第四章 工业发酵灭菌

（2）喷射加热、维持管和真空冷却器组成的连消系统 蒸汽直接喷入培养基中，培养液急速升温到预定灭菌温度， 培养基在此温度下，维持一定时间后，通过一膨胀阀进入 真空冷却器而迅速冷却。保证培养基先进先出，避免过热 或灭菌不彻底。 优点：升温快、营养成分损失少、 缺点：培养基随蒸汽冷凝而稀释。
2、蒸汽间接加热连续灭菌系统
二、培养基的灭菌方法
（一）分批灭菌 是在每批培养基全部流入发酵罐后，就在罐内通入蒸汽，加 热至灭菌温度后，维持一定时间，再冷却到接种温度。实罐 灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌。 特点：不需要其他附属设备，操作简单，为常用的灭菌方法 缺点：加热和冷却时间长，营养随时间增长而降低，发酵罐利 用率低，不能采用高温快速灭菌工艺。 罐体容积越大，，加热和冷却时间越长。 分批灭菌时间：T总=t1+t2+t3。其中t1、t2、t3分别为加热、维 持、冷却时间 注意事项：预热时间、操作、管道的衔接处等的灭菌问题
第三节 空气除菌

概述
1、需氧发酵需要氧气，特别是深层发酵要不断将空气通入 发酵罐。 2、空气中有微生物和灰尘等，在通入发酵罐前要严格处理 3、发酵类型不同，对于空气的无菌程度要求不同。 4、发酵工业无菌空气的制备方法：介质过滤除菌法
一、空气中的微生物分布特点
附着在尘埃和雾沫上、数量和分布随地区、高低、季节、空 气中尘埃多少不同而不同。
三、介质过滤除菌
按机制分：绝对介质过滤除菌、深层介质过滤除菌 （一） 绝对介质过滤除菌 过滤介质之间的空隙小于被滤除微生物。过滤介质 是各种微孔滤膜。由超细纤维制成，孔径小于 0.45um. 工业化：折叠膜滤芯的过滤器。 （二）深层介质过滤除菌 过滤介质空隙和过滤介质纤维的直径大于被除去微生 物。
煮沸法：
将要消毒的物品放入水中煮沸（100度）。
煮沸时间：
15—20分，杀死微生物营养细胞
1—2h，杀死芽孢。加碳酸钠或石炭酸(0.5%)
对象：适用食品或器材的消毒
巴氏消毒法： 待消毒的物体在60～62℃加热30min或在70℃加热 15min，杀死病原菌和一部分微生物。 对象：牛奶、啤酒、黄酒、酱油等食品 特点：不损害某些食品的营养价值和色香味 举例：啤酒的灭菌
二、空气除菌方法
加热灭菌法、静电除菌法、介质过滤除菌法。 （一）加热灭菌法：将空气加热到一定温度，维持一段时间， 杀灭空气中微生物的方法。工业化采用空气空气压缩过程产 生的热量灭菌。（对于无菌程度要求不高的发酵过程可采用） （二）静电除菌。灰尘和细菌的空气，产生电离，产生的离子 使灰尘和微生物成为载电体，捕集在电极上。 （三）介质过滤除菌：空气通过经高温灭菌过的介质过滤层， 微生物等颗粒阻截在介质层。工业上大多数采用。
注意：不能超过180度、灭菌物体不能放得太紧、 降温时缓缓进行、温度降到80度以下时才能开烘 箱门。 原理：氧化作用 缺点：干热的穿透力弱，微生物对干热的耐受力比 湿热强很多，需要的灭菌温度相比较要高，时间 要长。
（2 ） 湿热灭菌
原理：借助蒸汽释放的热，使微生物细胞中的蛋白
质、核酸、酶分子内的化学键，特别是氢键受到
1、热灭菌பைடு நூலகம்：
原理：加热使微生物蛋白质变性
包括：干热灭菌法、湿热灭菌法
（1 ） 干热灭菌法
火焰灭菌：采用火焰直接杀死微生物。如接种针、接
种环等的灭菌。该方法应用范围有限。
干热灭菌： 概念：在红外线或电热作用下，在设备内加热，主 要用于保持干燥的物料、器具等灭菌。 方法：常用在烘箱内，烘箱内的温度160~170度， 维持1~2小时


（四）深层空气过滤介质
两种：1、纤维状物或颗粒状物为介质构成的过滤器 2、滤纸、滤棒、滤板构成的过滤器



四、空气过滤除菌工艺流程 1、空气冷却过滤流程
空气→粗过滤→压缩机→升温→贮罐→冷却器（除油水等） →总过滤器→无菌空气 2、两极冷却除菌流程 空气→粗过滤→压缩机→升温→贮罐→冷却器（油水等） →旋风分离器分离→冷却器（较小的雾粒） →网丝分离 器分离→过滤器→无菌空气 3、高效前置过滤除菌流程 空气→高效前置过滤器→压缩机→升温→贮罐→冷却器→ 丝网分离器→加热器→过滤器→无菌空气
1、蒸汽直接加热连续灭菌系统
定义：蒸汽直接加入到培养基中，快速加热到杀菌温 度，维持一段时间，冷却到发酵温度的过程。分两 种形式： （1）连消塔、维持罐和冷却器组成连续灭菌系统 配料罐将培养基预热到60—70度，防止培养基在杀 菌时料液与蒸汽温度相差过大，而产生水汽撞击声 （危害） 连消塔使培养基迅速升温（20s)（126—132度） 维持塔：使培养基温度保持在灭菌温度下一段时间 （5—7min) 冷却塔：将培养基迅速冷却到40—50度，输送到灭菌 后的发酵罐内。
注意事项：紫外线穿透率力底，只能用于表面灭 菌。30W紫外线灯照射30min ，可取到杀菌效果。 一般和化学试剂合用

紫外线灭菌机理： 使微生物的DNA链断裂，破坏核糖和磷酸的连接 引起DNA分子内或分子间氢键断裂，使微生物死 亡
化学灭菌法 化学灭菌法：化学药品直接作用于微生物将其杀死 的方法。 适用范围：生产车间、无菌室、实验室、接种前的 小型器具及手的消毒。 使用方法：浸泡、添加、擦拭、喷洒等
工业发酵灭菌
课程目标

1、理解工业发酵常用灭菌方法的基本原理和适用范围 2、掌握工业发酵培养基和发酵罐设备的灭菌工艺的选择 3、掌握无菌空气制备的基本知识和典型工艺流程
概述

1、发酵工业大都是纯种培养，生产过程只能有生 产菌，不允许有其他菌（危害）

2、保证纯种发酵，在生产菌种接种之前要对培养 基、空气系统、流加料、发酵罐及管道系统等灭 菌，对环境要消毒.
三、发酵设备灭菌
1、实罐灭菌：培养基同发酵罐一起灭菌 2、培养基连续灭菌：空罐先灭菌。 方法：蒸汽，压力为0.147~0.180Mpa,45~60min.空消 之后不能立即冷却，用无菌空气保压，灭菌后的培养基或 相关物料输入后，冷却。发酵用。 附属设备灭菌： （1）分空气过滤器。发酵罐前灭菌 （2）补料罐：灭菌温度确定要视物料情况 （3）补料管路、消泡剂管路与补料罐、油管等同时灭 菌
破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。
热阻：微生物在某一种条件下的致死时间。
适用范围；广泛用于生产设备、培养基的灭菌。
同温下相对于干热灭菌，杀菌效力更强。 原因： （1）湿热条件下，菌体吸收水分，蛋白质更易凝 固。原因：含水量加大，所需凝固温度降低。 （2）湿热蒸汽的穿透力大 （3）湿热的蒸汽有潜热存在 湿热灭菌方法分为：煮沸灭菌法、巴氏消毒法、间 歇式、高压蒸汽灭菌法
化学灭菌机理
化学物质容易与微生物细胞中的某种成分产生化学 反应。如蛋白质变性、酶类失活、破坏细胞膜通 透性，杀灭微生物。
注：不适合培养基的灭菌，适用于局部空间或器械
的灭菌。 例：P46 常用化学灭菌剂，共7种
第二节 培养基和发酵设备的灭菌

一、培养基灭菌条件的选择 条件选择原则：能达到灭菌、营养基成分破坏最少。 1、灭菌温度和时间选择：（对数残留定律） 营养成分破坏分解反应：dc/dt=-kc(k为速率常数） 阿累尼乌斯方程：K’=A’e-E’/RT (1) 菌体死亡也属一级动力学：K=Ae-E/RT (2) 由（1）和（2），得到 结论：随着温度的升高，灭菌反应速度常数的增加倍数大于 营养成分破坏反应速度常数增加的倍数。用Q10表示。 灭菌方法：采取高温快速灭菌
间歇灭菌法： 采用反复几次常压蒸汽灭菌法。杀死微生物营养体 和芽孢。 具体方法：待灭菌物品，放入灭菌器中加热到 100℃，维持30～60min ，取出，冷却，37℃恒 温箱中培养1小时，次日同法处理。共三次 对象：不宜高压灭菌的物质。如糖类明胶牛奶培养 基等
高压蒸汽灭菌： 主要使用密闭的高压蒸汽灭菌锅。使用广泛。 方法：压力0.1MPa，温度121度，维持15—30min. 注意事项：灭菌完毕，缓缓减压
总结优缺点： 湿热灭菌优点：蒸汽来源容易、蒸汽穿透力强，灭 菌彻底、蒸汽有很大潜热、可调节压强 湿热灭菌的缺点：设备费用高，不能用于怕受潮的 物料的灭菌。


2 辐射灭菌
辐射灭菌：利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来
杀死微生物。紫外线最为常用。

适用范围：接种室，超净工作台、无菌培养室及
物质表面。

（三）介质除菌效率
概念：指被介质层捕集的尘埃颗粒数与空气中原有的颗粒 数的比。 实质：空气中的微生物大大延长了在空气中的停留时间，在 发酵周期内，保证不让空气中的杂菌漏进发酵罐内。
公式：P=N2/N1 P为透过率，N1为过滤前的微粒数，N2为 过滤后的微粒数
除菌效率:η= （N1－N2）/ N1=1 － P 注意：在实际生产中， N2 取0.001.含义是1000次发酵中有 一次因空气带菌而染菌。


制备无菌空气注意：1、提高空气进入压缩机的洁净度 2、 除尽压缩空气中的油水 提高空气洁净度方法：1、提高吸气口的高度 2、先经过 粗效过滤器
蒸汽不直接与培养基接触，通过热交换器对培养基加热 热交换器有：板式和螺旋板式两种 螺旋板式特点：适用于含固行悬浮物的培养基灭菌。流道宽， 流速快，减少热交换器表面的结垢。 灭菌过程：新鲜培养基→残热回收器→加热到90~120℃ → 第二个热交换器→140 ℃ →维持30~120S → 第三个热交换器（冷却） →到符合要求温度的 培养基（20~30S） 注意：含淀粉的培养基，要水或酶解 含颗粒的培养基，增加灭菌时间
（二）、连续灭菌（连消）
指培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭 菌冷却后送入已灭菌的发酵罐的灭菌工艺过程。 温度：126—132度， 总蒸汽压力：0.044—0.049MPa以上。 优点：营养成分破坏少，发酵罐非生产占用时间短， 容积利用率高，蒸汽负荷均匀，锅炉利用率高，适 用于工业化生产。 缺点：不能用于黏度大、固形物含量高的培养基；增 加了连续灭菌设备、增加了染菌概率。 分类：按设备和工艺来分：（1）蒸汽直接加热连续 灭菌 （2）蒸汽间接加热连续 灭菌