血液细菌16S rRNA基因检测的诊断价值
PCR法检测16S rRNA基因在败血症诊断中的价值

评 价外周血 细菌 1SrN 6 R A基 因检测诊 断败血症 的敏感性及特异 性。方法
利 用通用 引物 对 6
种常见细菌 1SrN 6 R A基 因进行扩增 , 通过 阳性菌株及阴性对照检测引物的特异性 ; 观察不同退火 温度及不 同细菌 浓度 下 P R检测效果 ; C 检测败血症患者及正常人血液标本 中的 1 Sr N 6 A基 因表达 , R 并与血 培养结果进行 比较 , 评 价其诊断意义 。结果 6种阳性菌株均出现特异 阳性条带 , 阴性质控未 出现 阳性 条带 ; 不同退火 温度对 P R结果 C
心 5mi, 上清 采 用 P R法 检 测 1Sr N n取 C 6 R A基 因。 ③不 同退火 温度 下 P R扩 增 : 别 取金 黄 色葡 萄球 C 分 菌和大肠埃希 菌各 5管的 D A模板 各 2 , N 加入 上 、 下游引物各 1 ,a T q酶混 合液 1. , 蒸水 补足 25 双 反应体系总量 为 2 。9 =5rn预 变性 ,4。 5 5 4c i l a 9 I 0 = s退火温度 ( 、 分别设置 为 5 、55 、1 6 25 、86 、 4℃ )7 、2℃
健康 查体 者 为对照 组 , 一ห้องสมุดไป่ตู้般资 料 与 败血 症 组具 有 其
可 比性 。
1 2 检 测 方 法 两 组 均 于 清晨 采 集 空 腹 静 脉 血 .
( 中观察 组于抗 生素 治疗 前 采集 ) 分别 行 血培 养 其 , 和细 菌 1Sr N 6 R A基 因 检 测 。① 血 培养 及 鉴定 : 取 静脉血 8I , l 注人含 血 液增菌 液 2 l I l 5r 的培 养瓶 中 , n 混匀后 用 B D公 司 的 B C E 10血 培 养 仪 做 细 A T C9 2
16s rrna报告解读

16s rrna报告解读摘要:1.16s rRNA简介2.16s rRNA报告解读方法3.报告结果分析与应用4.报告的局限性与未来发展方向正文:随着分子生物学技术的发展,16s rRNA报告已成为微生物学、生态学等领域的重要研究手段。
16s rRNA是细菌核糖体的一部分,具有种属特异性,可通过高通量测序技术对微生物群落进行定性和定量分析。
本文将介绍16s rRNA报告的解读方法、结果分析与应用,以及报告的局限性与未来发展方向。
一、16s rRNA简介16s rRNA存在于细菌细胞中,负责蛋白质生物合成。
由于不同细菌物种的16s rRNA序列存在差异,可通过测定该序列对微生物进行分类和鉴定。
目前,16s rRNA测序已成为微生物多样性研究的主要手段。
二、16s rRNA报告解读方法1.序列分析:将测序得到的原始数据进行质控、比对、组装等处理,得到序列。
然后,通过序列之间的相似性分析,对微生物物种进行分类和鉴定。
2.生物信息学分析:基于序列数据,进行物种多样性、群落结构、代谢途径等分析。
常用的生物信息学工具包括MetaPhlAn、Kraken等。
3.统计分析:对生物信息学结果进行统计,评估样本间的差异性和相似性,为实验结果提供依据。
三、报告结果分析与应用1.物种多样性分析:通过统计不同物种的序列数量,评估样本中的微生物多样性。
2.群落结构分析:分析不同物种在样本中的相对丰度,揭示微生物群落的组成和变化。
3.功能基因分析:基于代谢途径和基因功能,分析微生物群落的代谢活性。
4.应用:16s rRNA报告可用于医学、环境、农业等领域的微生物学研究,为疾病诊断、环境保护、农业生产等提供科学依据。
四、报告的局限性与未来发展方向1.局限性:16s rRNA报告无法区分共生和病原微生物,且受样本制备和测序深度等因素影响。
2.未来发展方向:发展更高效的测序技术、生物信息学方法,以及整合多组学数据进行综合分析,提高报告的准确性和应用价值。
16SrRNA基因在医学微生物鉴定中的应用效果观察

[ ] 雷正瑜.6 r N 1 1SD A序列分析技术在微生物分 类鉴定 中的应用 [ ] 湖北 J. 生态工程职业技术学院学报 ,0 64( ) 3— . 2 0 , 1 : 7 [ ] Mi e w I OsnK,oaoJe a. an sc ti n l ia snf 2 c l C, l L zn ,t Di ot it adcicli i ho e 1 g iu l y n g - 从( 上表中可以看出) 采用 1 S N , 6 r A基 因检查诊 断支原体肺炎 较采用 R 血清学检查诊 断支原体肺炎在假 阳性率 、 敏度、 灵 耗时方面有明显的优势 , P < .5 比较差 异有统计学意义 。 O0 ,
标准。
【 关键词 】6 r N 1SR A基 因; 医学微生物检 定; 效果评价 d i1 .9 9ji n 10 0:0 3 6 /.s .0 6—15 .0 10 .7 s 9 92 1 .80 9 文章编号 :0 6—15 ( 0 1 0 3 9 10 99 2 1 )一 8— 5 4—0 2 1S N 6 r A基因序列检测技术的原理是 : R 细菌染 色体上编码 r N R A的相 对 应 的 D A序列存在于所有细 菌及衣 原体 、 克次体 、 N 立 支原体 、 旋体 、 线 螺 放 菌等原核生物的染色体基 因中 , 不存在 于病毒 、 真菌等非 原核生 物体 内, 而 目前 , 几乎所有病原 菌的 1 S N 6 r A基因测序均 已完成 , R 这样 , 使得采用基 因 序列图谱进行对比分 析测试 病原菌 的种 类成为 了可能 , 过该技术 可 以准 通 确快速的鉴定细菌的种类 … 。 养、 免疫学和生化反应等方法 , 这些检测方 法的检 测结果受 多种因索影响 , 均存在特异性差、 耗时长 、 敏感 度低等问题 , 以满 足临床 医学 检验的发展 难 要求 L. 。近年来 , 2 j J 随着聚合酶链式反应 ( C 技术的出现及核酸研究技术 P R) 的不断完善以及其它分子生 物学技术 的迅 速发展 , 生了很多新 的细菌分 产 类鉴定 方法 , 常见 的如 限制 性片段 长度多态 性分 析、 质粒 图谱 、 N r A基 因 R ( r N ) 即 D— A 指纹 图 、 C P R指纹 图、 6 1 S核糖 体核 糖核 酸 (i s a R A ro m l N 。 bo 1资 料 与 方 法 . rN 序列分析等_ 。这些 技术均 基于对细 菌染色 体或染 色体外 的 D A R A) 4 J N 1 1 一般资料 : . 本组 5 4例患者 中 , 男性 2 3例 , 女性 3 1例 , 年龄 2一l 片段进行分析 , 1 从分子遗传的角度对细菌进行分类鉴定 , 从而使细菌分类更 岁, 平均年龄 6 2 .3岁 。所有患者均进行血清学检查诊 断和 1SR A基 因序 精确 、 6rN 更科学。特别今年来出现的 1SR A基因序列分 析技术 , 以做到用 6rN 可 列检测肺炎支原体。以上患者的临床表现主要有 : 头痛、 发热伴有无力 和干 实验 研 究 来 研 究 证实 细 菌 进 化 与 否 , 是 细 菌 分 类 史 上 的一 次 革 命 【j 目 这 5。 咳等。 前, 大多 数致病 菌 的 1 SR A基 因序 列 已经被测 定 完成 , 于 P R扩增 6 rN 关 C 12 检查方法 : . 分别对 5 4例患 者进行血清 血检查 诊断 和 1SR A基 1SRN 6rN 6 r A基因用 于细菌分类和鉴定 的研究越来越多t] 6。 因序列检查诊 断, 统计两种检查方法的假阳性率 、 灵敏 度、 检测耗时等指标 , 肺炎支原体是一类能在无生命人 工培养基 中生 长、 繁殖 的最小 的原核 分析两种检测 方法在诊断肺炎支原体感 染时的优劣 。 型微生物 , 曾被称 为胸膜炎微 生物( l rp em na ieogns P L 。 pe o nu oi —l rai u k m, P 0) 12 1 血清学检查诊断 : 体感染肺 炎支原 体后 , .. 人 血清 中除了出现 特 临床 的上呼吸道感染 、 气管支气 管炎及非典 型肺炎经 常是 由肺炎支原 体感 异性抗体外还存在冷凝素 , 患者的稀释血清 与 O型红细胞在 4C " 下可发生凝 染引起 。由于肺炎支原体感染 所致 的肺 炎患者临床表现 症状不典型, 需 集, 此为 I 型抗体 。以 E I g M LS A方法检 测患者 血清 中 M P—I g M。以 M 要经过 1 P— 0~2 d的潜伏期才 能表现 出来 , 0 临床 症状主要 为非特异性 的头痛 I g M≥l8 和 ( ) 凝集 试验 ≥13 : 0 或 冷 : 2判断为有支原体感 染, 结合临床有发 和发热 , 患者常常伴有无力和干 咳 , 根据这些 临床 症状较难判断为肺炎支原 热、 头疼、 无力 、 干咳等症状判定为感染肺炎支原体 。 体感染 , 因此临床 常被忽视而导致 严重 的并 发症 , 因此 , 利用实验 检查 就成 12 2 6 rN . . 1 S A基因序列 检查 : R 从鼻咽和 口腔采用拭子采 样进行 P R 为 了诊断肺炎支原体感染的主要依 据【 。近年来 , C 8 J 对于肺 炎支原体感 染的 扩增 , 引物取 自 肺炎支原体的 1SR A, 照肺 炎支原体 的基 因序列进行对 流 行 病 学 特 征 、 病 机 制 、 子 生 物 学 检 测 方 法 的 研 究 报 道 较 多 。 目前 , 6 rN 按 致 分 用 比分析 , 符合肺炎支原体基因序列并 伴有发热 、 头疼 、 无力 、 咳等症状判定 于诊断支原体肺炎 的方法是取上呼吸道标本做 P R和急性期血 I 千 C s M的复合 为感染肺炎支原体 。 测定 。但人们对于上呼吸道 MP携带者与急性 期肺炎上 呼吸道标本的 P R C 13 统计学方法 : . 计量资料采用 t 检验 , 数资料采用 x 检 验 , 计 且以 P 阳性者较难区分, 且对于儿童诊 断 MP肺炎取材 的理想位置和方法还未明 而 < . 5为有统计学意义 。 00 确建立 。因此 , 找到一种有效、 快速 、 期的支 原体肺 炎鉴定方法 就显 得尤 早
新生儿败血症细菌16SrRNA基因的分子生物学诊断

* 5项指标为CRP,mESR,WBC,PLT及I/T
讨论
新生儿败血症临床上缺乏特异指征,血培养虽是重要的诊断依据,但阳性率不高,所需时间长,不能达到早期诊断的目的。我们在细菌16SrRNA基因保守区内自行设计引物,建立了可检测所有细菌的16SrRNA基因PCR法,对检测菌株及临床血标本、人基因组DNA及巨细胞病毒进行PCR法扩增,经实验证明具有高度的特异性与敏感性,PCR最小DNA检出量1 pg(相当于3个细菌),所有检测菌株均获371 bp的阳性DNA条带,不与人基因组DNA及病毒交叉反应。而且检测快速,6~8 h即可报告。经临床标本检测证明,若以血培养阳性为确诊败血症、5项指标2法项阳性为临床败血症的诊断标准,PCR法的灵敏度为88.9%,特异性为90.9%,正确诊断指数达0.798,说明16SrRNA基因PCR是一种有相当潜力和前途的诊断方法。同时,PCR法结果可进一步进行反相杂交,以区分细菌系革兰阳性菌抑或革兰阴性菌,可以指导临床用药。从而达到:(1)早期快速诊断新生儿败血症;(2)明确病原菌系革兰阳性或革兰阴性菌,为临床使用何类抗生素提供参考。
(五) 血培养及非特异5项指标 均按临床常规方法进行。
四、统计方法
各方法检测结果用配对计数资料比较。诊断方法的比较采用流行病学的诊断标准计算其灵敏度,特异度,拟然比及正确诊断指数。
结果
一、16SrRNA基因PCR法的敏感性与特异性
用PCR法扩增20种检测菌株,经电泳在相当于371 bp处均可见一条DNA带。用人基因组DNA、巨细胞病毒扩增,未见阳性条带。说明与人基因组及病毒无交叉反应,对细菌具有较高的特异性。取大肠埃希菌所抽提的DNA作模板,1∶10定量稀释,PCR最小检出量为1 pg(10-12 g)。对20种检测菌株PCR产物进行反相杂交结果:20种菌株中,7株革兰阳性菌中,革兰阳性菌探针、通用探针阴性,革兰阴性探针阴性;13株革兰阴性菌中,革兰阴性菌探针、通用探针均阳性,革兰阳性菌探针阴性。反相杂交区分革兰阳性/革兰阴性菌结果与已知检测菌株全部符合。
探讨细菌16S rRNA基因检测对新生儿败血症早期诊断的意义

贾永锋 ① 朱金 梅 ②
[ 文章编号]1 6 7 2 — 8 2 7 0 ( 2 0 1 6 ) 1 1 - 0 0 9 0 ~ 0 4 [ 中图分类号] R 7 2 2 . 1 3 1 [ 文献标识码】A
[ 摘 要】 目的 :探 讨 细菌 1 6 S 核糖 体 核糖 核 酸( 1 6 S r RNA) 基 因检测 对新 生 儿败 血症 早 期诊 断 的意 义 。方 法 :对 1 2 6 例 疑似 新 生 儿败 血症 患 儿 的血 标 本进 行 1 6 S r RNA基 因 聚合 酶链 反 应 ( P C R) 检测 ,并 同时做 血培 养 ,比较分 析两 种方 法检 测 细菌病 原 体 的快速 性 、敏感 性 和特 异 性 。结果 :1 2 6 例 疑似 新生儿 败血 症患 儿的血 标本 经血 培养检 测 阳性率 为 l 3 . 8 %( 1 7 /1 2 6 ) ;经 PC R检 测 阳性率 为 2 2. 2 %( 2 8 /l 2 6 ) ,PC R检 测 阳性率 明显 高于 血培 养检 测 阳性率 ,差 异显 著 ( X =1 0 . 2 3 4 ,P=0 . 0 0 4 ) 。以血培 养为 “ 金标 准” ,P C R检测灵 敏度 为8 8 . 2 %( 1 5 / 1 7 ) 、特异 度 为8 8 . 1 %( 9 6 /l 0 9 ) 。从操作 时间分 析 ,血培 养和 P CR检 测的平 均 时 间分 别 为( 2 8 . 9士4 . 3 ) h和 ( 7 . 5 ±1 . 2 ) h,P C R检测速度明显快于血培养 。结论 :细 菌1 6 S r RNA基 因P C R检测方法速度快 、 敏感性高且特异性强 ,不受抗生素 的干扰 ,可 为新生儿败血症 的早期诊断提供 可靠依据。
细菌16SrRNA基因检测在新生儿败血症诊断中的价值

细菌16SrRNA基因检测在新生儿败血症诊断中的价值林丹娥;翁立坚;杨斯岚;林霓阳;房晓祎【期刊名称】《汕头大学医学院学报》【年(卷),期】2024(37)1【摘要】目的:探讨细菌16S rRNA基因检测在新生儿败血症诊断中的应用价值。
方法:选取2016年12月—2018年1月汕头大学医学院第一附属医院收治的102例疑似败血症新生儿为研究对象,其中男性66例,女性36例,年龄10 min~28 d。
采集研究对象血液标本分别用血培养和细菌16S rRNA基因PCR检测法进行病原检测,选取10例同期因非感染性疾病住院的新生儿的血液标本作为对照。
结果:102例疑诊败血症新生儿中的46例经临床诊断及实验室确诊为败血症,血培养阳性率32.61%(15/46),16S rRNA基因检测阳性率91.30%(42/46),16S rRNA基因检测阳性率高于血培养(P<0.001)。
10例同期住院的非感染性疾病患儿的血液标本PCR检测及血培养结果均为阴性,PCR检测灵敏度为91.30%(42/46),特异度为96.43%(54/56)。
结论:与传统血培养相比,16S rRNA基因PCR检测法阳性率高,且敏感准确。
【总页数】4页(P35-38)【作者】林丹娥;翁立坚;杨斯岚;林霓阳;房晓祎【作者单位】汕头大学医院第一附属医院新生儿科;中山大学附属第七医院新生儿科【正文语种】中文【中图分类】R722.131【相关文献】1.应用PCR方法检测重症合并感染病人血中细菌16SrRNA基因的临床价值2.用16SrRNA基因PCR法对新生儿败血症细菌DNA的检测3.16SrRNA基因检测在儿童细菌性脑膜炎早期诊断中的应用4.慢性非细菌性前列腺炎患者的前列腺液和前列腺组织中的细菌16SrRNA基因检测因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
应用PCR方法检测重症合并感染病人血中细菌16SrRNA基因的临床价值

w r d t d d a e i h r l l o ee t1 S RNA e ewi CR a d p r r b ce il lo u t r i h — e e a mi e . r wnp rp e a o dt d t c r t b o 6 g n t P n e f m a tr o d c l esmu a h o a b u
J n , U u_ Ⅱ
Hu 。H o — h n D p r e t o aoao , un n Poic lH si fC iee Ta io a Me i n a A0 Y u c e g(e at ns fL b rt yY n a rv i opt o hn s rdt n dc e Z m r n a l a i l i
菌 1SR A的基 因 ,阳性率 为 3 .%。血细菌培养阳性的 6人 ,阳性率仅为 1 %。血细菌培养 阳性者其 P R结果全部为 阳 6 rN 25 5 C 性 。结论 用 P R方 法检测重症合并感染病 人血 中细菌 1SR A基因具有灵敏 、快速 、不受使用抗 生素的影响 ,与临床诊 C 6 rN 断吻合度高等优点 ,弥补与丰富了微 生物学 的检测方法 ,为准确认识和救治重症合并感染提供 科学依据 。 关键词 :重症合并感染 ;P R;细菌 ;1SR A基 因 C 6rN
关 注 的热 点 。
16S rRNA、16S-23S rRNA基因测序分析检测主要血流感染病原菌比较

16S rRNA、16S-23S rRNA基因测序分析检测主要血流感染病原菌比较金中淦;葛平;徐蓉;陈蓉;宣瑛;刘学杰;王庆忠【摘要】目的比较细菌16S rRNA、16S-23S rRNA基因测序分析在血流感染病原菌检测中的作用.方法提取临床上血流感染常见的金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、洛菲不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、潘尼变形杆菌、屎肠球菌、粘质沙雷菌、宋内志贺菌、产气肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、腐生葡萄球菌基因组DNA,运用16S rRNA、16S-23S rRNA基因进行PCR扩增.扩增产物经测序后在美国国家生物技术中心( NCBI)上进行比对分析,确定菌种.结果在所分析的19种临床血流感染常见细菌中,16S rRNA基因测序分析可将除粘质沙雷菌外的细菌鉴定到种的水平,但无法完全区分近缘种属;16S-23SrRNA成功鉴定17种细菌,除大肠埃希菌、宋内志贺菌外所有细菌均成功鉴定到单一种的水平.结论16S-23S rRNA基因可作为血流感染细菌检测较好的分子靶标.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2012(004)003【总页数】5页(P181-185)【关键词】16SrRNA;16S-23SrRNA【作者】金中淦;葛平;徐蓉;陈蓉;宣瑛;刘学杰;王庆忠【作者单位】上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126【正文语种】中文以菌血症和败血症为主的血流感染具有低发生率、高危险性的特点[1]。
据报道,美国血流感染的总体病死率可高达14%~63%,但在明确病原菌后采用针对性治疗,其死亡率可降至5%~17%[2~4]。
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血 液 细 菌 1 Sr N R A基 因检 测 的诊 断 价值 6
陈秉 宇 吕火祥 谢一唯
【 摘
要 】 目的
探 索快 速 可 靠 的 检 测 细 菌 感 染 的新 方 法 。方 法 用 P R技 术扩 增 实验 室保 留株 1 株 的 C O
1Sr N 6 A基 因 , 乙型 肝 炎 病 毒 一D A、 R 以 N 白假 丝 酵 母 茵 和人 类 基 因组 D A 为对 照 , 测 该 方 法 的特 异 性 ; N 检 采 用 1 比稀 释 法进 行 该 方 法 的 灵敏 度 检 测 。 果 对 所测 细 菌株 均 获得 45 p 增 产 物 , 与 乙型 肝 炎 病 毒 O倍 结 7b 扩 而
Thedign s cv l fdee to o ce il1 S RNA e ei blo a o t aueo tci n fba t ra 6 r i gn n o d CHEN n y Bi g u, L Hu xa g, XI Yi i U o i n E we .
Co lso ncu in Th t o f 1 S r e meh d o 6 RNA e e PCR n d tci g b ce a h h d a tg f s e ict gn i ee tn tr a t e a v a e o p c iy,r pdi n a i s n f ai t ad y
s n ivt e st iy. i
【 yw rs spi ma bc r ; 6 N ee pl e s hi r c o Ke od 】 ete i; at i 1Sr Agn ; o m r e a atn c ea R y a c ne i
0 包括 : 大肠埃 希菌 、 黄 金 长期 以来 ,临 床微生 物 实验 室一 直 以分 离培 养 见 引起 败血 症 的菌株 1 株 , 作 为 细菌 鉴定 的常用 方法 ,也是 临床 医 生确诊 败血 色 葡萄 球菌 、 皮 葡萄球 菌 、 表 奇异变形 杆 菌 、 铜绿假
溶 肺炎 克雷伯 菌 、 门菌 、 贺 沙 志 症 唯一 的特 异性诊 断依据 。 方法虽 然具 有特 异性 , 单 孢菌 、 血 葡萄球 菌 、 该 但 耗 时长 阳性率低 , 而且 受抗 生素 治疗 影响 n , 】 难 菌 及 枯 草 杆 菌 。 自假 丝 酵 母 菌 、 乙 型 肝 炎 病 毒 以满足 临床 需要 。近年来 , 分子 生物 学 的快速发 展 ,
D A s o e o岫 Di c t n p o u t . e s ii s h w d t a o l ee t slw a 1 5× 1 /L O N h w n d 1 ai rd c s S n i vt t t o e h t t u d d tc s . i f o t ye s ic a o 0‘ E.c l . f oi
D pr etf r s s n Z eag r ic l epeS op a. aghu 10 4C i ea m n oTa f i , hj n Po ni ol’ H si H nzo 0 1 ,hn t n uo i v aP t 1 3 a
[ btat 0 ic v T uy8r i n lbem t df edt t no at i ietn Me o s 6 A s c| bet e os d pdadri l e o r h e i f cea n co . t d 1S r i t a ea h o t c e o b r f i h
一
D A 白假 丝 酵母 茵和 人 基 因组 D A 无 交 叉反 应 ; C N 、 N P R最低 能 检 测 15 0 / . ×1 ‘ L大肠 埃 希 氏茵 。结 论 1S 5
r N基 因 P R检测 细 菌感 染 的 方 法具 有 特 异 性 、 速 性 和 敏 感性 高等 特 点 。 R C 快 【 键词】 败血症 ; 菌;6 关 细 1S核 糖 体 核 糖 核 酸基 因; 合 酶链 反 应 聚
DNA sc mp rs n; es n iiiyts sd neb h to f1 r d a i to . oi Re u t T eb ce a 8 o aio Th e st t e twa o yt emeh d o 0 ga u dl in O E c l. v l u f s ls h a trl i s e iswee a p c e r mpl e n h rdu t r 7 bp i e gh. tHBV — DNA , c n ia abia s a d h ma e o f i d a d te p o cswe e 4 5 n ln t Bu a dd l e n n u n g n me
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全科 医学临床与教育 20 年 9 第 5 07 月 卷第 5 Cicl dctn f ee r te e . 07 o..o5 期 li uao Gnr Pai Sp 20 .V1 N . n aE i o l a cc 5
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临床 研究 ・
r A g n ftn b cei p ce ee a p i e i C ,u ig HB —DN RN e e o a tr s e isw r m l d w t P R e l a i f h s V n A, c n ia abc n n u n g n me a dd lia sa d h ma e o