银杏叶提取黄酮及分离纯化

银杏叶提取黄酮及分离纯化

组员：李佳辉、黄埔、赵超武

一、实验目的

1.掌握传统的溶剂提取法并对银杏中的黄酮进行提取

2.掌握紫外分光光度计的应用，以及相关溶液的配置

3.学会自主设计实验，培养团队合作精神

二、实验原理

⑴关于黄酮：银杏中最具药用价值的成分，有提高人体免疫力的作用；并且抗衰老、调节内分泌，还具有抗炎、抗真菌的作用；

⑵实验需设置空白参比液，由文献资料可知芦丁标准液的最大波长大概为510nm;

⑶本实验采用硝酸铝（氯化铝）法测定银杏叶总黄酮的质量浓度，因

为黄酮类化合物可以与铝盐发生络合显色反应。

其主要原理为：在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在的条件下，黄酮类化合物与铝盐发生螯合反应，加入氢氧化钠溶液后，溶液显橙红色，在510nm（左右）处有吸收峰，且符合定量分析的朗伯—比尔定律（即A=kbc）一般与芦丁标准溶液比较定量。先用亚硝酸钠还原黄酮类化合物，再加铝盐络合，最后加氢氧化钠溶液使黄酮类化合物开环，生成2-羟基查尔酮而显色。显色原理发生在黄酮醇类邻位无取代的邻二酚羟基部位，不具有邻位无取代的邻二酚羟基的黄酮类成分加入上述

试剂时是不显色的。（如二氢黄酮类化合物就不发生该显色反应）

目前银杏叶黄酮的提取方法主要有：溶剂提取法、超临界流体萃取法（SFE法）、高速逆流色谱技术提取法（HSCCC)微波提取法、超色波提取法、酶提取法、分子烙印技术。因溶剂提取法操作简单，所需试剂廉价易得，故通常使用此法来进行大规模生产。

其工艺流程如下：

银杏叶—→粉碎—→NaOH-60%乙醇回流提取—→离心—→过滤—→滤液收集—→二次醇提—→合并两次滤液—→树脂吸附—→脱吸—→浓缩—→干燥—→提取物

由于银杏叶黄酮中的类黄酮主要为芦丁，故用芦丁为对照物绘制标准曲线，并采用分光光度法进行测定。

三．实验材料及器材

1.材料

酸银杏叶、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、95％乙醇、磷酸氢二钠、磷二氢钠、D101大孔吸附树脂、盐酸

2.相关溶液的配制和树脂预处理

0.20mg／mL芦丁标准溶液（500mL）、5％NaNO2（500mL）、10％AI(NO3)3（500mL）、1mol／LNaOH 、0.4mol／LNaOH（500mL）、0.4mol ／L HCl(500mL)、30%乙醇（500mL）30%乙醇

（1）D101树脂预处理(500g)：商品树脂均残留惰性溶剂，故使用前根据应用需要，必须进行不同深度的预处理，在提取器内，加入高于树脂层10-20厘米的乙醇浸泡3—4小时，然后放净洗涤液，

为一次提取过程。用同样方法反复洗至出口洗涤液在试管中加3倍量水不显浑浊为止，后用清水充分淋洗至无明显乙醇气味，即可进行一般使用。

（2）芦丁标准溶液：精密称取在105℃常压干燥至恒重的芦丁对照品20mg，置于100 mL容量瓶中，加30％乙醇约30mL，置水浴微热使之溶解，放冷，加30％乙醇稀释至刻度，摇匀得芦丁标准溶液（0.20mg/mL）

（3）、5% NaNO2的配制：准确称取5g NaNO2加入到95g蒸馏水中溶解。

（4）、10% AI(NO3)3的配制：准确称取10g AI(NO3)3加入到90g蒸馏水中溶解。

（5）、1mol/L NaOH的配制：称取5g NaOH 于一定量蒸馏水中溶解，再定容至100mL。

（6）、0.4mol/L NaOH 的配制：称取1.6gNaOH 于一定量蒸馏水中溶解，再定容至100mL。

(7)、0.4mol/L HCl的配制：取4ml的36.5%的HCl溶于100ml 蒸馏水中

3.仪器

紫外可见光分光光度计、干燥箱、旋转蒸发仪、离心机、回流装置、恒温水浴锅、中药粉碎机、容量瓶

四、实验步骤

1.原料准备：称取200g银杏叶洗净，于80℃下干燥，干燥后于中药

粉碎机中粉碎，备用。

2.黄酮的提取(银杏叶每组10g)

(1)一次醇提：准确称取银杏叶粉末10g，放入索是氏提取器中，用浓度为60%乙醇溶液按1:8（g/ml）混合均匀，在80℃下回流1.5h，

(2)离心：在3500r/min下离心10min；

(3)过滤：真空抽率，滤液收集；

(4)二次醇提：滤渣用浓度为60%乙醇溶液按1:8（g/ml)混合均匀,进行二次醇提，方法同上

(5)合并两次滤液，将滤液置于100ml容量瓶中，加入60%乙醇溶液稀释至刻度

3.黄酮的纯化

层析柱制备：

(1) 准备：D101大孔吸附树脂预处理并充分吸涨

(2) 湿法装柱：将吸涨后的树脂与溶剂的混合物倒入色谱柱中，让其自行沉积。(50ml)

(3) 上样：将样品溶液从柱的上端以较快速度加入

(4) 洗脱：待样品完全上柱后，用30%乙醇进行洗脱，并在下端收集洗脱液。

(5) 浓缩：将洗脱下来的样品进行浓缩

(6) 干燥

(7)得到产品

(8)样品浓度测定

操作方法：

3.1装柱

将D101大孔吸附树脂用丙酮浸泡过夜（大约15-18h），用水浴回流8h,过滤（或抽滤），用水洗至溶液：水（1:2）不产生混浊为止，浸泡在水中，再进行装柱，并在柱顶加少量氧化铝，制成预处理柱，备用。

3.2样品预处理

精密吸取样品5ml(固体样品制成相当浓度的溶液)，加入已处理好的D101大孔树脂层析柱中，用100ml水洗脱（含蔗糖样品用300ml 水），洗液弃去（流速1.5ml/min)。再以原流速用30ml无水乙醇分次洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用无水乙醇溶解，定量转移至5ml 容量瓶中，稀释至刻度，作为供试品溶液。

4.黄酮含量的测定

（1）标准曲线绘制

精密量取0.2mg/ml芦丁标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别置于10.0 mL容量瓶中，各加30％乙醇至5mL，加5％亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀；放置6min，加10％硝酸铝溶液0.3mL，摇匀；再放置6 min，加4％氢氧化钠溶液2mL，加30％乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，以第1管作空白对照，在波长510nm处测各试管中溶液的吸光度（1号做空白），以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制出标准曲线，并得到回归方程。

葡聚糖标准曲线的测定结果

编号 1 2 3 4 5 6