项目四 发酵工业的无菌操作
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第四章发酵工业的无菌技术
管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
3. 预防
培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角
喷淋冷却连续灭菌流程
蒸汽
蒸汽
放汽
冷却水
无菌培养基 进发酵罐
配料罐
连消泵 连消塔
维持罐
冷却罐
生培养基
真空冷却器 无菌培养基进发酵罐
分批灭菌与连续灭菌的比较
连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
养基加热至1000C以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。
将配置好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、 保温和冷却等灭菌过程。——高温短时
（三）连续灭菌（连消）
工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程
灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。
本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
3. 预防
培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角
喷淋冷却连续灭菌流程
蒸汽
蒸汽
放汽
冷却水
无菌培养基 进发酵罐
配料罐
连消泵 连消塔
维持罐
冷却罐
生培养基
真空冷却器 无菌培养基进发酵罐
分批灭菌与连续灭菌的比较
连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
养基加热至1000C以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。
将配置好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、 保温和冷却等灭菌过程。——高温短时
（三）连续灭菌（连消）
工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程
灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。
本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐
第四章-发酵工业的无菌技术
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（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
种子扩大时期染菌:
易染菌、应灭菌后除去，并对种子罐、管道进行检查和彻底灭菌。
发酵前期染菌： 应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种
发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方法应根据 各种发酵的特点和具体情况来决定 ▪ 抗生素发酵
=20.34(min)
由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培 养基加热至1000C以上，这个作用较为显著，故实际保 温阶段时间比计算值要短。
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（三）连续灭菌（连消）
工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程
灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、 后的含菌数。
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2. 污染原因分析
从污染时间看：早期污染可能与①②④⑤→接种操作不当有关； 后期污染可能与③⑤及中间补料有关。
从杂菌种类看： 耐热芽孢杆菌：与④有关 球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关 浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏 霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长
从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所污染的是同 一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设 备问题。
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3. 预防
种子带菌的防治 灭菌彻底 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作 可靠 保藏可靠
过滤空气带菌的防治（第五节“空气除菌”） 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
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4微生物工程第四章发酵工业的无菌技术
解：C0=2×105(个/ml) Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml) t=2.303/k[lg(C0/Ct)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)] =2.37 min
喷淋冷却连续灭菌流程
喷射加热连续灭菌流程
薄板式换热器连续 灭菌流程
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝 大量自溶，发酵液粘度黏度增加，过滤困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂； ②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，使水相和溶媒之 间极易发生乳化。
（二）杂菌污染的防治
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 平板划线培养或斜面培养检查法 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
四、发酵培养基及设备管道灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）发酵培养基及设备管道灭菌技术
（一）湿热灭菌原理 1.微生物的热阻
灭菌后弃去
发酵前期染菌
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分， 重新接种
发酵中期染菌
挽救困难，应早发现，应根据各种发酵的特 点和具体情况尽快处理 。
抗生素发酵
输入正常发酵的另一罐发酵液
柠檬酸发酵
a. 污染细菌：加大通风，加速产酸；加入盐 酸等条pH3.0以下，抑制细菌
b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制 酵母；通风加大，加速产酸。
3. 杂菌污染的途径及其预防
（1）种子带菌的防治
培养基及器具彻底灭菌 避免菌种在移接过程中受污染 避免菌种在培养及保藏过程中污染
喷淋冷却连续灭菌流程
喷射加热连续灭菌流程
薄板式换热器连续 灭菌流程
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝 大量自溶，发酵液粘度黏度增加，过滤困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂； ②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，使水相和溶媒之 间极易发生乳化。
（二）杂菌污染的防治
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 平板划线培养或斜面培养检查法 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
四、发酵培养基及设备管道灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）发酵培养基及设备管道灭菌技术
（一）湿热灭菌原理 1.微生物的热阻
灭菌后弃去
发酵前期染菌
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分， 重新接种
发酵中期染菌
挽救困难，应早发现，应根据各种发酵的特 点和具体情况尽快处理 。
抗生素发酵
输入正常发酵的另一罐发酵液
柠檬酸发酵
a. 污染细菌：加大通风，加速产酸；加入盐 酸等条pH3.0以下，抑制细菌
b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制 酵母；通风加大，加速产酸。
3. 杂菌污染的途径及其预防
（1）种子带菌的防治
培养基及器具彻底灭菌 避免菌种在移接过程中受污染 避免菌种在培养及保藏过程中污染
发酵工业的无菌技术课件
（2）污染其它杂菌 有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加 消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。
有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不 耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热， 不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。
发酵工业的无菌技术
3、不同时间染菌对发酵的影响 污染时间是指用无菌检测方法确准的污染 时间，不是杂菌窜入培养液的时间。
• 管道安装不当或配置不发合酵工理业的形无菌技成术 的“死角”
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
发酵工业的无菌技术
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
发酵工业的无菌技术
法兰连接不气带菌 因为空气除菌系统较为复杂，环节多，偶遇不 慎便会导致空气除菌失败。
同 产
素迅速破坏。
品 链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不
象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造
成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干
扰生产菌的正常代谢、改变pH，降低产量。
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灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制
霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。
不
同 产
疫苗生产危害很大。
品
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3、种子带菌 分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌。 加强种子管理，严格无菌操作，种子本身带菌 是可以克服的。种子培养过程染菌与发酵一样 有许多因素造成。
发酵工业的无菌技术
4、灭菌不彻底 灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系 蒸汽通入培养基，升温快慢、保温时间——产生过 多泡沫 蒸汽总压是否达到要求标准 环境中的杂菌数量因季节而有很大差别。故染菌率 因季节不同而发生明显变化。
发酵工业的无菌技术
发酵工业的无菌技术
（一）概述
空气除菌的必要性 以一个50m3的发酵罐为例，若装料系数为0.7，要 求每立方米发酵液每分钟通气0.8m3，培养周期 170h，那么每个周期需通气量2.86×105 m3(50×0.7 × 0.8 × 170 × 60)，而每立方米大气中约有103-104 个微生物。
发酵工业的无菌技术
分批灭菌与连续灭菌的比较
缺点： 对小型罐无优势，不方便，对设备要求高； 蒸汽波动时灭菌不彻底； 当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时， 以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。
发酵工业的无菌技术
五、空气除菌
（一）概述 （二）空气过滤除菌流程 （三）空气预处理 （四）空气预处理流程设计应用举例 （五）空气过滤介质 （六）空气过滤除菌原理 （七）提高过滤除菌效率的措施
发酵一无所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染
菌。 C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，
都应全部废弃。
发酵工业的无菌短产气杆菌 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 柠檬酸：怕染青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
发酵工业的无菌技术
（三）空气预处理
1. 原理： 除尘(外源空气的前处理)：防塞，提高过滤效率和滤 器寿命；措施：建吸风塔、粗过滤器（布袋过滤器、 填料过滤器、油浴洗涤和水雾除尘装置等）、高 效前置过滤器 降温：防烧伤介质及水分蒸发严重，对发酵不利 除油、除水：防塞（因油膜堵），防止过滤器长菌堵 塞（因水滴） 加热：保持相对湿度 稳压：防止压力波动，贮罐
发酵工业的无菌技术
（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
（一）概述
空气除菌的必要性 以一个50m3的发酵罐为例，若装料系数为0.7，要 求每立方米发酵液每分钟通气0.8m3，培养周期 170h，那么每个周期需通气量2.86×105 m3(50×0.7 × 0.8 × 170 × 60)，而每立方米大气中约有103-104 个微生物。
发酵工业的无菌技术
分批灭菌与连续灭菌的比较
缺点： 对小型罐无优势，不方便，对设备要求高； 蒸汽波动时灭菌不彻底； 当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时， 以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。
发酵工业的无菌技术
五、空气除菌
（一）概述 （二）空气过滤除菌流程 （三）空气预处理 （四）空气预处理流程设计应用举例 （五）空气过滤介质 （六）空气过滤除菌原理 （七）提高过滤除菌效率的措施
发酵一无所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染
菌。 C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，
都应全部废弃。
发酵工业的无菌短产气杆菌 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 柠檬酸：怕染青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
发酵工业的无菌技术
（三）空气预处理
1. 原理： 除尘(外源空气的前处理)：防塞，提高过滤效率和滤 器寿命；措施：建吸风塔、粗过滤器（布袋过滤器、 填料过滤器、油浴洗涤和水雾除尘装置等）、高 效前置过滤器 降温：防烧伤介质及水分蒸发严重，对发酵不利 除油、除水：防塞（因油膜堵），防止过滤器长菌堵 塞（因水滴） 加热：保持相对湿度 稳压：防止压力波动，贮罐
发酵工业的无菌技术
（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
发酵工业的无菌技术
间 1.设备要求低，不需另外 1.培养基的营养物质损 加热、冷却装置。 失大，灭菌后培养基 歇 质量下降 灭 2.操作要求低，适合小批 量生产规模 2.发酵罐的利用率较低 菌
3.适合含大量固体物料的 3.不适合大规模生产的 灭菌 灭菌
作业
1、连续灭菌的流程与设备 2、对数残留定律 3、分批灭菌、连续灭菌 4、P273第8题
二、影响培养基灭菌的因素p68
杂菌的种类与数量 灭菌温度与时间 培养基成分 pH值 培养基中的颗粒 泡沫
培养基成分
油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性 在固形物含量高的情况下，灭菌温度可高些。 环境 耐热性 60～65℃便死亡
水
大肠杆菌
10％糖液
30％糖液
70℃，4～6min
喷射加热连续灭菌流程
薄板换热器连续灭菌流程
3、灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、 后的含菌数。
例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌， 灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有 2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为 15min-1，求灭菌所需的维持时间。
解：C0=2×105(个/ml)
Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)
t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k=2.303×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]
/15 =2.37 min
间歇灭菌与连续灭菌的比较
优 点 缺 点
连 1.高温短时灭菌，培养基 1.设备复杂，操作麻烦, 营养成分损失少。 染菌机会多。 续 灭 2.发酵罐占用时间缩短， 2.不适合含大量固体物 利用率高。 料的灭菌。 菌
3.适合含大量固体物料的 3.不适合大规模生产的 灭菌 灭菌
作业
1、连续灭菌的流程与设备 2、对数残留定律 3、分批灭菌、连续灭菌 4、P273第8题
二、影响培养基灭菌的因素p68
杂菌的种类与数量 灭菌温度与时间 培养基成分 pH值 培养基中的颗粒 泡沫
培养基成分
油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性 在固形物含量高的情况下，灭菌温度可高些。 环境 耐热性 60～65℃便死亡
水
大肠杆菌
10％糖液
30％糖液
70℃，4～6min
喷射加热连续灭菌流程
薄板换热器连续灭菌流程
3、灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、 后的含菌数。
例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌， 灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有 2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为 15min-1，求灭菌所需的维持时间。
解：C0=2×105(个/ml)
Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)
t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k=2.303×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]
/15 =2.37 min
间歇灭菌与连续灭菌的比较
优 点 缺 点
连 1.高温短时灭菌，培养基 1.设备复杂，操作麻烦, 营养成分损失少。 染菌机会多。 续 灭 2.发酵罐占用时间缩短， 2.不适合含大量固体物 利用率高。 料的灭菌。 菌
发酵工业的无菌技术
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分批灭菌与连续灭菌的比较
缺点： 对小型罐无优势，不方便，对设备要求高； 蒸汽波动时灭菌不彻底； 当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时， 以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。
整理课件
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五、空气除菌
（一）概述 （二）空气过滤除菌流程 （三）空气预处理 （四）空气预处理流程设计应用举例 （五）空气过滤介质 （六）空气过滤除菌原理 （七）提高过滤除菌效率的措施
整理课件
1
本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
整理课件
2
一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐
灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命 物质的过程。 消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具 表面的微生物。 除菌(degermation): 用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。 防腐(antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖 。
从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所 污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别 罐连续染菌，一般是设备问题。
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3. 预防
种子带菌的防治 灭菌彻底 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可 靠 保藏可靠
过滤空气带菌的防治 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
整理课件
解：C0=2×105(个/ml) Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml) t=2.303/k[lg(C0/Ct)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)] =2.37 min
发酵工业无菌技术应用
优点 设备投资较少 染菌的危险性较小 人工操作较方便 对培养基中固体物质含 量较多时更为适宜 缺点 灭菌过程中蒸汽 用量变化大，造成 锅炉负荷波动大， 一般只限于中小型 发酵装置。
4.2.4 设备和管道的灭菌 1、种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的
空罐灭菌及管道灭菌 2、空气总过滤器和分过滤器灭菌 3、种子培养基实罐灭菌 4、发酵培养基实罐灭菌 5、发酵培养基连续灭菌 6、补料实罐灭菌
取边界条件t0=0，N=N0，对（1）积分得
ln
N N0
K t
2
4.2.2 培养基灭菌温度和时间的选择 高温短时灭菌 4.2.3 培养基的灭菌方法 （1）分批灭菌
也称实消、实罐灭菌、间歇灭菌，是 指将配制好的培养基输入发酵罐内，直接 通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行灭 菌的操作过程 。
3. 两级冷却、分离、加热的除菌流程 空气吸气口 粗过滤器 空压机 贮罐 冷却器 旋风分离器 冷却器 丝网分离器 加热器 总过滤器
三、提高过滤效率的措施 1. 减少进口空气的含菌数量 ① 正确选择进风口 ② 提高进口空气的采风位置，即高空采风 ③ 对压缩前的空气采用粗过滤处理 2. 设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌 效率高的过滤介质 3. 针对不同地区设计合理的空气处理流程 4. 降低进入过滤器的空气相对湿度，保证过 滤介质在干燥状态下工作
表4-3 几种微生物对湿热的相对抵抗力
微生物名称 大肠杆菌 细菌芽孢 相对抵抗力 1 3 000 000 霉菌孢子 2～10 病毒 1～5
二、微生物的热死规律——对数残留定律 实验证明，微生物营养细胞的均相热死灭 动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：
dN dt
kN
1
N：任一时刻的活菌数（个） t：灭菌时间（min） K：比热死速率常数（min-1）
4.2.4 设备和管道的灭菌 1、种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的
空罐灭菌及管道灭菌 2、空气总过滤器和分过滤器灭菌 3、种子培养基实罐灭菌 4、发酵培养基实罐灭菌 5、发酵培养基连续灭菌 6、补料实罐灭菌
取边界条件t0=0，N=N0，对（1）积分得
ln
N N0
K t
2
4.2.2 培养基灭菌温度和时间的选择 高温短时灭菌 4.2.3 培养基的灭菌方法 （1）分批灭菌
也称实消、实罐灭菌、间歇灭菌，是 指将配制好的培养基输入发酵罐内，直接 通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行灭 菌的操作过程 。
3. 两级冷却、分离、加热的除菌流程 空气吸气口 粗过滤器 空压机 贮罐 冷却器 旋风分离器 冷却器 丝网分离器 加热器 总过滤器
三、提高过滤效率的措施 1. 减少进口空气的含菌数量 ① 正确选择进风口 ② 提高进口空气的采风位置，即高空采风 ③ 对压缩前的空气采用粗过滤处理 2. 设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌 效率高的过滤介质 3. 针对不同地区设计合理的空气处理流程 4. 降低进入过滤器的空气相对湿度，保证过 滤介质在干燥状态下工作
表4-3 几种微生物对湿热的相对抵抗力
微生物名称 大肠杆菌 细菌芽孢 相对抵抗力 1 3 000 000 霉菌孢子 2～10 病毒 1～5
二、微生物的热死规律——对数残留定律 实验证明，微生物营养细胞的均相热死灭 动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：
dN dt
kN
1
N：任一时刻的活菌数（个） t：灭菌时间（min） K：比热死速率常数（min-1）
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部分发酵罐染菌： 个别发酵罐连续染菌：设备渗漏
4.杂菌污染途径及预防
（1）种子带菌及其防止 原因
：菌种培养或保藏过程染菌、培养基及用具灭菌不彻底、菌种移接
过程污染
措施：
严格控制无菌室污染，严格无菌操作； 种子保存管的棉花塞应有一定的紧密度，且有一定的长度； 培养和保存温度不宜有太大变化； 菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理 ；
霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长
2014-12-16
从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染 菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气 系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设备 问题。
2014-12-16
1）从污染杂菌的种类分析
污染耐热芽孢杆菌：培养基或设备灭菌不彻底； 污染不耐热杂菌：种子带菌、空气除菌不彻底、设
污染噬菌体，糖耗减慢，尾气中CO2量减少
2.污染噬菌体的检测
噬菌体是什么？
噬菌体是病毒的一种，是一种极微
小的生物，体积是细菌的1/1000左
右，它可以通过细菌过滤器，只有
在电子显微镜下才能看到。
26
消除潜在的污染隐患-1
涉及菌体相关的操作要尽可能在生物安全柜中进行； 在菌体培养过程中，尽量不要打开瓶口。如果实在需要打开瓶口的话，必需 在无菌的环境下操作。 生物安全柜和超净台应注意清洁和消毒；每年更换HEPA过滤膜。
B.
实罐灭菌时未充分排除罐内空气：造成假压，
升温时，应打开排气等阀门放气。
C.
连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到
灭 菌温度，导致灭菌不彻底。
D.设备和管道存在“死角”
死角：由于操作、设备结构、安装或人为造
成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到达或不能
充分到达预定应该到达的局部灭菌部位，从而不
能达到彻底灭菌的要求。
项目四 发酵工业的无菌操作
发酵工业污染的防治策略
发酵工业无菌操作的基本概念
发酵工业的无菌操作技术 发酵培养基及设备管道灭菌
空气除菌
一、发酵工业污染的防治策略
什么是染菌？
即“杂菌污染”，是指在发酵培养中侵入了除 菌种外，有碍生产的其他微生物。
（一）污染的危害
杂菌大量消耗培养基中的营养物质，使生产菌的生产能力下降
采用备用菌种或以无污染的适当菌龄的发酵罐内的发
酵液作为种子，接入新鲜培养基中进行发酵。
2.染菌发生的不同时期对发酵的影响
（2）发酵前期染菌
发酵前期易染菌，且危害很大，需特别注意防止 一旦发现染菌，如原料营养还比较丰富，则进行重新灭 菌、接种发酵；如已消耗较多营养物质，则放掉部分料 液、补充新鲜培养基，重新灭菌、接种发酵。
噬菌体的防治
严禁活菌体排放，切断噬菌体的“根源”；
净化生产环境，消灭污染源；
保证纯种培养，严防种子本身带噬菌体，特别是溶源性
噬菌体；
轮换使用菌种或使用抗性菌株。
2、染菌的处理
染菌后处理
染菌后必须对所有相关原料、仪器设备、管道等进行彻 底灭菌。 尽量查明染菌原因，以免重复污染。
3.污染原因分析
谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
2.染菌发生的不同时期对发酵的影响
种子 培养期
发酵 前期
发酵 中期
发酵 后期
2.染菌发生的不同时期对发酵的影响
（1）种子培养期染菌
菌体浓度低、培养基营养丰富，较易染菌，应严格控 制。 若将污染的种子带入发酵罐，则损失更大，因此一经 发现，应立即灭菌丢弃，并对种子罐、管道等进行仔 细检查和彻底灭菌。
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消除潜在的污染隐患-7
高压灭菌后的枪头，务必烘干使用
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消除潜在的污染隐患-8
玻璃器皿特别是菌体培养用器具使用前用铝箔包裹后，在180℃干热灭菌。
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消除潜在的污染隐患-9
培养装置应经常清洗消毒；
水浴摇床中的水要经常更换，长时间不用要将水排空，擦拭干净放置。
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消除潜在的污染隐患-10
污染耐热芽孢杆菌：培养基或设备灭菌不彻底； 污染不耐热杂菌：种子带菌、空气除菌不彻底、
设备渗漏或操作问题；
污染浅绿色菌落杂菌：冷却盘管渗漏引起；
污染霉菌：无菌室灭菌不彻底，或操作问题；
污染酵母菌：糖液灭菌不彻底。
（3）染菌的规模分析
大批量发酵罐染菌：种子、空气；
前期：种子带菌，灭菌问题； 中后期：空气带菌；
发酵过程的异常现象
菌体生长差；
pH值过高或过低； 溶解氧水平异常； 泡沫过多； 菌体浓度过高或过低； CO2排放异常
溶解氧水平异常变化显示染菌
溶氧浓度 污染噬菌体 正常发酵
溶氧浓度
污染嫌气性杂菌
发酵时间 正常发酵
污染好气性杂菌
发酵时间
CO2异常显示染菌
工艺一定，尾气中CO2量变化有一定规律
污染杂菌，糖耗加快，尾气中CO2量增加
1 2 加热灭菌法 辐射灭菌法 化学药品灭菌法 过滤除菌法
3
4
二、发酵工业无菌操作的基本概念
灭菌：用物理或化学的方法杀死物料或设备
中所有的微生物。
消毒：用物理或化学的方法杀死空气、地表
1.染菌对不同发酵过程的影响
（1）染菌对不同菌种发酵的影响
A．细菌
谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少
染杂菌，但噬菌体威胁大。
肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，
营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成
代谢产物。
2014-12-16
B.霉菌
PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发 酵一无所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。
对过滤的影响
染菌后特别是污染细菌后，发酵液一般发粘，导致过滤
困难。
可采取加热、添加助滤剂等措施，或加絮凝菌对产物提取和产品质量的影响
对提炼与产品质量的影响
染菌发酵液中含有较多水溶性蛋白和其它杂质。增加提 炼难度，增加产物提取成本，降低产物纯度。
二、杂菌污染的防治
发酵后期如染菌量不多，可继续发酵。如染菌严重，破坏
性较大，可提前放罐。
3.染菌程度对发酵的影响
发酵罐中的杂菌数量越多，即染菌程度越大，则对发酵 的危害越大。
如生产菌大量繁殖后，发酵物中含少量杂菌，如每升发
酵液中有1-2个杂菌，一般对发酵没有什么影响。
4.染菌对产物提取和产品质量的影响
4.染菌对产物提取和产品质量的影响
措施
选用优质材料、科学合理加工、经常检查。
（5）操作失误染菌及防止
淀粉原料采用实罐灭菌，大颗粒应先筛去，再搅拌均匀，
加入一定量淀粉酶液化或糖化后灭菌。
在灭菌升温时，要打开排气阀门，排尽罐内冷空气。
严防泡沫升顶，可添加消泡剂防止泡沫的大量产生。 严格控制灭菌温度，避免蒸汽压力的波动过大。
发酵过程越来越多采用自动控制，控制仪器如用化学试剂
灭菌时
培养时
在培养时最好使用无菌的棉塞（不要使用铝箔覆盖培养瓶）；不 要使用潮湿或脏的瓶塞。
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消除潜在的污染隐患-11
Centrifuge & it’s rotor
Stands
接触菌体频率高，空隙多容易隐匿菌体的器具要经常清洗消毒。
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消除潜在的污染隐患-12
反复使用的电击槽
脏的移液器 与噬菌体污染的培养液 接触过的电极或buffer
备渗漏或操作问题；
污染浅绿色菌落杂菌：冷却盘管渗漏引起；
污染霉菌：无菌室灭菌不彻底，或操作问题；
污染酵母菌：糖液灭菌不彻底。
2）从污染时间分析
发酵前期染菌：种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底、操作
不当或空气带菌；
发酵后期染菌：中间补料污染、设备渗漏或操作问题。
3）从染菌程度分析
多个罐染菌：种子带菌、空气系统问题； 个别罐染菌：设备问题、操作不当。
菌体相关垃圾处理： 生物安全柜或处理菌体的超净台应配备密封垃圾桶，以防止污染源外泄；
带有菌体的垃圾要做到当日灭菌；
如果当日不能灭菌，应使用垃圾袋密封后放置。
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消除潜在的污染隐患-6
分光光度计周围： 菌体相关的废液建议收集到专门密闭容器，每日灭菌；
盛放过菌液的比色皿应注意清洗，清洗液同上处理。
灭菌，一定要彻底。
（6）噬菌体污染及其防治
染噬菌体对发酵的影响
发酵过程如受噬菌体侵染，一般发生溶菌，随之出现发酵 迟缓或停止，而且往往会反复连续感染，使生产无法进行， 甚至使种子全部丧失，对发酵威胁很大。
噬菌体污染根本原因
生产中把活菌体排放到环境中，造成了自然界中相应噬
菌体大量增殖。 这些噬菌体随风沙尘土和空气流动到处传播，有可能潜 入生产的各个环节，尤其是通过空气系统进入种子室、种子 罐、发酵罐。
常见的设备、管道“死角” 发酵罐的“死角”：不锈钢衬里破裂造成死角， 发酵罐罐底脓疱状积垢。
法兰连接不当造成的“死角”
2014-12-16
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法
2014-12-16
（4）设备渗漏染菌及防止
原因
发酵罐、补糖罐、冷却盘管、管道阀门等，因加工制作不良 或遭受腐蚀等原因而形成微小漏孔后发生渗漏染菌。
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消除潜在的污染隐患-2
使用胶头、移液器、电动移液器吸取溶液后，不能水平放 置，以防液体进入。 一旦液体进入要及时更换滤膜，并做好消毒措施。
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消除潜在的污染隐患-3
普通大肠杆菌的转化及划线后平板建议用石蜡膜完全密封后培养和放置。
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消除潜在的污染隐患-4