口蹄疫病毒抗原
抗Asia1型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测口蹄疫病毒的研究

Ab s t r a c t : BAL B/ c mi c e we r e i mmu n i z e d wi t h p u i r ie f d s e r o t y p e As i a l F M DV . S i x h y b r i d o ma c e l l l i n e s t h a t s e c r e t e d mo n o c —
De v e l o p me n t o f an a n t i g e n c a p t u r e EL I SA u s i n g mo n o c l o n a l
a n t i b o d y a g a i n s t f o o t a n d mo u t h di s e a s e v i r u s
Байду номын сангаас
毒I g G为捕 获抗 体 ,选 择 一 株 单抗 ( 1 B 4 ) 用辣 根 过 氧 化 物酶 标 记 ( H R P 一 1 B 4 )作 为检 测 抗 体 ,建 立 了检 测 A s i a l 型F MD V 的抗 原捕 获 E L I S A 方 法。 该 方 法可检 出 0 . 5 8 5 9 t x g纯化 A s i a l 型F MD V 抗原 和 2 . 5×1 0 T C I D 5 0 病 毒 ,对
ZHOU Gu o . hu i ,LI Wa n,ZHAO Le i ,YU Li
( Di v i s i o n o f Li v e s t o c k I nf e c t i o u s Di s e a s e s ,Na t i o n a l Ke y L a b o r a t o r y o f Ve t e r i na r y Bi o t e c h n o l o g y, Ha r b i n Ve t e in r a r y
猪口蹄疫症状及病原学诊断

猪口蹄疫症状及病原学诊断概述口蹄疫的临诊症状主要是口、鼻、蹄、乳头等部位出现水疱。
发疱初期或之前,猪表现跛行。
一般情况下主要靠这些临诊症状可初步诊断,但表现类似症状的还有猪水疱病、猪水疱疹(SVE)、水疱性口炎(VS)。
因此,最终确诊要靠实验室诊断。
病原学诊断1.病毒分离鉴定病毒分离鉴定的首选病料是未破裂或刚破裂的水疱皮(液),对新发病死亡的动物可采取脊髓、扁桃体、淋巴结组织等。
将病料悬液冻融2次,4℃过夜(至少4h)浸毒。
以3000r/min离心15min,除菌后取上清接种细胞。
或加1/3体积氯仿混合摇振数分钟,以3000r/min离心15min,取上清液装入试管中,加棉塞,4℃过夜,氯仿挥发后,接种单层细胞。
每份样品接种2~4瓶细胞,另设对照2~4瓶。
37℃静止培养48~72h。
每天观察记录,对照细胞形态应基本正常或少有衰老。
接种了样品的细胞如出现FMD病毒典型病变(CPE),要及时取出并置-30℃冻存。
无CPE的细胞瓶要观察至72h,其后置于-30℃冻存作为第1代细胞/病毒液再盲传,至少盲传3代。
凡出现CPE 的样品判定为阳性,无CPE的为阴性。
为了进一步确定分离病毒的血清型,将出现CPE的细胞/病毒液用间接夹心ELISA等检测方法定型。
2.补体结合试验(CFT)CFT是根据抗原-抗体系统和溶血系统反应时均有补体参与的原理设计的,以溶血系统作为指示剂,限量补体测定病毒抗原。
当病毒抗原与血清抗体发生特异反应形成复合物时,加入的补体因结合于该复合物而被消耗,溶血系统中没有游离补体将不发生溶血,试验显示阳性。
3.病毒中和试验(VNT)口蹄疫病毒血清型划分的依据是型间无交叉免疫保护性,VNT是型别鉴定的重要方法之一,其检测结果可靠,缺点是动用活毒,且用时较长,只能在专门的实验室中进行,无法推行于普通实验室。
4.反向间接血凝试验FMD反向间接血凝试验是将口蹄疫病毒抗体以化学方法偶联于醛化的绵羊红细胞上,当贴附于血细胞上的抗体与游离的抗原相遇时,形成抗原抗体凝集网络,绵羊红细胞也随之凝集,出现肉眼可见的红细胞凝集现象。
感染口蹄疫病毒猪的组织中抗原定位与超微结构变化

位, 以便 阐明 口蹄疫病 毒在 自然宿 主组 织 中复制 的
超微结构基础 。
1 材 料 及 方 法
11 实验 动 物 的 感 染 .
4月 龄 仔 猪 由本 室健 康 猪 组 提 供 , 3组 各 用 分
薄切 片作 醋酸铀一 柠檬酸铅双染色 。 日立 H 7 0 一0 H
透射电镜下观察 . . 1 . 免疫 过 氧 化 物 酶 标 电镜 3
微术 对 口蹄 疫病 毒感 染细胞 培养 物 的研究 已有一 些报道 , 但对 该病毒感染 动物组织超微病 理学的 描 述 尚少 , 尤其对感染猪 的研究还 未见报道 。
内蒙 古农 牧业 科 学 院百 年 院庆论 文 集—— 畜牧 特 刊
畜牧与饲料科学
2 1 3 (— ) 1 0 9 0 0, 16 7 :9 —1 1
感染 口蹄疫病毒猪的组织中抗原定位与超微结构变化
杨 玉莹 , 国雄 杨成林 王潜渊 , 靳 , , 其那 尔 焦团梅 其木格 , ,
电镜样 品的制备 。健 康对照系活体取样 。
细胞 间 水 肿 细胞 溶 解 , 致 了水 泡 的形 成 导 .
关键 词 : 口蹄 疫病 毒 : : 猪 超做 结 构
中 图 分 类 号 :8 26 ¥Leabharlann 5 .5 文 献标 识 码 : A
.
文 章 顺 序 编 号 :6 2 5 9 ( 0 0 0 - 1 0 0 17 — 1 0 2 1 ) 6 0 9 - 2
(. 1内蒙 古农 牧 业科 学 院动 物 医学 研 究所 , 内蒙 古 特 010 0) 01 呼和 浩 特 0 0 3 ;. 1 0 1 2内蒙 古分 析 测试 中心 电镜 室 , 内蒙 古 呼 和浩
检测口蹄疫病毒抗原的方法

检测口蹄疫病毒抗原的方法(一)口蹄疫反向被动红细胞凝集试验(反向被动血凝)红细胞膜具有吸附抗原或抗体的特性,将提纯的口蹄疫抗体(IgG)在pH4.0醋酸缓冲液中致敏绵羊红细胞,当这种被致敏的红细胞(即红细胞表面均带有口蹄疫抗体),遇到相应的口蹄疫病毒抗原时,便产生抗原抗体的特异性反应,从而使红细胞发生肉眼可见的凝集现象。
该法快速、简便、准确、可同步鉴定出口蹄疫毒型和鉴别口蹄疫、猪水泡病病原。
1.试验材料V型96孔130o血凝滴定板、玻璃吸管(1毫升、5毫升规格)、玻璃中试管(内径15毫米,长度100毫米)、试管架、微量振荡器、微量移液器、塑料咀、玻璃板(与血凝板大小一致)、口蹄疫O、A、C、Asia-I 型、SVD(猪水泡病)反向被动血凝诊断试剂及其配套用的口蹄疫各型、猪水泡病阳性抗原、阴性抗原、稀释液、待检抗原。
2.试验方法(1)稀释待检抗原取中试管8支,横列于试管架上,每管各加入稀释液1 毫升,取待检抗原1毫升加入第1管混匀后从中取出1毫升加入第2管,混匀后取1毫升加入第3管……直至第8管,此时待检抗原的稀释度依次为1:6、1:12、1:24、1:48、1:96、1:192、1:384、1:768。
(2)稀释阴性抗原取中试管1支用记号笔标明“阴抗”字样,加入稀释液390微升,加入阴性抗原10微升,充分混匀,此时阴性抗原的稀释度为1:40。
(3)稀释阳性抗原取中试管20支,横列于管架标明“阳抗”字样,每排4支,(O型4支、A型4支、C型4支、Asia-1型4支、SVD4支)。
每种阳抗第1管,加稀释液4.7毫升,第2~4管各加稀释液0.5毫升。
取O型阳性抗原0.1毫升(100微升)加入第1排的第1管中混匀后取出0.5毫升,加入第1排的第2管并充分混匀,取出0.5毫升加入第1排的第3管混匀后取出0.5毫升加入第1排的第4管并混匀。
其他阳性抗原均按上法稀释,注意每稀释一种阳抗必须更换1支吸管,切勿混杂以免影响反应的特异性。
口蹄疫疫苗说明书

口蹄疫疫苗说明书引言口蹄疫是一种由口蹄疫病毒引起的急性传染病,主要影响偶蹄动物,如牛、羊、猪等。
口蹄疫疫苗是预防口蹄疫的重要措施之一。
本文档将介绍口蹄疫疫苗的使用方法、注意事项以及常见问题解答等内容。
1. 口蹄疫疫苗的简介口蹄疫疫苗是根据口蹄疫病毒的抗原特性制备而成的疫苗,主要包含活病毒疫苗和灭活病毒疫苗两种类型。
疫苗的接种可以增强动物对口蹄疫病毒的免疫力,降低发病率和死亡率。
2. 口蹄疫疫苗的使用方法口蹄疫疫苗的使用方法如下:2.1 接种时间根据动物的生长发育情况和流行病学调查结果,选择合适的接种时间。
一般建议在动物出生后的第三到六个月接种疫苗。
2.2 接种途径口蹄疫疫苗的主要接种途径为肌肉注射和皮下注射。
注射时要注意采用无菌注射器和针头,并保持注射部位的清洁。
2.3 剂量疫苗的剂量应根据动物的品种、体重和年龄确定。
一般情况下,成年牛每头接种5-10毫升的疫苗;幼畜每头接种3-5毫升的疫苗。
2.4 免疫程序一般建议进行初次接种后,随后再进行一到两次的加强免疫。
免疫程序的具体安排应根据动物的生长发育情况和流行病学调查结果确定。
3. 注意事项在使用口蹄疫疫苗时,需要注意以下事项:3.1 贮存条件疫苗应贮存在2-8摄氏度的阴凉处,避免阳光直射。
疫苗在贮存期限内,应定期进行免疫效力检测,并及时淘汰失效疫苗。
3.2 使用前检查使用疫苗前应检查疫苗瓶是否完整,是否有裂纹或渗漏现象。
如发现异常情况,应及时通知生产厂家。
3.3 免疫接种禁忌怀孕的母畜、患有严重系统性疾病的动物以及对疫苗成分过敏的动物禁止接种口蹄疫疫苗。
3.4 免疫反应观察接种疫苗后,应密切观察动物的免疫反应情况。
如发现不适,应及时就医。
4. 常见问题解答4.1 接种口蹄疫疫苗后,动物会出现副作用吗?一般情况下,动物接种口蹄疫疫苗后可能会出现局部红肿、发热等反应,少数个体可能会出现过敏反应。
如果情况严重或持续时间较长,应及时就医。
4.2 口蹄疫疫苗能真正预防口蹄疫吗?口蹄疫疫苗经过临床试验和大规模使用验证,具备较高的预防口蹄疫的效果。
口蹄疫病毒抗原表位和抗原位点的研究进展

口蹄疫病毒抗原表位和抗原位点的研究进展
吴磊;王建科;党江平;焦良奎
【期刊名称】《河南畜牧兽医(市场版)》
【年(卷),期】2017(038)002
【摘要】口蹄疫(Foot—and—Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot—and—Mouth Disease Virus,FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疫病。
侵染对象是猪、牛、羊等主要畜种及其他家养和野生偶蹄动物。
【总页数】3页(P33-35)
【作者】吴磊;王建科;党江平;焦良奎
【作者单位】三门峡市动物疫病预防控制中心,河南三门峡472000;三门峡市动物疫病预防控制中心,河南三门峡472000;三门峡市动物疫病预防控制中心,河南三门峡472000;三门峡市动物疫病预防控制中心,河南三门峡472000
【正文语种】中文
【相关文献】
1.抗原表位的研究方法及口蹄疫病毒抗原表位的研究进展 [J], 张中旺;张永光
2.口蹄疫病毒抗原位点研究进展 [J], 吴海波;邵军军;常惠芸
3.病毒样颗粒作为口蹄疫病毒抗原表位载体的研究进展 [J], 李茜;代军飞;王俊;丁耀忠;马炳;刘永生;张永光;张杰
4.南非2型口蹄疫病毒结构蛋白抗原表位研究进展 [J], 李茜;代军飞;丁耀忠;李国
秀;侯谦;Ashenafi Kiros Wubshet;马炳;张永光;张杰
5.猪口蹄疫病毒抗原位点及其抗原性差异分析 [J], 何永强;盛祖恬;杜青云
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口蹄疫病毒多抗原表位基因融合表达产物的抗原性分析

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A型口蹄疫病毒型特异性抗原的可溶性原核表达及多克隆抗体的制备

性表 达 的 VP 1融 合 蛋 白进 行 纯 化 , 后 用 纯 化 的 蛋 白 免 疫 新 西 兰 大 耳 白兔 制 备 其 多克 隆 抗 体 , E IA、 etr lt 间 然 以 L s W senbo 和 接 免 疫 荧 光 法 分 别 对 多克 隆 抗 体 进 行 鉴 定 。结 果 S - AG 电 泳分 析 显 示 p T 3 aOmp — VP DSP E E -0— T A 1重 组 菌 经 诱 导 后 表 达 一
基础。
关键 词 : 型 I 蹄 疫 病 毒 ; A = I 结构 蛋 白 VP ; 核 表 达 ; 1原 可溶 性 ; mp 信 号 肽 O T 中 图分 类 号 : 3 2 1 文 献 标 识 码 : R 9 .1 A
S l b e e pr s i n o h y -pe ii ntg n o o u l x e so f t e t pe s c fc a i e f FM DV o e o y a e r to f is p l c o a n i o y fs r t pe A nd pr pa a i n o t o y l n la t b d
GAO h n d a , S a — in CHANG i u DU u — h n , Hu— n, y J n z e g CONG o z e g, HAO u —u LI n Gu —h n S J n j n, N To g
( y L b r tr f Anma r lg f iity o rc lu e t t e Ke a o ao y o i lVioo y o M nsr f Ag iut r ,S a e y K
Mr 为 3 0 约 300的 VP 1融 合 蛋 白, 与预 期 结 果 相 符 。 目的蛋 白纯 化 后 , 电泳 图片 上 显 示较 为 清 晰 的 单 一条 带 。W etr lt 在 senbo 分析结果显示, P V 1蛋 白可 与豚 鼠抗 A 型 口蹄 疫 病 毒 阳性 血 清 反应 。用 纯 化 VP 1蛋 白免 疫 新 西 兰 大 耳 白兔 制 备 的 多克 隆抗 体 效 价 达 1: 28 0以上 , 有较 高 的 型特 异 性 , 且 可 与 同型 F 1 O 具 并 MDV 细 胞 培 养 物 中 的病 毒抗 原发 生 反 应 。结 论 制 备 了具 有 高 亲 和 性 和 特 异 性 的 兔 抗 A 型 F V 结 构 蛋 白 VP MD 1多克 隆抗 体 , A 型 F 为 MDV 易 感 动物 的抗 体 筛 查 及 病 原 鉴 定 奠 定 了
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口蹄疫病毒抗原ELISA、病毒分離及RT-PCR敏感性之比較
報告人:黃郁珳 助理研究員(豬瘟研究組)
壹、緒言
口蹄疫(Foot and mouth disease;FMD)是㆒種急性偶蹄類動物傳染病,會造成嚴重之經濟損失。
口蹄疫病毒(FMDV)是屬於正股單鏈RNA病毒,歸類於小核醣核酸病毒科(Picornaviridae)、口瘡病毒屬(Aphthovirus)。
FMDV共㈲O、A、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2、SAT 3等㈦種血清型,各血清型病毒間無交叉免疫保護作用。
而口蹄疫的實驗室診斷以抗原鑑定為主,目前本所使用的口蹄疫抗原鑑定方法包括病毒分離(Virus isolation)、抗原-酵素結合免疫吸附試驗(antigen enzyme-linked immunosorbent assay;Antigen-ELISA)、反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcription-polymerase chain reaction;RT-PCR)等。
病毒分離是根據世界動物衛生組織(O.I.E)出版的「陸生動物的診斷測試及疫苗手冊」㆗口蹄疫的抗原診斷方法進行,以單層BHK21及EBK等㈱化細胞分離試材㆗的口蹄疫病毒。
而抗原-酵素結合免疫吸附試驗則是利用抗原抗體間專㆒性鍵結的㈵性,檢測所稀釋試材㆗的口蹄疫病毒抗原,且鑑定其血清型別。
反轉錄聚合酶連鎖反應是利用㆒對方向相反的寡核苷酸引子,先利用反轉錄酶將待測RNA轉錄成cDNA,再經由DNA聚合酶的作用,反覆進行變性作用、煉合作用及延展作用等㆔步驟,而將㈵定的DNA片段大量複製,從而提升檢測病毒核酸之敏感性達百萬倍之多。
由於口蹄疫疫情的控制,首重快速而準確的診斷。
本所目前使用的㆔種口蹄疫診斷技術均是世界動物衛生組織(O.I.E)出版的「陸生動物的診斷測試及疫苗手冊」㆗所列舉之檢測方法,但是該手冊㆗並未針對其敏感性詳加描述,然而,在初步的診斷結果㆗,敏感性與診斷的準確度相關,若敏感性太低,將造成假陰性的診斷結果。
因此,為了解此㆔種口蹄疫診斷技術之敏感性,乃進行此㆒實驗。
貳、材料與方法
本實驗,我們選擇㆒㈱源㉂細胞培養的口蹄疫病毒及㆒㈱口蹄疫病毒感染的㈬疱㆖皮組織10倍乳劑,分別以含2%胎牛血清之細胞培養液,進行10倍連續稀釋㉃10-8,再分別進行病毒力價回歸試驗、病毒分離、抗原-酵素結合免疫吸附試驗及反轉錄聚合酶連鎖反應等檢測。
㆒、病毒力價回歸試驗
將各稀釋階之病毒及BHK 21㈱化細胞同時加入96孔平底細胞培養盤,置於37℃含5% CO2之細胞培養箱㆗培養兩㆝,再以顯微鏡觀察細胞病變作用(CPE)產生情形,紀錄各稀釋階病毒所產生之CPE數目,再依據Reed 及Muench方法,計算病毒力價。
㆓、病毒分離
將各稀釋階病毒分別接種㉃BHK 21及EBK等㈱化細胞,先置於培養箱㆗感作㆒小時,以磷酸緩衝液(PBS)清洗後加入細胞培養液,置於37℃含5% CO2之細胞培養箱㆗培養,逐㈰觀察㈲無細胞病變作用(CPE)產生。
㆔、抗原-酵素結合免疫吸附試驗
首先將具㈲專㆒性之抗體被覆(coating)於96孔免疫反應盤㆖,再分別加入各稀釋階之病毒,使病毒抗原與免疫反應盤㆖的抗體進行專㆒性鍵結,反應後經以PBS清洗㈥次,再加入另㆒種對病毒抗原專㆒鍵結之檢測抗體,與待測抗原進行鍵結。
之後加入帶㈲酵素之結合體抗體,與檢測抗體鍵結,最後加入酵素受質使之呈色,以肉眼初判其呈色結果後,再以ELISA判讀機讀取反應之吸光值。
當待測試材的平均吸光值減去空白對照組的平均吸光值大於0.1,即表示待測試材為口蹄疫抗原陽性。
㆕、反轉錄聚合酶連鎖反應
取0.2ml各稀釋階病毒分別置入微量管㆗,加入Trizol核醣核酸(RNA)萃取試劑,依據試劑的操作說明進行RNA核酸萃取。
核酸再依據Vangrysperre等1996年發表之方法進行RT-PCR 檢測,反應產物以洋菜凝膠進行電泳分析,再以 UV 燈照射檢視結果,並拍取照片。
參、結果與討論
病毒力價回歸試驗結果,計算後細胞培養口蹄疫病毒其病毒力價為104.89 TCID50/0.05ml,組織10倍乳劑之病毒力價為104.67TCID50/0.05ml;在病毒分離部份,以EBK細胞進行病毒分離,在10-5稀釋階仍出現CPE陽性,且最早可在感染後12小時即可觀察到CPE(表㆒);而以BHK 21細胞進行病毒分離時,只能檢測到10-4稀釋階,並且在感染後24小時才觀察到CPE(表㆓);另Antigen-ELISA方法所檢測之吸光值,經計算後,最高僅能檢測㉃10-1稀釋階(表㆔),意即Antigen-ELISA方法能檢測之力價,在細胞培養口蹄疫病毒之力價為103.89TCID50/0.05ml,在組織10倍乳劑之力價為104.67TCID50/0.05ml;而在RT-PCR方法㆗,不論是以Trizol或Qiagen之商品化核酸萃取套組進行病毒核酸萃取,均可檢測㉃10-6(圖㆒與圖㆓)。
由此結果顯示,本所目前使用的㆔種口蹄疫診斷技術㆗,以RT-PCR的方法最敏感,其次是病毒分離,而以Antigen-ELISA最不敏感。
表㆒、EBK細胞病毒分離結果
-2 -3 -4 -5 -6 C 12hrs + + - - - - 24hrs + + + + - - 36hrs + + + + - - 48hrs + + + + - - C:表示細胞對照組;+:表示CPE陽性;-:表示CPE陰性。
表㆓、BHK-21細胞病毒分離結果
-2 -3 -4 -5 -6 C 12hrs - - - - - - 24hrs + + + - - - 36hrs + + + - - - 48hrs + + + - - - C:表示細胞對照組;+:表示CPE陽性;-:表示CPE陰性。
表㆔、口蹄疫病毒及組織10倍乳劑以Antigen-ELISA檢測之判讀吸光值
口蹄疫病毒 組織10倍乳劑 稀釋倍數
原液
10-10.29750.0975
10-20.0425 0.029
10-30.0225 0.0105
10-4-0.0002 0.012
10-50.0002 0.0075
10-60.0006 -0.0055
10-70.0105 0.0055
10-80.018 0.007
圖㆒、RT-PCR檢測結果(以Qiagen之商品化核酸萃取套組萃取病毒核酸)。
圖㆓、RT-PCR檢測結果(以Trizol試劑萃取病毒核酸)。