免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的定量检测—单向琼脂扩散法
项目四 单相免疫扩散试验
项目四单相免疫扩散试验(Single immunodiffusion test)【实验原理】单相琼脂扩散试验是一种定量血清学测定方法。
将一定量抗体混浇于琼脂凝胶板中，置于凝胶孔中的定量抗原向四周扩散，抗原与相应抗体在凝胶中结合形成白色沉淀环，其大小与抗原浓度成正比。
抗原含量可从用标准抗原测定制作的标准曲线上查得。
【试剂和器材】1．抗人IgG诊断血清(单扩效价1:80)。
2．待检人血清、标准抗原(参考血清，其中人IgG含量为8.04g/L)。
3．琼脂粉、生理盐水、NaN3。
4．玻璃板、吸管、10μl微量加样器、打孔器(绘图笔尖，直径约3mm)、湿盒等。
5．水浴箱、水平台。
【步骤和方法】1．制备琼脂凝胶用生理盐水配制浓度为30g/L的琼脂，加入NaN3使最终浓度为0.1g/L，沸水浴中溶化至澄清。
取5ml加到中试管中，将它移放到50~52℃水浴中，直到温度平衡为止(需15~30min)。
2．制备含抗人IgG抗体的琼脂凝胶板用生理盐水将单扩效价1:80的抗人IgG诊断血清作1:40稀释，取5ml 加到大试管中，置于50~52℃水浴中平衡。
将上述平衡后的琼脂加到含抗血清的大试管中，迅速颠倒数次混匀。
用刻度吸管吸取，浇注玻璃板(置水平台上，最好加热至45~50℃)，使琼脂凝胶厚度为1.5~2.0mm，置室温冷却凝固(需15~20 min)。
3．打孔用绘图笔尖按图1-4打孔，孔径3mm，孔距10~12mm。
要求孔打得圆整、光滑、不要破裂。
标准抗原孔待检血清孔图1-4单相免疫扩散试验4．加样将参考血清用0.5ml蒸馏水溶解，再用生理盐水按下表1-3稀释成不同浓度。
将待检血清用生理盐水1:50稀释。
按编号顺序将它们分别加入各孔中，每孔加10μl。
表1-3 血清稀释表稀释倍数12.5 25 50 100 200IgG含量(mg/L) 643.2 321.6 160.8 80.4 40.25．扩散将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，置37℃24h观察结果(图1-4)。
免疫学复习题与答案(新1)
免疫学（新1）恭喜您已完成本次考试！本次考试您的分数为0单选题（200题，200分）1、下列英文缩写的中文含义不正确的是1分答案不确定A.IL—白细胞介素B.EPO—血小板生成素C.SCF—干细胞生长因子D.TNF—肿瘤坏死因子E.CSF—集落刺激因子考生答案：正确答案：B试题分数：1考生得分：0答案解析：EPO为促红细胞生成素。
2、可溶性抗原定量测定常用的方法是1分答案不确定A.免疫印迹法B.ELISA(夹心法)C.直接凝集试验D.ELISA(间接法)E.免疫荧光技术考生答案：正确答案：B试题分数：1考生得分：0答案解析：ELISA（夹心法）灵敏性强，特异性高，是可溶性抗原的定量测定方法。
3、抗原定性或定位常用的方法是1分答案不确定A.免疫印迹法B.ELISA(夹心法)C.直接凝集试验D.ELISA(间接法)E.免疫荧光技术考生答案：正确答案：E试题分数：1考生得分：0答案解析：免疫荧光法用荧光标记的抗体或抗原与样品中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的技术对其进行分析，是抗原定性或定位常用的方法。
4、测定HIV抗体确诊HIV感染常用的方法是1分答案不确定A.免疫印迹法B.ELISA(夹心法)C.直接凝集试验D.ELISA(间接法)E.免疫荧光技术考生答案：正确答案：A试题分数：1考生得分：0答案解析：免疫印迹法将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测，对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，是测定HIV抗体确诊HIV感染常用的方法。
5、血型鉴定常用的方法是1分答案不确定A.免疫印迹法B.ELISA(夹心法)C.直接凝集试验D.ELISA(间接法)E.免疫荧光技术考生答案：正确答案：C试题分数：1考生得分：0答案解析：直接凝集试验用已知红细胞与血浆和被测血浆与红细胞进行交叉配血试验，观察凝集反应，是血型鉴定常用的方法。
6、与免疫原混合/结合后可提高免疫应答的物质是1分答案不确定A.载体分子B.免疫佐剂C.激活剂D.催化剂E.抑制剂考生答案：正确答案：B试题分数：1考生得分：0答案解析：免疫佐剂能非特异性增强抗原的免疫原性或改变免疫反应类型使机体对该抗原的免疫应答更强烈。
体液免疫球蛋白测定
体液免疫球蛋白测定第一节血清IgG、IgA、IgM测定血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM定量测定方法一般有单向环状免疫扩散法、火箭免疫电泳法、ELlSA、免疫比浊法、放射免疫分析法等。
临床常用单向环状免疫扩散法和免疫比浊法来测定血清免疫球蛋白含量。
一、血清IgG、IgA、lgM测定（一）单向环状免疫扩散法该法的原理是将抗血清均匀地分散于琼脂或琼脂糖凝胶内，胶板上打孔，孔内注入抗原或待测血清，抗原在含有抗血清的胶内呈放射状（环状）扩散，在抗原抗体达到一定比例时形成可见的沉淀环。
在一定条件下，抗原含量越高，沉淀环越大。
（二）免疫比浊法该法具有检测范围宽、测定结果准确、精密度高、检测时间短（一般在几分钟内即可完成测试）、敏感度高、稳定性好等优点。
二、血清IgG、IgA、IgM测定的临床意义（一）年龄新生儿可由母体获得通过胎盘转移来的IgG，故血液中含量较高，接近成人水平。
（二）免疫球蛋白IgG、IgA、IgM均升高慢性肝脏疾病如慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、隐匿性肝硬化患者血清中可见3种Ig均升高。
慢性细菌感染如慢性支气管炎、肺结核，血IgG可升高。
宫内感染时脐血或出生后的新生儿血清中IgM含量可增高。
SLE患者以IgG、IgA升高较多见。
类风湿关节炎患者以IgM增高为主。
（三）单一免疫球蛋白升高主要是指患者血清中某一类免疫球蛋白含量显著增多，大多在30g／L以上，这种异常增多的免疫球蛋白其理化性质十分一致，称为单克隆蛋白（MP）即M蛋白。
此类异常增多的免疫球蛋白多无免疫活性，故又称副蛋白。
由它所致的疾病称为免疫增殖病如多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、恶性淋巴瘤、重链病、轻链病等。
（四）免疫球蛋白降低先天性低Ig血症，主要见于体液免疫缺陷病和联合免疫缺陷病。
IgA缺乏患者，易发生反复呼吸道感染。
IgG缺乏患者，易发生化脓性感染。
IgM缺乏患者，易发生革兰阴性细菌败血症。
第二节血清IgD和IgE测定正常人血清中IgD含量很低，仅占血清免疫球蛋白总量的0.2%。
第一部分免疫球蛋白测定一、IgG、IgA、IgM的测定1、单向
三、M蛋白测定：——免疫电泳
M蛋白： 浆细胞或B淋巴细胞单克隆增殖产生的结构均 一的多无活性的单克隆免疫球蛋白。 方法步骤：血清蛋白电泳加抗体于琼脂槽内扩 散、沉淀 结果判断：在α2-γ区附近形成致密弓形沉淀弧 临床意义：主要见于多发性骨髓瘤(multiple myeloma)，也可见于巨球蛋白血症 mactoglobulinemia)、恶性淋巴瘤(malignant lymphoma)和重链病
2、变应原特异性IgE检测：放射变应原吸附 试验（radioallergosorbent test,RAST) 步骤：变应原交联载体 加待检血清或正常 对照血清加 125I-抗人IgE 洗去未结合 125I-抗人IgE γ计数器测放射值 结果判定：以大于正常人3.5倍为阳性 临床意义： (1) 参见血清总IgE测定 (2) 确定变应原
散射比浊法
参考值：IgG：12.87±1.35g/L IgA：2.53±0.34g/L IgM：1.08±0.24g/L 临床意义： 1、低Ig血症： 先天性 — 体液免疫缺陷、联合免疫缺陷病 获得性 — 淋巴肉瘤、肾病综合征等 2、高Ig血症： 慢性感染、自身免疫病（类风湿性关节炎等）
二、IgE测定 1、血清总IgE测定：－ELISA法 方法：抗IgE包被反应板 IgE标准品或待 测血清 酶标记抗IgE 底物显色 测吸光度 做标准曲线求待测IgE含 量 参考值：男：631±128 IU/ml 女：337±60 IU/ml 临床意义： 含量增高：特应性皮肤病、枯草热、哮喘、 过敏性休克等
其实，世上最温暖的语言，“ 不是我爱你，而是在一起。” 所以懂得才是最美的相遇！只有彼此以诚相待，彼此尊重， 相互包容，相互懂得，才能走的更远。 相遇是缘，相守是爱。缘是多么的妙不可言，而懂得又是多么的难能可贵。否则就会错过一时，错过一世！ 择一人深爱，陪一人到老。一路相扶相持，一路心手相牵，一路笑对风雨。在平凡的世界，不求爱的轰轰烈烈；不求誓 言多么美丽；唯愿简单的相处，真心地付出，平淡地相守，才不负最美的人生；不负善良的自己。 人海茫茫，不求人人都能刻骨铭心，但求对人对己问心无愧，无怨无悔足矣。大千世界，与万千人中遇见，只是相识的 开始，只有彼此真心付出，以心交心，以情换情，相知相惜，才能相伴美好的一生，一路同行。 然而，生活不仅是诗和远方，更要面对现实。如果曾经的拥有，不能天长地久，那么就要学会华丽地转身，学会忘记。 忘记该忘记的人，忘记该忘记的事儿，忘记苦乐年华的悲喜交集。 人有悲欢离合，月有阴晴圆缺。对于离开的人，不必折磨自己脆弱的生命，虚度了美好的朝夕；不必让心灵痛苦不堪， 弄丢了快乐的自己。擦汗眼泪，告诉自己，日子还得继续，谁都不是谁的唯一，相信最美的风景一直在路上。 人生，就是一场修行。你路过我，我忘记你；你有情，他无意。谁都希望在正确的时间遇见对的人，然而事与愿违时， 你越渴望的东西，也许越是无情无义地弃你而去。所以美好的愿望，就会像肥皂泡一样破灭，只能在错误的时间遇到错的人。 岁月匆匆像一阵风，有多少故事留下感动。愿曾经的相遇，无论是锦上添花，还是追悔莫及；无论是青涩年华的懵懂赏 识，还是成长岁月无法躲避的经历……愿曾经的过往，依然如花芬芳四溢，永远无悔岁月赐予的美好相遇。 其实，人生之路的每一段相遇，都是一笔财富，尤其亲情、友情和爱情。在漫长的旅途上，他们都会丰富你的生命，使 你的生命更充实，更真实；丰盈你的内心，使你的内心更慈悲，更善良。所以生活的美好，缘于一颗善良的心，愿我们都能 善待自己和他人。 一路走来，愿相亲相爱的人，相濡以沫，同甘共苦，百年好合。愿有情有意的人，不离不弃，相惜相守，共度人生的每 一个朝夕……直到老得哪也去不了，依然是彼此手心里的宝，感恩一路有你！
单向扩散试验实验报告
一、实验名称单向扩散试验二、实验目的1. 了解单向扩散试验的原理和操作方法。
2. 掌握实验操作技巧，提高实验操作能力。
3. 分析扩散速率和扩散系数等数据。
4. 探究单向扩散试验在实际应用中的作用和意义。
三、实验原理单向扩散试验是一种利用抗原抗体特异性结合原理，通过观察抗原在琼脂凝胶中的扩散情况，以定量测定抗原浓度的方法。
实验中，将抗体加入琼脂凝胶制成免疫琼脂板，打孔后加入待测抗原，抗原在琼脂凝胶中向四周扩散，当抗原与抗体比例适宜时，在两者相遇处形成白色沉淀环。
沉淀环直径与抗原浓度成正比。
四、实验器材与试剂1. 试剂：- 羊抗人IgG血清（兔抗人血清）- 标准参考血清（标准IgG质控物）- 待检人血清（IgG-抗原）- pH7.4 0.01M PBS缓冲液（或NS）- 琼脂粉（制备1%免疫盐水琼脂液）2. 器材：- 载玻片- 打孔器- 37℃恒温箱- 湿盒- 可调微量加样器五、实验步骤1. 制备抗体琼脂板：将琼脂粉与pH7.4 0.01M PBS缓冲液混合，加热熔化，加入羊抗人IgG血清，搅拌均匀后，倒入载玻片制成琼脂板。
2. 打孔：用打孔器在琼脂板上打孔，孔间距为5毫米。
3. 加样：用微量加样器将标准参考血清和待检人血清分别加入中央孔和周围孔中。
4. 置于湿盒中：将加样后的琼脂板放入湿盒中，置于37℃恒温箱中扩散24~48小时。
5. 观察结果：观察琼脂板上的沉淀环直径，分析抗原浓度。
六、结果与分析1. 标准曲线绘制：以标准参考血清的浓度为横坐标，对应的沉淀环直径为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 待检血清抗原浓度测定：将待检血清的沉淀环直径代入标准曲线，求出待检血清的抗原浓度。
3. 结果分析：根据实验结果，分析待检血清中抗原浓度与临床诊断的相关性。
七、结论本实验通过单向扩散试验成功测定了待检血清中抗原浓度，验证了实验原理和操作方法。
实验结果表明，单向扩散试验具有较高的灵敏度和特异性，适用于临床检测和科研工作。
单相琼脂扩散试验
单相琼脂扩散试验
单相琼脂扩散试验介绍：
单向琼脂扩散试验是一种常用的定量检测抗原的方法。
将适量抗体与琼脂混匀，浇注成板，凝固后，在板上打孔，孔中加入抗原，抗原就会向孔的四周扩散，边扩散边与琼脂中的抗体结合。
一定时间后，在两者比例适当处形成白色沉淀环。
沉淀环的直径与抗原的浓度成正比。
如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则从曲线中可求出标本中抗原的含量。
本试验主要用于检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏感性很高。
单相琼脂扩散试验正常值：
检查结果呈阴性
单相琼脂扩散试验临床意义：
异常结果：利用单相免疫扩散法可检测C3的含量，其含量的变化对某些疾病的诊断、预后等有所帮助，如免疫复合物性疾病、急性肾炎、肝炎等。
需要检查的人群：可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA 及IgM的水平。
老年人和新生儿均需要检查。
单相琼脂扩散试验注意事项：
不合宜人群：无特殊要求。
检查前禁忌：禁忌暴饮暴食和剧烈运动。
特别是饮食刺激性食物，如酒。
检查时要求：空腹抽血检测。
单相琼脂扩散试验检查过程：
在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。
同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标本的抗原浓度(mg/ml 或U/ml)。
免疫球蛋白定量的测定方法
免疫球蛋白定量的测定方法
免疫球蛋白定量的测定方法，这可真是个超级重要的事儿啊！你知道吗，就好像我们要了解一个神秘宝库里面到底有多少宝贝一样。
先来说说单向免疫扩散法吧，这就像是在一个大平地上，让免疫球蛋白和特定的抗体慢慢扩散开来，然后形成一个个独特的沉淀环，通过测量这些沉淀环的大小，不就能知道免疫球蛋白的量了嘛！是不是很神奇？
还有免疫比浊法，哇哦，这就好像是一场激烈的比赛！让免疫球蛋白和抗体在特殊的环境里“较量”一番，然后通过观察溶液的浑浊程度来判断免疫球蛋白的多少，这多有意思呀！
还有呢，酶联免疫吸附测定法，这简直就是一个精心设计的实验舞台呀！把免疫球蛋白和各种试剂放在一起，通过一系列反应，最后用特殊的方法检测出结果，就像是一场精彩的魔术表演，最后谜底揭晓，我们就知道免疫球蛋白的量啦！
放射免疫测定法也不能落下呀！就如同能看到微观世界的神奇眼睛，利用放射性物质来精确测量免疫球蛋白的量，这是多么高妙的手段呀！
这些方法各有各的特点，各有各的厉害之处，不是吗？它们就像一群各具本领的超级英雄，为了我们的健康而战斗！我们能不好好了解它们吗？免疫球蛋白定量的测定方法真的是太重要了，它们是医学领域的得力助手，帮助医生们更准确地了解病情，为患者提供更好的治疗方案。
我们应该对这些方法充满敬意和感激，它们是守护我们健康的无声卫士啊！。
免疫扩散技术——IgG测定
扩散
• 将加样完毕的凝胶板放入湿盒 • 37 ℃，扩散24小时
结果判读
• 准确测量S1 -S5沉淀环的直径（单位： mm）
• 以沉淀环直径与相应标准品浓度在 半对数纸上绘制标准曲线。
• 准确测量待测样品的沉淀环的直径， 在标准曲线上查出待测样本中IgG的 浓度。
注意事项
倒板： 1. 严格控制加入诊断血清时的温度：56 ℃
• 但是，该方法灵敏度较低，观察结 果需时间较长，每次测定需同时做 标准曲线。
胶乳凝集试验——RF测定
实验原理
以聚苯乙烯胶乳颗粒为载体的间接凝集试验： 聚苯乙烯颗粒具有很强的吸附蛋白质的能
力，借此将抗原或抗体与胶乳颗粒结合成致 敏颗粒，直接与待测标本中的抗体或抗原发 生凝集反应。
RF为抗变性IgG的抗体，因此 本实验使用的是人IgG致敏的聚 苯乙烯颗粒。
结果判断
• 胶乳颗粒凝集且液体澄清者为阳性， 胶乳颗粒不凝集仍保持均匀胶乳状者为阴性；
• 首先观察阳性血清和阴性血清的反应结果， 若前者为阳性反应后者为阴性反应，说明试 剂有效；
• 然后再观察待测样品的反应情况，并判断阴 阳性。
方法学评价
• 该试验方法简单、快速、特异性强、 结果清晰易观察判断。
• 观察时应注意排除非特异性凝集反 应。
• 如何进行半定量分析？
CIC测定
实验原理： PEG沉淀法
聚乙二醇（PEG），分子量 6000，具有较强的脱水作用，可引 起蛋白质沉淀，沉淀具有选择性且对 蛋白质生物活性无影响。是免疫浊度 测定技术中常用的增浊剂。
• PEG沉淀蛋白质的选择性与其浓度相关： 2%PEG只能沉淀大分子， 4%PEG能沉淀较小分子的循环免疫复合物 大于5%PEG，选择性沉淀特性消失。
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免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的定量检测—单向琼脂扩散法
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送检日期年月日
【方法选择】
表13-2 免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的定量检测
方法单向琼脂扩散法火箭免疫电泳速率散射比浊法ELISA 放射免疫分析法本次检查选择√
以检测待检人血清IgG为例。
【材料准备】
1.抗原：待检人血清、IgG免疫球蛋白工作标准品（IgG含量为10mg/ml）。
2.抗体：羊抗人IgG抗血清（单扩效价1：100）。
琼脂糖或琼脂粉、生理盐水、NaN3，载玻片、微量加样器、打孔器、5ml吸管、吸耳球、三角烧瓶、湿盒、水浴箱、温箱、半对数坐标纸。
【操作方法】
将1.0%～1.5%琼脂（用PH8.2、0.05M的巴比妥缓冲液配成）加热溶化，加0.01%（0.1g/L）NaN3，置于56℃水浴中备用。
吸取99ml已经融化的琼脂于三角烧瓶中，置于56℃水浴中，将预温的羊抗人IgG抗血清1ml与琼脂充分混合，继续保温于56℃水浴中备用。