ ｄ
ｃｅ ｓｐ ｌ ｏｕ ｏ ｅｔ ｅ ｉｋ ｄ ｇ ｎ ｒｔ ｎ ｐ ｔ ｎ ｓｏ ｃ ｌ ｓｓｐ ｔｅ ｔ．Ｆ ｖ ｒ ｕ ｒ ｅ ｉｎ ｄ ａ ｏｌｗｓ ｌｕ ｕ ｐ ｓ ｓｆ ｍ ｉ ｒｄｓ ｅ ｅ ｅａｉ ａｉ ｔ ｒｓ ｏｉ ｉ ａｉｎｓ ｉｅ ｇｏ ｐｓｗｅ ｅｄ ｓｇ ｅ ｓｆｌ ｒ ｈ ｏ ｅ ｏ ｏ ：Ａ ｏ ｐ ｒ ｇ ｕ
临床研究用人间充质干细胞质量评价
临床研究用人间充质干细胞质量评价一、引言人间充质干细胞（MSCs）由于其多向分化潜能、免疫调节特性以及易于体外培养等特点，被广泛用于临床研究。
在众多疾病的治疗中，MSCs 都展现出了巨大的潜力。
然而，要确保其在临床研究中的有效性，首先需要对MSCs的质量进行严格控制和评价。
本文将探讨如何评价临床研究用MSCs的质量。
二、MSCs的质量评价标准1、细胞的纯度和活性：这是MSCs质量评价的核心指标。
纯度是指MSCs中目标细胞的比例，而活性则是指MSCs的增殖能力和分化能力。
2、细胞的遗传稳定性：通过基因测序等方法，可以检测MSCs是否存在基因突变，以及是否存在潜在的致癌风险。
3、细胞的免疫调节特性：MSCs具有免疫调节特性，可以通过抑制免疫反应来降低排斥反应的风险。
因此，评价MSCs的免疫调节特性也是非常重要的。
4、细胞的来源和生产过程：MSCs的来源和生产过程也会对其质量产生影响。
例如，来自患者的自身MSCs可能比来自捐献者的MSCs更适合用于治疗。
同时，生产过程中的质量控制，如无菌操作、细胞培养基的质量等，也会影响MSCs的质量。
三、MSCs质量评价的方法1、细胞形态观察：通过观察MSCs的形态，可以初步判断其是否具有正常的形态学特征。
2、生长曲线测定：通过绘制MSCs的生长曲线，可以评估其增殖能力。
3、细胞表面标志物检测：通过检测细胞表面标志物，可以确定MSCs 的纯度和活性。
4、染色体核型分析：通过染色体核型分析，可以评估MSCs的遗传稳定性。
5、免疫调节特性检测：通过检测MSCs对免疫反应的调节作用，可以评估其免疫调节特性。
6、生产过程质量控制：通过监控生产过程中的关键控制点，可以确保MSCs的生产过程符合质量标准。
四、结论人间充质干细胞（MSCs）在临床研究中的应用前景广阔，但其质量评价是关键环节。
通过对MSCs的纯度、活性、遗传稳定性、免疫调节特性以及生产过程的质量控制等多方面的评价，可以确保其满足临床研究的需求。
间充质干细胞的研究进展及其应用
表 现 出 旺 盛 的 有 丝 分 裂 活 动 ，具 有 活 跃 的 增 殖 能 力 Ｊ 。
ＭＳ ｓ Ｃ 还具有很强 的 多 向分化 潜能 ，即使经 过 大量传 代后 ，
有 些 细 胞 仍 能 保 持 其 多 潜 能 性 。 大 量 体 外 实 验 表 明 ，不 同
改进 ，从而得 到更纯 的 Ｍ Ｃ。因多 数 ＭＳ ｓ Ｓｓ Ｃ 缺少 特殊 的细 胞表面标记 ，所 以都 是 通过 阴性选择 进行分 离 ，筛选 出不 表达 内皮 和造血 细胞标 记 的 Ｍ Ｃ 。 目前 已从骨 髓 、骨 膜 、 Ｓｓ 骨小粱 、脂肪组 织 、滑膜 、骨 胳肌 、脐血 、外 周血 和 乳牙
近 年 来 ，对 ．ｓｓ Ｍ Ｃ 的分 离 方 法 进 行 了 大 量 的 研 究 并 加 以
外培养时存在两种不 同的亚群 ，其 中一种是成纤 维样细胞 ， 称为成熟 Ｍ Ｃ ，这种细胞 的分化潜 能大。在生 理稳态情 况 Ｓｓ 下 ，成人体 内大多数 Ｍ Ｃ 增 殖并 不明显。但 在体外 补充适 Ｓｓ 量血清的培养液 中，它们能贴 附在 塑料培养 器皿 壁上生长 ，
文 章 编号 ： １０—９ １ （０８ ３Ｏ６ ． ０ ７０３ ２０ ）０．ＯＯ０ ３
中图 分 类 号 ：１ ３ １ ３
文献 标 识 码 ：Ａ
人脂肪源性间充质干细胞的分离培养和鉴定
中 图分 类 号
Ｑ ８ １ ３
文 献标 志码
Байду номын сангаас
Ａ
Ｉ ｓ ｏ ｌ ａｔ ｉ ｏ ｎ， ｃ ｕ ｌ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎｄ ｉ ｄｅ ｎ ｔ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏｎ ｏ ｆ ｈｕｍａｎ ａ ｄｉ ｐ ｏｓ ｅ ｄｅ ｒ ｉ ｖ ｅ ｄ ｍｅ ｓ ｅ ｎｃ ｈｙ ｍａ ｌ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ
Ｓ ｅ ｐ ２ ０１ ３
文 章编 号 １ ０ ０ ６ — ８ １ ４ ７ （ ２ ０ ｌ ３ ） ０ ５ — ０ ３ ５ ８ — ０ ４
人脂肪 源性间充质干细胞 的分离培养和鉴定
赵 辉 ， 吕军 强 ’ ， 贾 静’ ， 王 松 ’ ， 傅 正 ’ ， 车绪春 ， 陆 融１ １ ２ ， 林 刚２ ｉ 姚 智
第 １ ９ 卷 ５｛ ｝ ｝ 】 ３ ５ ８
２ ０ １ ３年 ９月
天 津 医科 大ｄ 学 学 报 Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｔ ｉ ａ ｎ ｊ ｉ ｎ Ｍｅ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ
Ｖ ｏ １ ． １ ９ ． Ｎ Ｏ ． ５
３ ０ ０ ０ ７ （ ） ． Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ）
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ０ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ： Ｔ ｏ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ａ ｎ ｄ ｅ ｘ ｐ ａ ｎ ｄ ｈ ｕ ｍａ ｎ ｄ ‘ Ｉ ｌ ｉ ｐ ｏ ｓ ｅ ｄ ｅ ｒ ｉ ｖ ｅ ｄ ｍｅ ｓ ｅ ｎ ｃ ｈ ｙ ｍ ａ ｌ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ（ ｈ Ａ Ｄ — ＭＳ Ｃ ） ｌ ｆ ＇ ｏ ｍ ａ ｄ ｕ ｈ ａ ｄ ｉ ｐ （ ） ｓ ｅ ｔ ｉ ｓ ｓ ｕ ｅ ， ａ ｎ ｄ
人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导的研究
4人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导的研究袁心剐范顺阳石磊董松波刘会琼【摘要】目的研究人骨髓间充质干细胞(H B M Cs)的体外培养和向血管内皮细胞的诱导分化。
方法利用密度梯度离心法将H B M C s从人骨髓中分离出来，体外扩增。
将第三代的细胞以含V E G F，bFG F的培养基定向诱导，使其向内皮细胞方向分化。
利用免疫细胞化学和流式细胞学检浸4诱导后的细胞表型。
结果原代未经诱导的骨髓干细胞，培养3周后细胞形态呈梭彤，诱导后第7天的细胞呈椭圆形或不规则形，第14天细胞大致呈铺路石样改变。
免疫细胞化学显示C D3l、C D34、vW F因子呈阳性。
流式细胞仪测定cD3l、vW F因子阳性率分别为87．5％、82．6％，双阳性率为71．2％。
结论骨髓间充质干细胞在内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞因子的诱导下向血管内皮细胞方向分化。
【关键词】骨髓间充质干细胞；血管内皮生长因子；碱性成纤维细胞生长因子；血管内皮细胞；诱导分化D i虢r enti at i on i nt o vas cul ar e ndot hel i al cel l s f r o m bone m ar r ow m es enc hym a l s t em cel i si nvi t ro Y U A N X i n-萨馏，似ⅣShun弘愕，SH I L ei，D O N G Song—bo，Ⅱ￡，H ui qi ong．舭豫砌A j够li at ed H ospi t al of Z heng zhou U n i vem i t y．Zhen gzh ou450052，C hi na【A bst r act】O bj e ct i ve T o st udy t he cul t ur e m et hods of hum a n bone瑚m w m es enchym al s t em ce l l s(M SCs)and di f f er en t i at i on i nt o vasc ul a r endot hel i a l cel l s i n vi t r o．M et hods B o ne I n f X T O W m e se n．chym al s t em ceU s w er e i s ol at e d and cul t i vat e d by de ns i t y gradi ent ce nt r i f uga t i on m et hod．I nduce t he t hi r d gener at i on t o va s cul a r endot hel i a l cens w i t h vas cul ar endot hel i a l grow t h f act or(V EG F)and ba si c f ibro—bl a st grow t h f a ct or(bFG F)．I m m unophenot ype s of cel l s w er e det ec t ed by f l o w c yt om e t ry t echni ques and i m m un ocyt e c he m i s t ry af t er t he t ra ns fe c t i on．R es ul t s A f t e r t hr e e w eeks of pri m ary cul t ur e of M SCs。
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人脂肪间充质干细胞向表皮细胞表型转化的研究赵周婷;胡大海;陶克;刘佳琦;张战凤;白晓智【摘要】目的:探索人脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)向表皮细胞表型转化的方法.方法:以手术中剩余的人皮下脂肪组织为材料来源,利用胶原酶消化法分离ADSCs,流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD90、CD105的表达,成脂诱导后油红0染色鉴定.实验组利用第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科实验室已成功构建的pcDNA3.1 (+)/SP+EGF质粒经脂质体介导转染的HaCat细胞,与ADSCs在Transwell小室中共培养,对照组为ADSCs 加入10％ FBS培养基,14天后Realtime-PCR检测两组ADSCs中CK19、integrin-β的mRNA表达量.结果:实验组ADSCs中CK19、integrin-β的mRNA 表达量较对照组明显升高,且差别有统计学意义.结论:转染EGF的HaCat细胞可诱导ADSCs向表皮细胞表型分化,从而为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持.【期刊名称】《中国美容医学》【年(卷),期】2014(023)022【总页数】5页(P1899-1903)【关键词】脂肪间充质干细胞;HaCat细胞;表皮细胞;组织工程【作者】赵周婷;胡大海;陶克;刘佳琦;张战凤;白晓智【作者单位】解放军第211医院五官科黑龙江哈尔滨150080;第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科全军烧伤中心陕西西安710032;第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科全军烧伤中心陕西西安710032;第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科全军烧伤中心陕西西安710032;第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科全军烧伤中心陕西西安710032;第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科全军烧伤中心陕西西安710032【正文语种】中文【中图分类】R751;R64皮肤缺损是外科领域的常见问题，尽早封闭创面，减少机体消耗和内环境紊乱是治疗皮肤缺损的关键。
烧伤外科中大面积烧伤患者皮源缺乏，自体皮肤移植是目前临床治疗全层皮肤缺损最有效的方法。
但是自体刃厚皮移植皮片易收缩，不耐摩擦，中厚皮有瘢痕挛缩等问题。
随着组织工程技术的发展，皮肤替代物的研究取得了实质性的进展。
种子细胞的体外培养、扩增是组织工程学研究中最基础的工作。
2001年，Zuk等[1]首次分离培养出能够自我复制、稳定增殖，并具有多向分化潜能的脂肪间充质干细胞。
ADSCs来自中胚层，在特定条件下可分化为脂肪、骨、软骨、心肌细胞、肝细胞、神经细胞等[1-5]。
ADSCs具有来源丰富、方便取材、低免疫原性、容易体外扩增等优点，在组织工程、创面修复及基因治疗方面具有良好的应用前景。
近年研究表明，ADSCs在体外培养过程中加入不同的刺激因子，模拟皮肤的微环境，能诱导成为具有各种表型的细胞。
Ramos等[6]证实，将分选纯化后的ADSCs植入裸鼠体内，可显著促进创面愈合，且具有表皮细胞再生的能力。
Derby等[7]将转染GFP+的ADSCs植入小鼠体内，8周后可检测出表皮细胞的标记物p63，证实通过脂肪移植ADSCs可转化为表皮细胞。
人角质形成细胞是皮肤创面修复的重要细胞，而表皮生长因子（epithelial growth factor，EGF）是创面修复过程中的关键因子。
EGF能促进细胞增殖、表皮再生、血管形成，同时能刺激表皮细胞合成分泌胶原、透明质酸等细胞外基质，促进结缔组织细胞的生长[8]。
Shiki j i等[9]成功地应用EGF诱导体外培养于立体胶原表面的人表皮细胞向胶原内生长并形成汗腺管结构。
因此，本实验研究利用pcDNA3.1(+)/SP+EGF 质粒经脂质体介导转染的HaCat细胞诱导人ADSCs体外转化为表皮细胞表型的可行性，为其在组织工程中的应用提供理论依据。
1.1 主要仪器与试剂：Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、IBMX、地塞米松、胰岛素、吲哚美辛均购自美国Sigma公司，CD29、CD90、CD105鼠抗人多克隆抗体购自美国Bio Legend公司，TRIZOL购自美国Invit rogen公司，反转录试剂盒、SYBR Green荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa生物工程公司，流式细胞仪购自美国Becton-Dickinson公司、DU800型分光光度计购自美国Beckman CouLter公司，iQ5TM荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。
1.2 ADSCs的分离培养：无菌条件下取外科手术后剩余人体腹部皮下脂肪组织（患者知情同意）约10g，于1h内送至实验室。
在超净台内于含青霉素（300U/mL）、链霉素(300μg/mL)的PBS液中浸泡10min，PBS冲洗，眼科剪将脂肪组织反复剪碎至1 mm×1mm大小，加入约10ml的0.1%Ⅰ型胶原酶，于37℃水浴锅内剧烈震荡消化1h，加入10ml的10%FBS中和胶原酶，离心，弃上清，重悬，200目筛网过滤，离心，弃上清，重悬，将细胞种植于25cm2细胞培养瓶中，置于37℃、体积分数为5%的CO2孵育箱中。
1.3 ADSCs的鉴定1.3.1 流式细胞仪：取生长良好的第三代细胞，制成5×107/mL单细胞悬液，分别加入荧光标记的鼠抗人多克隆抗体CD29、CD90、CD105各20μl，加入细胞悬液，混匀，离心，流式细胞仪检测。
1.3.2 诱导ADSCs向脂肪细胞定向分化：待细胞生长至80%～90%融合时，加入成脂诱导培养基[10]：10%FBS，DMEM，0.5mmol/L IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)，1μmol/L地塞米松，10μmol/L胰岛素，200μmol/L吲哚美辛。
1.4 ELISA检测HaCat-hEGF细胞中EGF含量：本实验室用pcDNA3.1(+)/SP+EGF质粒经脂质体介导转染HaCat细胞，经G418长期筛选已成功获得稳定分泌人表皮生长因子的细胞株。
分别收集24、48、 72h内HaCat-EGF细胞的无血清上清液，检测方法按照检测试剂盒使用说明进行，具体步骤如下：待测品孔每孔加入待测样品100μL，将反应板充分混匀后置于37℃，120min，用洗涤液充分洗涤反应板4～6次，在滤纸上印干，每孔加一抗工作液100μL，混匀后置于37℃，60min，洗板，每孔加入酶标抗体工作液100μL，置37℃，60min，洗板，每孔加入100μL底物工作液，置37℃暗处反应15min，每孔加入100μL终止液混匀，在酶标仪上450nm处测吸光度（OD值）。
1.5 实验分组：分为1个实验组和1个对照组。
实验组为Transwel l小室共培养，上室为HaCat-hEGF细胞，下室为ADSCs，加入10%FBS培养基，对照组为ADSCs加10%FBS培养基。
培养14天后用TRIZOL提取总RNA，按说明进行操作。
1.6 反转录：利用反转录试剂盒合成cDNA，反应体系为10μL。
具体体系为：5×Buf fer 2μL，RT酶0.5μL，Ol igo·dt引物（50μmol/L）0.5μL，6-mer （100μmol/L）0.5μL，RNA 1μg，ddH2O 5.5μL，补足10μL反应体系。
反应条件：37℃，15min，85℃，5s。
1.7 引物设计：以下引物均由TaKaRa生物工程公司设计并合成。
1.8 SYBR Green实时荧光定量PCR检测ADSCs中CK19、integrin-βmRNA表达：反应体系为20μL，SYBR Green混合液10μL，P1（10μmol/L）0.5μL，P2（10μmol/L）0.5μL，cDNA2μL，ddH2O 7μL。
反应条件为：预变性95℃30s，变性95℃10s，退火60℃10s，共40个扩增循环。
以GAPDH为内参，CK19、integrin-β为阳性对照，每个样品基因设3个复管。
利用iQ5TM荧光定量PCR仪进行SYBR Green荧光定量PCR分析，实验结果用iQ5软件行CT相对定量分析。
1.9 统计学分析：采用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理，数据以均数±标准差（±）表示，组间对比采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，＜0.05差异有统计学意义。
2.1 细胞培养如图1～2。
2.2 细胞表面标记物：经流式细胞仪检测，ADSCs均一表达CD29、CD90、CD105，阳性率分别为73.4%、97.3%和80.4%。
2.3 油红O染色鉴定ADSCs向脂肪细胞定向分化：诱导1周后可见细胞内有大小不一的脂滴形成，油红O染色后可见脂滴被染成橙红色（如图3）。
2.4 HaCat-EGF细胞中EGF分泌量：经ELISA试剂盒检测，转染EGF的HaCat细胞24、48、72h EGF的分泌量分别为：492、622、943ng/L （如图4）。
2.5 SYBR Green实时荧光定量PCR检测ADSCs mRNA水平（如图5）。
ADSCs凭借其来源丰富、取材容易、对机体损伤小、体外增殖迅速、生物学性状稳定等优点，已成为细胞移植及组织工程理想的种子细胞，是人体干细胞库潜在的重要来源。
本实验从外科手术中剩余的腹部皮下脂肪组织为来源，采用胶原酶消化法及DMEM培养法分离得到细胞。
目前，CD29、CD90、CD105被公认为具有多向分化潜能细胞的标记分子，而造血细胞及内皮细胞的标记分子，如CD34在ADSCs中是否表达却存在争议。
在本实验中，ADSCs经流式细胞仪分析证实CD29、CD90、CD105表达为阳性。
干细胞与终末分化细胞的不同之处不仅在于细胞表面标记分子表达情况不同，而且前者具有多向分化的能力，因此鉴定ADSCs最好的方法是进行多向分化诱导并进行相应检测以确定诱导成功。
故本实验采用成脂诱导分化实验对培养细胞的干细胞特性进行鉴定。
本实验利用pcDNA3.1(+)/SP+EGF质粒经脂质体介导转染的HaCat细胞与ADSCs共培养，通过转染EGF的HaCat细胞分泌EGF，以及HaCat细胞分泌的其他细胞因子作用于ADSCs，使ADSCs向表皮细胞表型转化。
构建的EGF基因表达载体不但可以经体外培养及活体途径转入人角质形成细胞，同时可借助外分泌机制参与对邻近细胞的生长调控。
CK19、integrin-β被认为是表皮干细胞的重要标记物[11-12]。
研究表明，缺少integrin-β会严重影响表皮的分化和形成，其介导表皮干细胞与细胞外基质的粘附，还调控终末分化的启动[13]。
因此，本研究选择CK19、integrin-β作为检测ADSCs分化的指标。
本实验成功诱导了ADSCs向表皮细胞表型的定向分化，对临床上解决大面积烧伤、严重创伤病人的皮源紧缺以及促进创面修复等问题提供了新的探索途径，为ADSCs成为表皮组织工程学研究的理想种子细胞奠定了基础。