同步荧光法测定海水中叶绿素a的含量
荧光法海水叶绿素a传感器设计
荧光法海水叶绿素a传感器设计张可可;闫星魁;陈世哲;刘世萱;齐勇【摘要】基于荧光诱导叶绿素检测原理,应用荧光诱导和微弱信号检测技术,设计了荧光叶绿素a传感器.实验结果表明,叶绿素a的浓度与系统测量值具有很好的线性关系,线性拟合系数为0.999.该传感器具有小型化、易于操作的特点,可实现对海水叶绿素a浓度的原位监测.%We design a chlorophyll-a sensor based on the principle of fluorescence induction with fluorescence induction and weak signal detection.Experiment results show that linear relationship exists between the concentration of chlorophylla and the system measurement value,linear fitting coefficient is 0.999.The instrument that is small and convenient for operation can achieve in-situ monitoring of the concentration of seawater chlorophyll-a.【期刊名称】《山东科学》【年(卷),期】2013(026)003【总页数】4页(P37-40)【关键词】叶绿素a;荧光检测;原位监测;微弱信号检测【作者】张可可;闫星魁;陈世哲;刘世萱;齐勇【作者单位】山东省海洋环境监测技术重点实验室,山东省科学院海洋仪器仪表研究所,山东青岛266001;山东省海洋环境监测技术重点实验室,山东省科学院海洋仪器仪表研究所,山东青岛266001;山东省海洋环境监测技术重点实验室,山东省科学院海洋仪器仪表研究所,山东青岛266001;山东省海洋环境监测技术重点实验室,山东省科学院海洋仪器仪表研究所,山东青岛266001;山东省海洋环境监测技术重点实验室,山东省科学院海洋仪器仪表研究所,山东青岛266001【正文语种】中文【中图分类】TL271+.5;P427.2工农业的快速发展使海洋污染日趋严重，对海水中浮游植物现存量进行实时、有效的监测成为海水污染监测和治理的关键［1］。
水中叶绿素a检测方法-丙酮萃取／萤光分析法
水中葉綠素a 檢測方法－丙酮萃取／螢光分析法NIEA E509.01C一、方法概要水樣經玻璃纖維濾紙過濾後，濾紙以組織研磨器於90%丙酮溶液中研磨萃取葉綠素a，萃取液再以藍光光源的螢光儀測得螢光值，最後依製備之螢光值檢量線求得葉綠素a 濃度。
因使用之標準溶液葉綠素a 濃度，會受各種因子影響而衰減，每批次檢測時應以分光光度計再確認標準溶液之濃度。
二、適用範圍本方法適用於地面水體、飲用水水源水質及海域地面水體之檢測。
單一檢驗室之方法偵測極限估值為0.11 μg/L。
三、干擾(一) 萃取後的萃取液與標準溶液易受溫度、光、酸及濁度所影響，應避免強光照射或接觸酸性物質。
萃取液及標準溶液上機測試時，均須回溫至室溫。
(二) 萃取物如產生紅色光區的螢光，會干擾葉綠素a 的量測。
(三) 樣品中，其他種類葉綠素或胡蘿蔔素濃度過高會有螢光熄滅效應，可將萃取液稀釋以克服之。
四、設備及材料(一) 量筒：100、500 mL或1 L之量筒。
(二) 玻璃纖維濾紙：直徑47 mm或25 mm，平均孔徑約0.7 μm（使用Whatman GF/F或同等級產品）。
(三) 過濾裝置：薄膜過濾裝置。
(四) 真空抽氣裝置：水壓式、吸氣式或手動式，壓力差低於0.2kg/cm2（20 kPa）者。
(五) 鑷子。
(六) 鋁箔紙。
(七) 濾紙存放容器：能遮光，在運送過程及儲存時，可以存放含過濾樣本之濾紙，不受環境污染者。
(八) 運送儲存器：運送過程在4小時以內可使用如旅行冰桶，內放冰塊可維持在0～4℃；若超過4小時，需存放在低於20℃的儲存器內，如液態氮桶、乾冰桶或冰箱之冷凍櫃。
(九) 冷凍櫃：可長期維持在20℃以下。
(十) 組織研磨器：具組織研磨效果者。
(十一) 離心管：錐形底、15 mL，具螺紋蓋。
(十二) 離心機：懸臂式、可容納15 mL錐底離心管、離心力可達675 g以上（g為離心力，註1）。
(十三) 定量瓶：10、25、50或100 mL褐色定量瓶。
叶绿素A的测定
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❖2.水样处理；往水样中加入1%碳酸镁 悬浊液1ml，以预防酸化引起色素溶解。 水样应在低温弱光旳环境下保存。
❖3样品浓缩；采用抽滤方式对水样进行 抽滤，在抽滤器中装好乙酸纤维滤膜， 抽完水样再抽1-2min以降低滤膜上旳 水分, 但抽滤时绝不能抽至真空。
❖4.滤膜干燥；将滤膜放置于冰箱中干 燥3-4h,为样品提取做准备。
❖ 叶绿素不属于芳香族化合物，不溶于 水，但溶于有机溶剂（一般采用丙 酮），叶绿素A呈蓝绿色，叶绿素B呈 黄绿色，两者同步被提取出来。在可 见光旳范围，两者分别在663nm和 645nm处波长有最大吸收。
叶绿素A旳测定措施
❖利用分光光度法，将所得旳上清液在 分光光度计上，用1cm光程旳比色皿， 分别读取在 750nm,663nm,645nm,630n m波优点旳吸光度，并以90%旳丙 酮作空白吸光度测定，对样品吸光度 进行校正。
❖将所测旳相应波长旳吸光度，代入如 下公式计算：
❖ 叶绿素A=（1/V*L）*(11.64*（D663-
D750)-2.16*(D645-D750）+0.10*（D630D750)*V1
❖式中:D为所测旳吸光度
❖ V为水样体积
❖ V1为提取液定容后旳体积
❖ L为比色皿光程
叶绿素A旳测定环节
❖1.采集水样；必须要具有代表性。
叶绿素A旳测定
目录
1
叶绿素A旳测定原理
2
叶绿素A旳测定措施
3
叶绿素A旳测定环节
4
叶绿素A旳测定影响
叶绿素A旳测定原理
❖有机溶剂直接提取浮游生物浓缩样中 旳叶绿素，用分光光度计测定其吸光 度，根据叶绿素旳特定波长.吸收，用 有关公式计算其含量。
荧光法海水叶绿素a传感器设计
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第２ ６卷
第 ３期
２ ０ １ ３年 ６月出版
ＶＯＩ ． ２ ６ ＮＯ． ３ ＪＵ ｎ． ２ ０ １ ３
Ｄ ＯＩ ：１ ０ ． ３ ９ ７ ６ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ２— ４ ０ ２ ６ ． ２ ０ １ ３ ． ０ ３ ． ０ ０ ８
（ Ｓｈ ａ ｎ ｄ ｏ ｎ ｇ Ｐ ｒ ｏ ｖ ｉ ｎ ｃ ｉ ａ ｌ Ｋ ｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｏ ｆ Ｏｃ ｅ ａ ｎ Ｅ ｎ ｖ ｉ ｒ ｏ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｌ Ｍｏ ｎ ｉ ｔ ｏ ｒ ｉ ｎ ｇ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ，Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｏｃ ｅ ａ ｎ ｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈ ｉ ｃ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｍｅ ｎ ｔ ｉ ｏ ｎ ，Ｓ ｈ ａ ｎ ｄ ｏ ｎ ｇ Ａ ｃ ａ ｄ ｅ ｍｙ ｏ ｆ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ，Ｑｉ ｎ ｇ ｄ ａ ｏ ２ ６ ６ ０ ０ １ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
实现对 海水 叶绿 素 ａ浓度 的原位 监测 。
关 键词 ： 叶绿素 ａ ； 荧光检 测 ； 原位 监测 ； 微 弱信 号检 测 中图分 类号 ： Ｔ Ｌ ２ ７ １ ． ５； Ｐ ４ ２ ７ ． ２ 文献标 识码 ： Ａ 文章 编号 ： １ ０ ０ ２ － ４ ０ ２ ６（ ２ ０ １ ３ ） ０ ３ — ０ ０ ３ ７ － ０ ４
导数同步荧光法测定绿藻叶绿素a浓度
摘 要： 建立了绿藻中叶绿素 a 的导数同步荧光检测法。该方法快速、简 便，不 需 要 复 杂 的 前 处 理。 叶 绿 素 a 的 线 性 范
围为 0. 02 ～ 125μg / L，检出限为 0. 25μg / L，回收率为 97. 0% ～ 103. 8% 。
关键词： 绿藻； 叶绿素 a； 导数同步荧光
马永山等： 导数同步荧光法测定绿藻叶绿素 a 浓度
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在该领域采用的叶绿素 a 测定方法常采用分光光 度法和普通荧光 法，因 分 光 光 度 法 不 如 荧 光 法 灵 敏 ，现 在 多 采 用 荧 光 法 。 但 对 绿 藻 来 说 ，其 色 素 种 类较多，特别是存在 叶 绿 素 b，其荧光激发和发射 光谱与叶绿素 a 有严重重叠，再加上噪音信号的干 扰，利用普通荧光光谱很难单独对叶绿素 a 进行定 性 和 定 量 分 析［2］ 。 为 避 免 其 他 色 素 光 谱 的 干 扰 ，人 们多采用同步荧光法对叶绿素 a 的荧光光谱进行 测定［3 － 5］，与常规 荧 光 法 相 比，同 步 荧 光 法 能 够 简 化光谱，减少 瑞 利 散 射 和 拉 曼 散 射 的 干 扰 ，使 谱 峰 变窄，从而提高了测定的选择性和灵敏度。
2 结果与讨论
2. 1 荧光光谱谱图 分别扫描 90% 丙酮空 白、小 球 藻 浸 泡 液 和 叶
绿素 a － 90% 丙 酮 溶 液 的 荧 光 光 谱。采 用 λex = 444nm 扫描荧光发射光谱，λem = 660nm 扫 描 其 荧 光激 发 光 谱 ，Δλ = 216 nm 扫 描 其 同 步 荧 光 光 谱 ； 扣 除 90 % 丙 酮 后 ，得 叶 绿 素 a 标 准 液 的 荧 光 激 发 光 谱 、荧 光 发 射 光 谱 以 及 同 步 荧 光 谱 图 （ 见 图 1） 。
叶绿素a
4. 同化系数的确定
• 用叶绿素a含量估算调查海区初级生产力， 必须求得同化系数Q。 • Q是在光饱和状态下单位时间单位含量叶绿 素-a所同化的碳量。 • 不同类型藻类种群或同一种群在不同环境， 同化系数不一样。
4. 同化系数的确定
• 为得到适用于调查海区的同化系数，最好 用C14示踪法现场测定。 • 在无测定C14示踪法条件下可用黑白瓶作浮 游植物光合作用速率的测定。根据浮游植 物光合过程中释放的氧量换算成有机碳的 固定量，以此固定值除以叶绿素a和培养时 间即为同化系数Q。
4.初级生产力估算
根据表2的数据和实验步骤3的结 果，按⑨式计算该样水域的初级 生产力水平PP。
五、数据处理和问题讨论
• • • • • • 求Fd值和Q值。 计算水样Chl-a和初级生产力PP （两种仪器） 测溶解氧时要注意哪些事项？ 本实验有哪些主要误差来源？ 计算水样A、B平行样Chl-a含量的相对偏差 计算实验B用两种不同荧光计测定Rb求出的 Chl-a的相对偏差 • 注意：实验报告要把计算过程写出来。
Cchl a Fd Rb
⑦
3、初级生产力pp的计算
• Cadée和hegeman（1974）提出计算 初级生产力简化公式： pa E D （8） P 2
• 式中，P－每日现场初级生产力；Pa－表 层水中浮游植物潜在生产力；E－真光层深 度；D－每日光照时间。
3、初级生产力pp的计算
C－①式的结果； V丙酮－丙酮体积； V海水－海水体积。
④
2. 荧光法测定叶绿素a的原理
叶绿素a丙酮萃取液受蓝光（340nm）激发 产生红色荧光，用荧光计在波长670nm处测定提 取液酸化前后荧光值，按⑤式计算：
R V丙酮 Ca(mg / m ) Fd ( Rb Ra ) R 1 V海水
荧光光度法测定地表水叶绿素a的探讨_姜欣欣
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铜绿微囊藻液中提取叶绿素a作为基准物用于荧光光度法测定叶绿素含量
铜绿微囊藻液中提取叶绿素a作为基准物用于荧光光度法测定叶绿素含量崔建升;程玉欣;徐小惠【摘要】用乙醇从铜绿微囊藻中提取叶绿素a并用分光光度法测得提取液中叶绿素a的质量浓度为1 902.5 μg·L-1,以叶绿素a作为标准物质,用荧光光度法测定叶绿素含量.叶绿素a的质量浓度在30～1 800 μg·L-1范围内与荧光强度呈线性关系.试验表明:该提取液在冰箱4 ℃条件下保存,5h内其荧光值的相对误差为±2.5％;在pH 3～9范围内应用时,荧光值的相对误差为±5.0％;在温度5 ℃～30 ℃范围中使用时,荧光值的相对误差为±3.0％,证明提取液的稳定性能满足使用要求.与叶绿素标准品同时测定了5个水样中的叶绿素含量,经t检验所得结果之间无显著差异,说明可用叶绿素a代替叶绿素标准品作为荧光光度法中的基准物质.【期刊名称】《理化检验-化学分册》【年(卷),期】2014(050)010【总页数】4页(P1259-1262)【关键词】铜绿微囊藻;叶绿素a提取液;荧光光度法【作者】崔建升;程玉欣;徐小惠【作者单位】河北科技大学环境科学与工程学院,石家庄050000;河北科技大学环境科学与工程学院,石家庄050000;河北科技大学环境科学与工程学院,石家庄050000【正文语种】中文【中图分类】O657.31水体中的叶绿素浓度反映了水中浮游植物的含量，是评估浮游植物光合作用过程中将无机物质转变为有机物质时有机物生产力的一个重要指标［1－2］。
叶绿素a 是水体藻类的主要光合色素，因此叶绿素a的测定能示踪湖泊的富营养化程度［3］。
叶绿素a的测定方法主要有分光光度法［4－5］和荧光光度法［6］，但分光光度法灵敏度不高，不适用于低浓度的叶绿素a的分析［7］，相较于传统方法，荧光法操作更简便、灵敏度更高，且测定结果与传统方法相比无显著性差异。
近年来，随着荧光技术和传感技术的迅速发展，荧光光度法基于其灵敏度高、检测性好、快速敏捷等特点，在海洋监测领域应用越来越广泛，但测定过程中需使用标准品进行定量分析［8］。
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同步荧光法测定海水中叶绿素 a 的含量
唐尧基1 游文玮2 陈 莹1 李耀群1
(1. 厦门大学化学化工学院与教育部现代分析科学重点实验室 , 厦门 361005 ; 2. 第一军医大学基础部 , 广州 , 510515)
摘 要 以 N ,N - 二甲基甲酰胺为萃取剂 ,利用荧光激发 - 发射波长差 237 nm ,建立了同步荧光法测定海水 中叶绿素 a 含量的新方法 ,其线性范围为 0～200. 0μgΠL ,检出限为 1. 5μgΠL、灵敏 ,其他常见色素不干扰测定的优点 , 。
取适量叶绿素 a 标准溶液置于 10 mL 容量瓶 中 ,用 N ,N - 二甲基甲酰胺稀释至刻度 ,摇匀 ;采用 荧光分光光度计 ,选择适当的激发和发射波长 ,测定 标样的荧光激发和发射光谱以及同步荧光光谱 。
取不同地点 、不同深度的适量海水 (015～2L ) , 加入体积为水样 5 %的饱和碳酸镁溶液 ,用 0145μm 滤膜减压过滤 ,使海水中的浮游植物截留在滤膜上 , 从滤膜上取下后风干 ,再加入 10mL N ,N - 二甲基 甲酰胺萃取剂 ,盖好 ,避光放置 015h ,即可取上清液 进行同步荧光法测定 。
fifty peaks separated , 41 were identified , making up 93. 44 % of t he total content . The analytical result s demon2 st rate t hat t he main constit uent s of t he essential oil of Eu patori u m li n dlcyan u m Dc. are caryop hyllene oxide ,β2 pinene and hexadecanoic acid.
E - mail : yqlg @xmu. edu. cn , 邮编 : 361005
2004 年第 3 期 分 析 仪 器
25
胺配制成 2. 0 mgΠmL 的储备液 ,放置冰箱保存 ;N ,N - 二甲基甲酰胺 (上海试剂一厂) ;碳酸镁 ;实验所用 试剂均为分析纯 。 2. 2 实验方法
24 分 析 仪 器 2004 年第 3 期
of Pharm aceutical an d B iological Prod ucts , Beiji ng , 100050) The essential oil of Eu patori u m li n dlcyan u m DC. f rom Jiangsn Province was analyzed by GC2MS. Of t he
2 实验部分
2. 1 仪器与试剂 F - 4500 型荧光分光光度计 (日本日立公司) ,
扫描速度 240 nmΠmin , 带通 5 nm ; 0. 45μm 醋酸纤 维滤膜 (上海半岛实业有限公司净化器材厂) 。
叶绿素 a ( Sigma 公司) : 用 N , N - 二甲基甲酰
基金项目 : 教育部优秀青年教师资助计划项目 (2001 - 39) 和福建省自然科学基金资助项目 ( E0110008) 。 作者简介 : 唐尧基 ,男 ,1977 年出生 ,博士研究生 ,主要从事分子发光分析工作 。 联 系 人 : 李耀群 ,女 ,1964 年出生 ,教授 ,博士生导师 ,厦门大学化学系 ,主要从事分子发光分析工作 。电话 : (0592) 2185875
关键词 同步荧光 叶绿素 a 海水
1 引 言
海水中叶绿素的含量是海洋生态学中必不可少 的检测项目 ,由叶绿素 (通常为叶绿素 a) 的含量可推 算出海水中浮游植物的总量 ,叶绿素含量还是反映 海洋生态系统中初级生产力的最简便有效的指标 , 对估计海洋生产力有着重要意义[1 ,2] 。此外 ,海水中 叶绿素的含量与海洋渔业及海水养殖业有着密切关 系 ,其分布和变化与海洋环境理化因子有一定的相 关性 。因此 ,准确灵敏地测定叶绿素的含量 ,有利于 海洋渔 业 和 养 殖 业 的 发 展 以 及 海 洋 生 态 环 境 的 保 护 。海水中叶绿素 a 的测定方法主要有分光光度 法[3 ,4 ] 和荧光分析法[5 ] 。前者灵敏度较差 ,存在其他 色素干扰测定的问题 。现在多用荧光法 。测定时 , 先用滤膜过滤海水 ,使海水中含活体叶绿素的各种 浮游植物保留在滤膜上 ,再用适当的溶剂将叶绿素 萃取出来 ,然后利用叶绿素 a 所具有的天然荧光进 行测定 。但采用常规的荧光法 ,因为叶绿素 a 的荧 光激发和发射光谱与其他色素的光谱严重重叠 ,而 干扰测定 ,因此常常需要采用多谱段[7] 或其他技术 。
的叶绿素 b 对叶绿素 a 同步荧光光谱测定的影响 , 结果如图 2 虚线所示 。从图中可以看出 ,在实验条 件下 ,叶绿素 b 的存在对叶绿素 a 的光谱形状和强 度几乎没有影响 。在Δλ= 237 nm 时 ,测定灵敏度 高 ,故本实验选用 237 nm 作为叶绿素 a 同步扫描的 波长差 。
同步荧光法是一种新型荧光分析技术 。该方法 同时扫描荧光分光光度计的激发和发射两个单色器
波长 ,由测得的荧光强度信号与对应的激发波长 (或 发射波长) 构成光谱图 。与常规荧光法相比 ,同步荧 光法能够简化光谱 ,减少瑞利散射和拉曼散射的干 扰 ,使谱峰变窄 ,从而提高了测定的选择性和灵敏 度[7 - 10 ] 。黄贤智等[7 ] 建立了叶绿素 a 和叶绿素 b 的 同步荧光分析法并用于菜叶中两种色素的测定 ;朱 明远等[10] 应用同步荧光法分析了浮游植物中的叶绿 素 。同步荧光法用于海水中叶绿素 a 的测定尚未见 文献报道 。此外 ,叶绿素的分析常以丙酮为萃取剂 , 其耗时长且有可能提取不完全 ,新近出现了更合适 的叶绿素萃取剂[11] 。本文以 N ,N - 二甲基甲酰胺 作为高效萃取剂[11] ,采用同步荧光法建立了测定海 水中 叶 绿 素 a 含 量 的 新 方 法 , 其 线 性 范 围 为 0 ～ 200μgΠL ,检出限为 1. 5μgΠL 。