生理指标的测定-SOD-MDA-CAT-POD-叶绿素
抗氧化酶SOD、POD、CAT活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化复原法）1、试剂的配制1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml，B母液(NaH2PO4)21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
参照文件：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育第一版社，2000：267～268。
2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。
（3）30μMEDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。
（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保留。
5）2.25mM氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840gNBT用PBS定容至100ml，避光保留。
酶液制备：取0.2g（可视状况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml50mmol/L 预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。
2、酶活性测定1）反响混淆液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混淆后摇匀；（2）分别取3ml反响混淆液和30μl酶液于试管中光照下反响（3）将试管置于光照培育箱中在4000lux20min；同时做两支比较管，此中后测定作为最大光复原管，1支试管取3ml反响混淆液加入30μlPBS（不加酶液）照光另1支只加缓冲液置于暗中测准时用于调零。
SOD、POD、CAT、MDA和可溶性蛋白的测定方法
棉花叶片和根系中SOD、POD、CAT、MDA的测定研究表明逆境胁迫可使植物体内活性氧的产生和消除平衡失调，造成植物体内大量的自由基累计，进而膜脂结构的损伤和加速植物的衰老进程。
测定植物体内膜脂过氧化产物MDA的含量及植物体内抗氧化酶SOD、POD的活性高低，可在一定程度上反映逆境对植物的损害程度合作植物的衰老进程。
关于干旱、渍水、盐害和高温等逆境胁迫对作物候期衰老的影响的研究已有不少报道，但是在不同根土空间对作物衰老方面的研究尚不多见。
张永清等研究表明高粱在不同根土空间下，根土空间缩写降低了SOD、POD的含量，而对于不同配置及水分条件下棉花根系及地上部生理活性的研究较少因此探讨不同根系空间条件下对棉花根系生理特性、棉花后期衰老的影响。
测定部位：地上部：倒四叶地下部：上层（0-20cm）中层（20-40cm）下层（40-80 cm）根样一磷酸缓冲液的配制：A液：0.2M的KH2PO4溶液称取分析纯KH2PO427.216克，用蒸馏水定容至1000毫升。
B液：0.2M的K2HPO4溶液称取分析纯K2HPO4•3H2O45.644克，用蒸馏水定容至1000毫升。
或（A液：0.2M的NaH2PO4溶液称取分析纯NaH2PO4•2H2O 31.21克，用蒸馏水定容至1000毫升。
B液：0.2M的Na2HPO4溶液称取分析纯Na2HPO4•12H2O 71.64克，用蒸馏水定容至1000毫升。
）二、酶液的制备：称取0.5g放入研钵中，加5毫升PH=7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆倒入离心管中，冷冻离心20分钟（10000转/分钟），上清液（酶液）倒入试管中，置于0~40C下保存待用。
SOD（超氧化物歧化酶）的测定：1.SOD反应液的配制：母液的配制：（1）0.05M 磷酸缓冲液（PH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml;(2) 130mM Met(甲硫氨酸)：取1.9399克Met 用磷酸缓冲液定容至100ml；（3）750μM四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml；(4) 100μM EDTA-Na2: 取0.0372g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml，避光保存；(5) 20μM FD (核黄素): 0.00753gFD用磷酸缓冲液定容至1000ml。
植物生理学中各项生理指标的测定方法
植物生理学中各项生理指标的测定方法一.实验内容实验1MDA(丙二醛)含量测定所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯）0.25%硫代巴妥酸(纯)实验2：可溶性蛋白含量测定所需试剂：考马斯亮蓝G-25095%乙醇85%磷酸实验3：SOD(超氧化物歧化酶)酶活性测定所需试剂：dl-甲硫氨酸（Met）NBTEDTA-Na2核黄素实验4：CAT(过氧化氢酶)活性（过氧化氢酶）测定所需试剂：PBS（PH=7.0）30%H2O2实验五：Ap某(抗坏血酸过氧化物酶)活性（即ASA—POD活性）测定所需试剂：ASA（分子量167.12）(乙=胺四乙酸=钠)EDTA—Na2PBS(pH7.0)30%H2O实验6：ASA(维生素C)含量测定偏磷酸95%乙醇磷酸4%2,2-二联吡啶FeCl3（或FeCl3·6H2O）实验7：GSH(谷胱甘肽,媚力肽GSHGSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物)含量测定所需试剂：NaH2PO4·2H2ODTNB（二硫代硝基苯甲酸）PBS(PH6.8)实验8：脯氨酸测定所需试剂：磺基水杨酸甲苯茚三酮冰乙酸85%磷酸试验9：叶绿素含量测定。
80%丙酮试验9：GR活性测定试验10：过氧化氢含量测定。
三氯乙酸试验11：超氧阴离子含量测定二．酶液和母液提取1.酶液提取所需试剂：50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）(内含1%(m/v)聚乙烯吡哆烷酮PVP），0.1mmol/LEDTANa2或EDTA)，也可为（内含2%(m/v)PVP），0.2mmol/LEDTANa2或EDTA）（先配制后用缓冲液定容）2.ASA.GSH母液提取所需试剂：5%偏磷酸1．抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CAT）：1g（根据样品的量,少的可以适当减少）叶片加入预冷5ml.50mmol/L 磷酸缓冲液（PH=7.8）↓4℃冷冻15000g离心20分钟↓上清液即为酶液（5℃下保存一两天内备用，中短期用-20℃保存）2．ASA.GSH母液提取：0.1g叶片加入3ml预冷5%偏磷酸溶液↓4℃冷冻14000g离心10分钟↓上清液即为母液（5℃下保存备用）（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护ASA）酶液提取所需试剂：PVP（聚乙烯吡哆烷酮）：1%（1g溶于100ml水），1000ml需称取10g，此处用PBSEDTA-Na2:0.1mmol/L(37.2mgEDTA-Na2溶于1000ml蒸馏水)，此处用PBSPBS（缓冲液）配制方法：①Na2HPO4·12H2O②NaH2PO4·2H2O取①71.64g，蒸馏水定容至1L，取②31.21g定容至1L，放置4℃冰箱备用PH=7.8取①91.5ml+②8.5ml=100ml(浓度0.2mol/L)需要0.05mol/L→将上述溶液烯释至400ml（0.2mol/L某0.1=0.05mol/L某V）母液提取所需试剂：5%偏磷酸：称5g纯偏磷酸，定容至100ml蒸馏水（需加热溶解，温度在50-60℃）偏磷酸有剧毒（偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容）（现所用为38%HPO3，所以需称65.7895g，定容至500ml）三．实验步骤实验1：MDA含量测定1.1所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯）称10g定容至100ml0.25%硫代巴妥酸(纯)称0.25g用10%TCA定容至100ml（配制时，可一次完成，先配TCA，不要定容，再加入硫代巴比妥酸，然后定容，若难溶解，可以在磁力搅拌器上微热）1.2步骤：取0.3g叶片，加4ml磷酸缓冲液研磨，加入4ml0.25%的硫代巴比妥酸（溶于10%的三氯乙酸）溶液↓摇匀95℃加热15分钟↓快速冷却3000g离心15分钟↓取上清测定OD532，OD600，OD450值↓按公式求MDA浓度=6.45某（OD532-OD600）-0.56OD450(μmol/L)可溶性糖浓度=11.71某OD450(mmol/L)-3最后计算MDA含量（μmol/gFW）=[4某（MDA浓度某）某10/0.1]-3同时，可测得可溶性糖含量（mmol/gFW）=4某（可溶性糖浓度χ）某10/0.1（用多波长测定，在测定之前一定要矫正基线，公式中的参数可以直接在分光光度计上输入）注意：以0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白调零MDA含量测定的改进1.可以用做酶活性时提取的酶液来直接测定MDA含量，用量可以定为1.0、1.5或2.0（较好）ml。
SOD、POD等的测定
叶绿素，SOD,MDA,POD,硝酸还原酶等测定方法(2009-04-12 20:40:12)标签：教育分类：教育实验测定方法1 叶绿素含量测定：80％的丙酮液的配制：4L丙酮 + 1L蒸馏水。
称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管（做三个重复），加入25ml浓度为80％的丙酮液，放在黑暗处浸提大约36小时后取出，稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm下测定光密度，以80％的丙酮液为空白。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35～36）也可用95%乙醇溶液，在665、649、470nm处有最大吸收峰Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/2452 抗氧化酶活性的定：（2.5g样）0.05mol/L磷酸缓冲溶液 (PBS)（pH=7.8）溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285g NaH2PO4·2H2O, 定容到4L。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P134）。
取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲溶液（pH=7.8）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。
2.1丙二醛（MDA）的测定：20％三氯乙酸（TCA）溶液的配制：称200g三氯乙酸，用蒸馏水定容到1000ml。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）；0.5% 硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸（TBA）,用20％三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容到1000ml。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）（先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解）；0.5ml酶液（对照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液）（做三个重复）+ 3mlTBA――振荡――沸水浴上反应30min――冷却（至少30min）――比色（OD600、OD532、OD450）。
SODPODCATMDA的测定方法
缩写：SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶； MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：甲硫氨酸；NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS: 磷酸缓冲液1.SOD的测定方法加样顺序：（V=3ml）磷酸缓冲液：1.5ml L-Met: 0.3ml NBT: 0.3ml EDTA-Na2: 0.3ml 核黄素：0.3ml 酶液：0.05ml 蒸馏水：0.25ml试剂配制：(1) 0.05mol/L PBS：pH7.8(2) 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用PBS定容至100ml(3) 750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS定容至100ml(避光保存)(4) 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用PBS定容至1000ml(5) 20umol/L核黄素: 0.0753g用蒸馏水定容至1000ml(避光保存) 注：（1）对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管(2) 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值2.MDA的测定方法试剂配制：（1）5% TCA： 5g用蒸馏水定容至500ml（2）0.5% TBA：2.5g用TCA定容至500ml方法：酶液1ml—3ml0.5%TBA和5%TCA—混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却，10000r/min离心10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值3.POD的测定方法试剂配制：（1）0.1mol/L的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液A(0.2mmol/L的HAc溶液)—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中B(0.2mmol/L的NaAc溶液)—（2）0.25%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中（临用前配制）（3）0.75%H2O2溶液：1.25ml 30% H2O2定容至50ml（临用前配制）方法：比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液—1ml 0.25%愈创木酚溶液—xml酶液（5min值为500-800即可）—0.1ml 0.75%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min4.CAT的测定方法试剂配制：(1) 50mmol/L的PBS（pH7.0） (2) 0.3% H2O2—1ml H2O2定容至100ml 方法：(1)以不加H2O2的50mmol/L的PBS（pH7.0）为空白把A240调零(2)50ul酶液—3ml 50mmol/L的PBS（pH7.0）—0.2ml 0.3% H2O2—迅速颠倒混匀，开始计时—1min后在240nm下比色，1次/1min(连续读取5min)。
植物生理学中各项生理指标的测定方法
一.实验内容实验1 MDA(丙二醛)含量测定所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯） 0.25%硫代巴妥酸 (纯)实验2：可溶性蛋白含量测定所需试剂：考马斯亮蓝G-250 95%乙醇 85%磷酸实验3：SOD(超氧化物歧化酶)酶活性测定所需试剂：dl-甲硫氨酸（Met） NBT EDTA-Na2 核黄素实验4：CAT(过氧化氢酶)活性（过氧化氢酶）测定所需试剂：PBS（PH=7.0） 30% H2O2实验五：Apx(抗坏血酸过氧化物酶)活性（即ASA—POD活性）测定所需试剂：ASA（分子量167.12） (乙=胺四乙酸=钠)EDTA—Na2 PBS (pH7.0) 30%H2O实验6： ASA(维生素C)含量测定偏磷酸 95%乙醇磷酸 4% 2,2-二联吡啶 FeCl3（或FeCl3·6H2O）实验7：GSH(谷胱甘肽, 媚力肽GSH GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物)含量测定所需试剂：NaH2PO4·2H2O DTNB（二硫代硝基苯甲酸） PBS (PH6.8)实验8：脯氨酸测定所需试剂：磺基水杨酸甲苯茚三酮冰乙酸 85%磷酸试验9：叶绿素含量测定。
80%丙酮试验9：GR活性测定试验10：过氧化氢含量测定。
三氯乙酸试验11：超氧阴离子含量测定二．酶液和母液提取1. 酶液提取所需试剂：50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）(内含1% (m/v) 聚乙烯吡哆烷酮PVP），0.1mmol/L EDTANa2或EDTA)，也可为（内含2% (m/v)PVP），0.2mmol/L EDTA Na2或EDTA）（先配制后用缓冲液定容）2. ASA . GSH母液提取所需试剂：5%偏磷酸1．抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CAT）：1g（根据样品的量,少的可以适当减少）叶片加入预冷5ml. 50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）↓4℃冷冻15000g离心20分钟↓上清液即为酶液（5℃下保存一两天内备用，中短期用-20℃保存）2．ASA . GSH母液提取：0.1g叶片加入3ml预冷5%偏磷酸溶液↓4℃冷冻14000g离心10分钟↓上清液即为母液（5℃下保存备用）（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护ASA）酶液提取所需试剂：PVP（聚乙烯吡哆烷酮）：1%（1g溶于100ml水），1000ml需称取10g，此处用PBSEDTA-Na 2 : 0.1mmol/L (37.2mg EDTA-Na2溶于1000ml蒸馏水)，此处用PBSPBS（缓冲液）配制方法：① Na2HPO4·12H2O ② NaH2PO4·2H2O取① 71.64g，蒸馏水定容至1L，取② 31.21g定容至1L，放置4℃冰箱备用PH=7.8 取① 91.5ml+② 8.5ml=100ml (浓度0.2mol/L)需要0.05mol/L→将上述溶液烯释至400ml （0.2mol/L*0.1=0.05mol/L*V）母液提取所需试剂：5%偏磷酸：称5g纯偏磷酸，定容至100 ml蒸馏水（需加热溶解，温度在50-60℃）偏磷酸有剧毒（偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容）（现所用为38%HPO3，所以需称65.7895g，定容至500ml）三．实验步骤实验1：MDA含量测定1.1所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯）称10g定容至100ml0.25%硫代巴妥酸 (纯) 称0.25g用10%TCA定容至100ml（配制时，可一次完成，先配TCA，不要定容，再加入硫代巴比妥酸，然后定容，若难溶解，可以在磁力搅拌器上微热）1.2步骤：取0.3g叶片，加4ml磷酸缓冲液研磨，加入 4ml 0.25%的硫代巴比妥酸（溶于10%的三氯乙酸）溶液↓摇匀95℃加热15分钟↓快速冷却3000g离心15分钟↓取上清测定 OD532，OD600，OD450值↓按公式求 MDA浓度=6.45×（OD532-OD600）-0.56OD450 (μmol/L)可溶性糖浓度=11.71×OD450 (mmol/L)最后计算 MDA含量（μmol/g FW）= [4×（MDA浓度x）×10-3/0.1]同时，可测得可溶性糖含量（m mol/g FW）= 4×（可溶性糖浓度χ）×10-3/0.1（用多波长测定，在测定之前一定要矫正基线，公式中的参数可以直接在分光光度计上输入）注意：以0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白调零MDA含量测定的改进1.可以用做酶活性时提取的酶液来直接测定MDA含量，用量可以定为1.0、1.5或2.0（较好）ml。
SOD活性测定POD活性测定CAT活性测定质膜透性测定MDA含量测定色素含量测定实验方案及数据记录表格
SOD活性测定POD活性测定CAT活性测定质膜透性测定MDA含量测定色素含量测定实验方案一、细胞质膜透性的测定（电导法）材料、仪器设备1.材料：植物叶片，每个样本1cm2的小叶片1g。
2.仪器药品：洗洁精；电导仪；电子天平；冰箱；真空泵；真空干燥器；恒温培养箱；电炉；50ml烧杯；50ml量筒；小镊子；纱布；表皿；滤纸条；镜头纸；剪刀；玻棒；胶头滴管；瓷盘。
实验步骤1.清洗用具所用玻璃用具均需先用洗洁精清洗，然后用自来水洗3次，再用蒸馏水洗3次，然后放入或倒置在洗净的且垫有洁净滤纸的器皿中干燥后备用。
2.实验材料的准备及处理选取叶龄叶位长势均相似的植物叶片，剪下后用湿布包住放在已经编号的保鲜袋中，最后用保鲜盒封存带回。
实验前用自来水冲洗叶片，除去表面沾污物，再用蒸馏水冲洗2次，用洁净滤纸轻轻吸干叶片表面水分放于已编号的洁净器皿中，然后分别剪成约1cm2的小叶片（或用直径为1cm2的打孔器钻取小圆片），注意除掉大叶脉。
将剪下的小叶片分别混合均匀，每个样本再快速称取鲜样2份，每份0.5g，分别放入编号为X-n-a、X-n-b的50ml烧杯中，另取编号C的烧杯，不加鲜样留作空白本底对照。
每个样本的三个烧杯中均加入蒸馏水30ml 浸泡，将盛有鲜样的a、b烧杯放入真空干燥器中，用真空泵抽气25min（以抽出细胞间隙中的空气），然后缓缓放入空气，从真空干燥器中取出a、b烧杯，a、C杯继续常温浸泡，b 杯称重，盖上表皿，置于电炉上煮沸15min，冷却后再称重并加蒸馏水至原重量，继续室温自然浸泡45min即可测定。
各样本处理时浸泡时间和处理温度要保持一致，均保持在室温下。
（注：自然浸泡需要4～5h以上，为防止样品表面气泡的影响故用真空干燥管去除气泡，也可以在振荡器上浸泡1～2h。
）3.测定电导值在测定前先将各杯浸泡液摇匀，测出各杯样本浸出液电导率值，记录到原始数据表上相应栏中。
（注意：每测定完一个样液后，用蒸馏水漂洗电极，再用滤纸将电极擦干，然后进行下一个样液的测定）原始数据表样表如下：电导率测定记录表：样本编号处理电导率值(μS · cm－1)相对外渗率（％）空白对照C管（常温蒸馏水空白）___—___ (第X组第n个重复)a管（常温）b管（煮沸）___—___a管（常温）b管（煮沸）___—___a管（常温）b管（煮沸）4、结果计算按下公式计算低温及常温处理电解质的相对外渗率：电解质的相对外渗率（％）＝× 100%二、叶绿素含量的测定（丙酮提取法）材料、仪器设备1.材料：植物叶片，每个样本0.5g。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。
其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。
测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。
本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。
1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。
常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。
羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。
2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。
酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。
常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。
离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。
上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。
蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。
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生理指标的测定
测定不同时期野生大豆和栽培大豆的游离脯氨酸、丙二醛、过氧化物酶、叶绿素的含量。
测定方法如下：
采样：分别在盐处理后，第2天、第7天和第12天，采叶片测量生理指标。
采摘的叶片标准为：成龄、无病虫害、无缺失、鲜绿的叶片。
丙二醛含量的测定（采用双波长硫代巴比妥酸法）
材料提取：称取0.25g左右大豆叶片，加入0.5% TCA 3mL，研磨后所得匀浆3000rpm离心10min。
取上清液2mL，加0.5%TBA（称取TBA0.5g溶于0.5% TCA 溶液，并用其定容至100mL）2mL，混合后在100℃水浴上煮沸30min，冷却后再离心一次。
样品测定：分别测定上清液在450nm、532nm、600nm处的吸光值，并按公式算出MDA的浓度，再算出单位鲜重组织中MDA含量（μmol·g-1）。
结果计算：
M=C×V/W×1000M为MDA含量（μmol·g-1）；C为MDA浓度（μmol·L-1）；V为提取液体积（mL）；W为样品重量（g）。
游离脯氨酸含量的测定（采用酸性茚三酮法）
样品提取：称取鲜样0.5g左右，放入研钵中，加入80%的乙醇3mL研成匀浆，移入具塞试管中，并用80%的乙醇冲洗研钵，匀浆与洗液合并总量为10mL，加盖后沸水浴煮沸10min，再加活性炭粉末0.25g，振荡过滤（用80%乙醇冲洗滤纸与残渣3次），滤液于80～85℃水浴上蒸去乙醇，残渣用蒸馏水洗济并定容至100mL供测定之用。
样品测定：取具塞刻度试管2只，各加入上述过滤样液2mL、冰醋酸2mL、茚三酮试剂2mL，摇匀后加盖，于沸水浴中煮沸10～15min，冷却后于515nm下比色，记录消光值。
结果计算：A=C×V/WA为样品脯氨酸含量（μg·g-1）；C为从标准曲线上查得脯氨酸浓度（μg·ml-1）；V为样品稀释体积（ml）；W为样品重量（g）。
过氧化物酶活性的测定（采用愈创木酚比色法）
酶液制备：称取大豆叶片0.3g，加入适量的pH7.0的磷酸缓冲液（准确称取0.156g NaH2PO4·2H2O，溶解后定容至100mL，即为A液；准确称取0.35g Na2HPO4·12H2O，溶解后定容至100mL，即为B液。
取A液39mL和B液61mL 混匀，即为10mmol·L-1pH7.0的磷酸缓冲液。
）充分研磨至无粗纤维为止，分装在小离心管中，再用pH7.0的磷酸缓冲液洗净研钵，洗液一并转入小离心管中，10000rpm离心20min，上清液即为酶提取液。
酶活性测定：取试管11支，一支为对照管，另外10支为测定管，按下表加入
试剂，配成POD反应体系。
摇匀，放入34℃水浴中保温3min后，加入50μL 三氯乙酸，摇匀，以对照管作用液为空白，在470nm波长下比色，读取OD值。
结果计算：过氧化物酶活性单位（U）定义为1g鲜样1min内470nm处吸光值升高1个单位所需的酶量。
过氧化物酶活性=OD470/（W×t）×V1/V2式中：OD470为470nm下的OD值；W为样品重（g）；t为反应时间（min）；V1为提取时酶液体积（mL）；V2为反应时酶液体积（mL）。
叶绿素含量的测定（采用721-分光光度计法）
叶绿素在盐处理后第12天测量
色素提取：称取新鲜叶片0.1g放入研钵中，加入5mL80%丙酮研磨成匀浆，倒入小离心管中，加盖，3000rpm离心5min。
上清液即为光合色素提取液。
比色测定：取小试管，取提取液2mL加80%丙酮4mL稀释摇匀，分别于663nm、645nm下比色，记录OD值。
结果计算：A=C×V／W×1000C=20.3OD645+8.04OD663
式中：A为色素含量（mg·g-1）；C为色素浓度（mg·L-1）；V为色素溶液总体积（mL）；W为叶片重量（g）。
酶液的制备及活性测定
SOD粗酶液制备
4℃下，按每g（鲜重）材料加入10mL 50mmol·L-1磷酸缓冲液（pH7.8，含0.1mmol·L-1 EDTA，4%聚乙烯吡咯烷酮PVPP），匀浆，用尼龙布过滤，滤液于12 000r/min离心20min，上清液为酶粗提液，用于测定SOD、CAT活性及MDA 含量。
POD粗酶液制备
4℃下，按每0.5g（鲜重）材料加5mL 0.1 mol·L-1Tris-HCl缓冲液（pH8.5），研钵中研磨成匀浆，以4 000rPmin离心15min，取上清液，即为酶的粗提液。
各项生理生化指标的测定
SOD活性测定采用SOD测试盒，本试剂盒采用黄嘌呤氧化酶法；（SOD测试盒为南京建成生物工程研究所生产，愈创木酚、高锰酸钾、三氯乙酸、硫代巴比妥酸等均为国产分析纯）
POD活性测定采用愈创木酚法，以每分钟内OD470nm变化0.01为一个过氧化物酶活性单位（U）；CAT活性测定采用高锰酸钾滴定法；MDA含量测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法。