抗生素微生物检定管碟法在中国药典2005版的应用及操作要点
2005版《中国药典》微生物限度检查修订内容
试验- 次数 供试品浓度
1
1:10
2
1:10
3
1:10
回收率%
试验组
稀释剂对照组
48.1
96.3
43.0
97.5
52.5
94.9
50
银翘解毒片-枯草杆菌(低速离心+稀释法)
试验- 次数 供试品浓度
1
1:10
2
1:10
3
1:10
回收率%
试验组
稀释剂对照组
72.2
97.2
78.5
96.4
75.0
97.5
法的验证”。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基
或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板
上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。
27
菌数报告规则：以相当于1g或1ml供试品的菌落 数报告；若滤膜上无菌落生长，以＜1报告菌数 （每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或乘以稀释 倍数的值报告菌数。
18
●细菌培养温度:30～35℃。 ●霉菌、酵母菌培养温度:23（25）～
28℃。 控制菌培养温度:35～37℃ ●结果报告：以1g、1ml、10g、10ml 或
10cm2 为单位报告。
19
（2）检验量
● 抽样量 ：随机抽取不少于检验量（两个 以上最小包装单位）的3倍。
● 检验量：一次试验所用的供试品的量。 一般为10g或10ml；中药膜剂50 cm2， 化学药膜剂为100cm2；贵重或微量包 装的药品酌减（不得少于3g）。
微生物限度检查：丸剂、颗粒剂、片剂、锭剂、煎膏 剂、胶剂、糖浆剂、合剂、滴丸剂、胶囊剂、酒剂、 酊剂、流浸膏剂、浸膏剂、露剂、茶剂、栓剂、贴膏 剂(贴剂)、凝胶剂、搽剂、洗剂、涂膜剂.
抗生素微生物检定方法学验证中的常见问题分析
发布日20070423期栏目化药药物评价>>化药质量控制标题抗生素微生物检定方法学验证中的常见问题分析作者审评三部部门正文容审评三部审评五室英摘要：本文对抗生素微生物检定法中的管碟法在方法学验证中的常见问题如线性与围中溶液浓度与直径的关系、精密度的测定方法等进行了分析，归纳其错误的问题，给出了正确的操作方法。
关键词：抗生素微生物检定法多组分抗生素方法学验证抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生素测定方法。
自20世纪40年代建立至今，在各国药典中被普遍采用。
虽然伴随着HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品种的效价已被化学分析法所取代，但由于①微生物检定法可直观、特异地反映出抗生素品种的抗菌活性；②多组分抗生素由于结构与不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、含量和生物活性间的关系；③许多抗生素品种由于各种原因如无特征紫外吸收等，目前没有适当的化学分析方法表征其活性，故抗生素微生物检定法目前在各国药典中仍占有重要的地位，且短期化学分析法不可能完全取代微生物检定法。
中国药典2005年版仍采用抗生素微生物检定法中的管碟法测定其效价，目前申报已有国家标准的该类制剂较多，在质量研究中存在诸多问题，现就常见的问题加以分析，希望对注册申请人有所帮助。
一、方法的建立1、供试品与标准品的同质性抗生素微生物检定法的原理以供试品与标准品同质为前提，方法建立前，首先应确定供试品与标准品是否同质，包括化学结构、所含组分及组分比例的一致性，对于制剂还要考虑辅料的影响是否造成供试品与标准品不同质。
2、培养基、试验菌、缓冲液和培养条件的选择可参照中国药典建立，在此不再赘述。
3、检定方法的确定可采用一剂量法（标准曲线法）、二剂量法及三剂量法等。
一般确定线性与围采用一剂量法（标准曲线法），常规含量测定采用二剂量法，标准品标定采用三剂量法。
4、抗生素溶液的稳定性选定的品种可参照中国药典现行版附录抗生素微生物检定法的品种，若溶剂和缓冲液与其不同，应考察抗生素储备溶液和测定溶液在室温、40℃和不同pH值缓冲液中，以及放置不同时间的稳定性，以确定抗生素储备溶液和测定溶液的存放时间和条件。
抗生素微生物检定管碟法在中国药典中的应用及操作要点
抗生素微生物检定管碟法在中国药典中的应用及操作要点录入时间:2010-11-18 10:29:10 来源：青岛海博抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。
各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。
管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。
管碟法的操作步骤：1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。
2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。
4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。
5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。
6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。
7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。
管碟法对抗生素药品效价的微生物检定
第9卷第3期延安大学学报（医学科学版）Vol.9No.3 2011年9月Journal of Yanan University（Med Sci）Sep.2011管碟法对抗生素药品效价的微生物检定王新霞1，宋雪玲2（1.延安大学附属医院；2.延安市药品检验所，陕西延安716000）摘要：目的减少实验过程中外界因素与人为因素给试验带来的误差，提高管碟法测定抗生素效价的准确性。
方法按药典操作步骤逐步分析，规范操作，并提出合理的解决方案。
结果得到清晰、圆整的抑菌圈。
结论可以提高测定结果的准确性。
关键词：抗生素效价；生物检定法—管碟法；抑菌圈中图分类号：R917文献标识码：A文章编号：1672－2639（2011）03－0058－01抗生素是医疗上广泛使用的药品［1］。
由于抗生素药品的医疗作用主要是它的抗菌效力，利用抗生素对细菌（霉菌）的杀死或抑制的程度，作为客观指标来衡量抗生素的效力。
根据此原理，设定了抗生素效价的生物检定法—管碟法。
1基本原理管碟法是利用抗生素在琼脂培养内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
管碟法的特点是灵敏度高，能直接显示抗生素的抗菌效价，但操作步骤多，试验过程长。
影响试验结果的因素较多，需要从各个环节加以严格控制试验条件。
本文就对试验中各项影响因素的控制加以讨论。
2影响因素2.1抑菌圈圈正的控制在某些情况下，抑菌圈出现破裂，呈椭圆形，卵圆形等不正常形状，其原因［2］可能如下：（1）在滴加抗生素溶液至小管时，抗生素溶液从小管口或毛细滴管口溅出落在琼脂培养基表面上。
防止方法：毛细滴管内不得有气泡，毛细滴管口避免太细，毛细滴管离小管口距离不要太高，适当调节，使液滴下滴时不致溅出。
（2）小管两端面不够平，使抗生素溶液漏出，破坏了均匀扩散现象。
必须使用加工相同的小钢管。
如都用二端面平面的，或都使用二端面圆的。
（3）玻璃双碟、小钢管、钢管放置器被微量抗生素（或其他杀菌剂）污染，使抑菌圈破裂。
中国药典2005版收载的抗生素品种特点和新技术新方法的应用
中国药典2005版收载的抗生素品种特点和新技术新方法的应用【摘要】本文对中国药典2005版收载的抗生素品种与中国药典2000版进行了比较，并对这些抗生素品种的特点及采用的新技术、新方法进行了初步的归纳总结。
中国药典2005版（以下简称CP2005）于2005年7月1日正式执行，这版药典总的来说在品种的收载情况和对已有品种的技术要求方面，均较CP2000有了较大的变化。
下面笔者通过资料的收集、比较，对CP2000、CP2005收载的抗生素在品种收载情况及新技术的应用情况作一小结。
1、CP2005抗生素收载品种的主要变化CP2005新增加76个抗生素品种及制剂，其中18个为喹诺酮类抗生素。
具体为：甲磺酸培氟沙星（原料、片剂、胶囊、注射液、粉针），氟罗沙星（原料、片剂、胶囊），氧氟沙星（胶囊、眼膏、滴眼剂、滴耳剂），环丙沙星，依诺沙星，诺氟沙星乳膏，司帕沙星（原料，片剂，胶囊），头孢地尼（原料、胶囊），头孢替唑钠（原料、粉针），头孢硫醚（原料、粉针），吉他霉素（原料、片剂），麦白霉素（原料、片剂），硫酸小诺霉素（原料、片剂、注射液、口服溶液），硫酸依替米星（原料、注射液、粉针），更昔洛韦（原料、粉针、注射液），利巴韦林（口服溶液、含片、胶囊、片剂、粉针、注射剂），阿昔洛韦（片剂、胶囊、乳膏、咀嚼片、颗粒剂、滴眼剂、粉针），泛昔洛韦（原料、片剂、胶囊），伐昔洛韦（原料、片剂、胶囊），阿奇霉素（分散片、颗粒），罗红霉素（分散片、干混悬剂），琥乙红霉素（分散片、胶囊），克拉霉素（颗粒），盐酸米诺环素（原料、片剂、胶囊），盐酸柔红霉素（原料、粉针），卞星青霉素（原料），青霉素V钾（胶囊），美罗培南（原料、粉针），替硝唑（原料、胶囊、注射液），氟康唑（片剂），穿琥宁（原料、粉针），硫酸多粘菌素B（原料、粉针）。
从收载的品种和剂型看，基本体现出这几年抗生素申报情况。
例如，这几年申报量较大的品种有：甲磺酸培氟沙星、头孢地尼、更昔洛韦、阿昔洛韦、泛昔洛韦、伐昔洛韦、阿奇霉素、盐酸米诺环素、穿琥宁等。
05版微生物限度检查法
验证用菌株及菌液的制备
菌株 大肠埃希菌CMCC（B）44102、金黄色葡萄 球菌CMCC（B）26003、 枯草芽孢杆菌、CMCC （B）63501白色念株菌CMCC (F) 98001、 黑曲霉 菌CMCC(F)98003 。 菌液制备 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢 杆菌接种营养肉汤，白色念株菌接种真菌培养基、 黑曲霉接种真菌培养基斜面，置规定温度、时间， 培养。取培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成1ml 含50~100cfu的菌液。
灭菌和培养温度
●培养基、稀释剂、实验器具等的灭菌，按灭菌 法（见附录 XVII ）的要求采用验证合格的灭菌程 序灭菌。 培养温度 细菌和控制菌的培养温度未改动。霉 菌和酵母菌的培养温度20~25℃ 改为 23~28℃。
检验量
一般随机抽样不少于检验用量（2个以上最小包装） 的3倍量。 ●检验量 指供试品一次检验的用量。一般为10g或 10ml；化学药膜剂为100cm2；贵重或微量包装的 药品可酌减（不得少于3g）。检查沙门菌的供试品 其检验量增加10g或10ml。
控制菌检查
1.方法的验证 对供试品进行控制菌检查时，应对检查法的科 学、准确性进行验证，以确认所采用的方法是否 适合该药品的控制菌检查。若药品的组分或原法 的检验条件有改变可能影响检验结果的准确性， 检查法应重新验证。 验证时按各品种项下微生物限度规定控制菌选 择相应菌株验证，验证大肠菌群检查法时，应用 大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的 制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。
菌株 大肠埃希菌CMCC（B）44102 、金黄色葡萄球菌 CMCC （ B ） 26003 、 乙 型 副 伤 寒 沙 门 菌 CMCC （ B ） 50094 、 铜 绿 假 单 胞 菌 CMCC （ B ） 10104 、 生 孢 梭 菌 CMCC（B） 64941。
《中华人民共和国药典》2005年版附录-抗生素微生物检定法
Ⅱ-ⅪA抗生素微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效性）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
第一法：管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
菌悬液的制备枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液：取枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。
用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）悬液：取短小芽孢杆菌［CMCC（B）63202］的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液：取金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
临用时，用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液：取藤黄微球菌［CMCC（B）28001］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面，用培养基Ⅲ或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
大肠杆菌（Escherichia coli）悬液：取大肠杆菌［CMCC（B）44103］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。
啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）悬液：取啤酒酵母菌（ATCC 9763）的V号培养基琼脂斜面培养物，接种于Ⅳ号培养基琼脂斜面上。
抗生素微生物检定法的增修订内容及操作要点
该方程奠定了管碟法量－反应直线公式 的基础。
将上述公式简化、移行，并将自然对数 转换为常用对数得：
lg M 1 r 2 lg C'4DTH
9.21DT
上述公式表明，抗生素总量的对数(lgM) 与所形成的抑菌圈半径的平方(r2)呈直 线关系，即通过抑菌圈的大小来测定抗 生素抗菌活性物质的量。
抗生素微生物检定法的增修订 内容及操作要点
抗生素微生物检定法
1．抗生素微生物检定法的概况 2．微生物效价测定法国内外药典的比较 3．微生物效价测定法的操作要点 4．微生物效价检定法的建立和方法学验 证
1．抗生素微生物检定法的概 况
1．1．定义 抗生素圈边缘清晰度是影响测定结果的重要因素之一， 导致抑菌圈边缘不清晰的原因如下：
➢ 在抑菌圈形成过程中抗生素的扩散系数紊乱、不均 一，不符合动力学公式中各项之间的关系或各扩散 系统交叉所致。
（4）化学稳定性较差的抗生素，由于降解导致供 试品与标准品不同质。
（5）操作上可能引入的误差。
3.1.2.2．抑菌圈质量的控制
（1） 抑菌圈的形状：
实验中抑菌圈常有圈破裂、不圆、甚至无圈的现 象，其原因是多方面的:
➢ 在滴加抗生素溶液时药液溅出、毛细滴管碰到钢 管壁使抗生素溶液漏出，出现不圆等；
➢ 操作中若各钢管中加液时间不同，可影响抑菌 圈的大小，所以一组双碟加样时，应尽量缩短 加样间隔时间，并保持加样速度的均匀性，以 减少误差。
➢ 抑菌圈的大小还受抗生素扩散系数的影响，若 在缓冲液中加入0.3%的氯化钠或在培养基中加 一定量的盐或吐温，可增加抗生素的扩散能力， 使抑菌圈增大。
（3） 抑菌圈边缘清晰度的控制
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抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。
各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。
管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。
管碟法的操作步骤：1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。
2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。
4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。
5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。
6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。
7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。
8、抑菌圈的测量：抑菌圈测量仪的使用，每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。
手工测量：游标卡尺9、结果的可靠性检验及效价测定：抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结果。
操作要点第一步一般应制成500或1000单位/毫升的溶液，以后逐步稀释至供试浓度的溶液，稀释步骤应为3～4步。
溶解：对于需用乙醇溶解的样品，由于溶解样品时所用乙醇量较大，加灭菌水后溶液放热，因此需充分摇匀后加灭菌水至接近容量瓶刻度，待冷至室温后再稀释至刻度。
标准品溶液与供试品溶液浓度的比值D应控制在±5%以内，以保证两者浓度的偏差在一定范围内。
试验菌的菌龄对抑菌圈有一定影响。
故检定时应保持菌种及菌液的新鲜。
一般菌种一月转种一次，冰箱冷藏保存。
对易变异的菌株，如藤黄微球菌等在制备菌悬液前进行单菌分离；其他菌株可半年分离一次。
试验菌传代最好不超过5次，以防止菌种老化变异。
芽孢杆菌培养物用灭菌水洗下后，应在65℃加热30分钟，使菌体的菌龄一致，用革兰氏染色，应有芽孢85%以上。
加入菌悬液的体积，一般不少于0.3ml，并且不大于上层培养基体积的2%。
如果加入菌悬液的体积过小，则在同次实验中，不同次加入菌悬液的体积相差较大，造成实验误差；如果加入菌悬液的体积过大，则会使上层培养基变稀，并且因菌悬液的温度较低，加至培养基中可能造成培养基结块，影响测定结果。
对于加入菌悬液体积的控制，可通过调节菌悬液的浓度来实现。
在制备菌层培养基时，将菌液加入菌层培养基后，立即充分摇匀，但应避免产生气泡。
加入芽孢悬液时，菌层培养基的温度为65℃，对非芽孢悬液时，菌层培养基的温度一般为48～50℃。
放置孵箱培养时排放应不得超过三层，避免因培养温度不均匀而导致各双碟中抑菌圈大小不一。
抗生素原料药：不含辅料的药物制剂原料，一般其效价以纯度（u/mg或µg/mg）表示。
检验时，可参考该品种的药品标准纯度限度规定或厂方提供的纯度估计效价，取样试验，如估计效价与实际效价相差较远时，即测定所得效价超出估计效价的±10%时，则重新估计效价，再做准确测定。
粉针剂：指注射用无菌粉末或冻干品，用西林瓶橡胶塞铝盖封装或熔封在安瓶内，一般测定其纯度（u/mg或µg/mg）或整瓶效价。
取装量差异项下的内容物，称取适量（50mg以上，根据标示量及平均装量折算估计效价，并按估计效价及量瓶体积计算取样量），置量瓶中，加标准中规定的溶剂溶解，稀释，测定，计算出1mg的效价单位数，再根据平均装量及标示量计算平均每瓶的百分含量。
水针剂（注射液）：即抗生素的灭菌水溶液，标示量一般按每毫升含效价单位计。
效价测定时，量取平均装量项下的内容物或5～10支的内容物，混匀，用干燥的刻度吸管吸取一定量的供试品，将吸管外壁用滤纸拭净，再弃去多余的溶液，使供试品至吸管刻度，沿量瓶颈部内壁缓缓流入已盛有一定量溶剂（以免抗生素结晶析出）的量瓶内，混匀，继续加溶剂至刻度，摇匀，再量取适量稀释至规定的浓度。
素片、薄膜衣片：称取20片的总量，求出平均片重，研细混匀后，精密称取适量（约相当于1片的重量或根据标示量按平均片重及所用量瓶体积折算取样量），置量瓶中，用标准中规定的溶剂溶解，并稀释至刻度，摇匀。
再量取适量稀释至规定浓度。
注意点：研磨时应注意环境干燥，可在干燥操作柜内操作，研磨要迅速，避免吸湿，因片剂内含辅料较多，辅料可能漂浮于溶液表面，稀释时量取供试溶液应读取辅料下层的溶液切面；如沉淀较多，须待其下沉后再量取上层液；有些辅料吸附抗生素，应加以注意。
为节约供试品，可与重量差异检查结合进行。
糖衣片、肠溶片：取标准中规定的片数，置于乳钵中，研细，分次加入规定的溶剂，研磨使其溶解，将研磨液转移至瓶口放有小漏斗的量瓶中，量瓶体积根据供试品标示量、所取片数及抗生素储备液浓度（一般为1000单位/ml）选定，用规定溶剂稀释至刻度，摇匀，静置，使辅料下沉而抗生素已溶解在溶液内，精密吸取量瓶中的上层液适量，作进一步稀释。
个别品种标准如同时收载了糖衣片和薄膜衣片，可能规定薄膜衣片也取整片制备供试溶液。
胶囊剂：取装量差异项下的内容物，混合均匀，研细，根据平均装量，精密称取约相当于1粒胶囊的量或按标示量、量瓶体积及抗生素储备液浓度等计算的取样量，置于量瓶中，加规定的溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，如供试品含有较多的辅料，则照片剂项下的方法进行。
颗粒剂、干混悬剂：取装量差异项下的内容物，混匀，根据平均装量，精密称取约相当于1袋（包）的量或按标示量、量瓶体积及抗生素储备液浓度等计算的取样量，置于量瓶中，加规定的溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
量取适量稀释制成供试品溶液。
测得效价后，再根据装量差异项下的平均装量，计算出平均每袋（包）的效价，根据标示量即可算出含量。
软膏剂、眼膏剂：擦净软膏剂或眼膏剂软管的外壁，切开封口，置于干燥器内约1小时，取干燥的洁净分液漏斗，带手套操作，将膏剂软管连同内容物在天平上称重，取出，将内容物挤入分液漏斗，量约2g，再称取膏剂软管的重量，按减重法以前后称量之差计算分液漏斗内膏剂供试品的量，以不含过氧化物的乙醚或石油醚等作溶剂溶解基质，但基质中的抗生素则应不溶于或几乎不溶于该有机溶剂中，以避免提取过程中抗生素的损失。
按标准中的规定加提取溶剂至分液漏斗中，振摇，使基质溶解，用规定的缓冲溶液提取抗生素至水相中，用缓冲溶液提取3次，合并3次的提取液，置量瓶中，加缓冲溶液至刻度，依法操作，计算效价。
实验要点磷霉素钠，磷霉素钙，磷霉素氨丁三醇主要问题：抑菌圈偏小解决：1. pH9.0抗Ⅱ号培养基（pH7.8～8.0）2. 滴加药液后，室温放置1小时后，放入孵箱内培养。
3. 培养时间以24小时为宜，培养时间短，抑菌圈清晰度不好，培养24h后如抑菌圈仍不清晰，应室温放置一段时间待清晰后再测量。
啤酒酵母菌的培养主要问题：生长不良CP2005：抗Ⅴ号琼脂斜面及抗Ⅳ琼脂斜面解决：1. 采用沙氏或YPD酵母菌培养基；2. 32～35℃培养24小时沙氏培养基蛋白胨10g 葡萄糖40g琼脂13g 水1000ml调节灭菌后pH5.4～5.8YPD培养基蛋白胨10g 葡萄糖40g酵母粉5g 琼脂13g水1000ml管碟法特点：优点：基本操作和设计适用于各种抗生素，试验结果较稳定；样品用量少，灵敏度高；适合于大批样品的测定。
缺点:凡具有抗菌活性的物质都会干扰测定结果；试验过程长，需第二天才有结果；操作手工化，需熟练人员才能得到较正确的结果；受扩散因素的影响，如培养基原材料的质量，一般琼脂中的杂质可能影响扩散速度及效价强度。
管碟法抗生素效价测量管碟法抗生素效价测量 - 简介抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。
管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。
管碟法抗生素效价测量 - 原理当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。
因此，当抗生素浓度达到或高于 MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。
根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。
北京潮声公司具有同行业的领先水平。
在管碟法抗生素效价测量实验中需要注意的影响因素分析及对策如下：管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法【1】，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。
但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。
根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。
管碟法抗生素效价测量 - 实验1. 实验器材的准备1.1 实验器材的选择试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。
可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。
小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。
如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。
1.2 实验器材的清洗抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。
由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素（庆大霉素、争光霉素、链霉素等）或者被清洗用的杀菌剂（如新洁而灭、洗洁精、去污粉等）污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。
因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。
160℃干热灭菌2h 后备用。
2. 配制试验所需的样品、标准品、缓冲液与培养基2.1 样品与标准品溶液的配制标准品与样品从冰箱取出后，使与室温平衡。