药学本科分子生物学实验指导
《分子生物学与基因工程实验》课程实验教学大纲(制药工程).
《分子生物学与基因工程实验》课程实验教学大纲(制药工程).《分子生物学与基因工程实验》课程实验教学大纲（制药工程）课程代码：XXX课程性质：专业必修课学时：XX 学时学分：X 学分课程负责人：XXX一、课程目的与任务本课程旨在培养学生对于分子生物学和基因工程理论知识的掌握，能够熟练运用实验技术和仪器仪表进行分子生物学和基因工程研究，并具备独立设计和完成分子生物学实验的能力。
重点培养学生的创新思维和实验操作技能，为制药工程领域的科学研究和工程实践提供有力支撑。
二、参考教材1. 《分子生物学实验指导》（第二版），XXX 主编，XXX 出版社，20XX 年。
2. 《基因工程实验技术教程》，XXX 主编，XXX 出版社，20XX 年。
3. 其他参考图书及相关论文资料。
三、教学大纲及主要内容1. 实验室安全操作规范与实验仪器仪表的基本操作方法介绍- 实验室安全操作规范及急救常识- 常用实验仪器仪表的使用方法与注意事项2. DNA的提取与纯化实验- 细胞裂解与DNA提取方法- DNA纯化与测定方法3. DNA聚合酶链反应（PCR）实验- PCR反应体系的构建和优化- PCR实验的操作技巧与实时监测方法4. 基因克隆实验- 基因片段扩增与连接- 质粒构建与转化菌株筛选5. 基因组DNA库构建与筛选- 基因组DNA库构建技术与流程- 文库筛选方法与数据分析6. RNA提取与逆转录实验- RNA提取与纯化方法- 逆转录反应的优化及相关测定方法7. 蛋白质的表达与纯化实验- 蛋白质表达系统的选择与构建- 蛋白质的纯化与鉴定方法8. 基因工程在制药工程中的应用- 制药工程中的基因修饰技术- 基因工程在药物生产中的应用案例介绍四、实验安排与要求1. 课程实验顺序与安排：- 实验一：DNA的提取与纯化实验- 实验二：DNA聚合酶链反应（PCR）实验- 实验三：基因克隆实验- 实验四：基因组DNA库构建与筛选- 实验五：RNA提取与逆转录实验- 实验六：蛋白质的表达与纯化实验- 实验七：基因工程在制药工程中的应用2. 实验要求：- 学生需按照教师指导的程序和要求，完成实验操作，并提交实验报告。
药学本科分子生物学实验指导
实验项目一：总RNA的提取（必做）一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习总RNA的提取和分析方法。
三、实验内容利用匀浆裂解细胞，采用TRilzol试剂盒抽提RNA去除蛋白质和DNA。
四、实验要求学会提取基因组RNA的方法和操作过程提取RNA时，要特别注意防止RNase的污染，所用玻璃器皿均应用0.1％的二乙基焦碳酸盐(diethyl pyrocarbonate，DEPC)处理。
塑料器材均使用一次性用品，并高压灭菌处理，必要时，也可用0.1%DEPC处理。
五、实验所需仪器设备与试剂仪器：移液器及吸头，电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪等试剂：TRIzol 试剂、氯仿、异丙醇、75% 乙醇（DEPC H2O 配制）、DEPC H2O六、实验原理TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。
最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。
在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。
取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；七、实验步骤1. 颈椎脱臼法处死大鼠，打开大鼠腹腔，取出肝脏2. 将肝脏用ddH2O冲洗几遍，去除血液3. 将大鼠肝脏放入研钵，用剪刀剪成绿豆大小的组织块，4．冷冻离心机冷却到4℃（预冷半个小时）。
准备冰盒。
5．戴口罩，戴手套。
6. 每个EP管中，加入100mg左右的组织，加入1mL Trizol 试剂，7. 超声破碎仪破碎细胞8. 剧烈震荡30秒，室温静置10分钟。
9．加入200uL氯仿（三氯甲烷），剧烈震荡30秒，室温静置5分钟。
10. 离心：4℃，13,000rpm，10min。
11．取新EP管。
将上层水相（约600uL）加入新EP管，12. 再加入500uL异丙醇，室温静置10分钟。
13. 离心：4℃，13,000rpm，10min。
14. 去上清夜，加入20-30 uL DEPC水，55℃10min，以完全溶解RNA。
《分子生物学与基因工程实验》课程实验教学大纲(制药工程)(精)
《分子生物学与基因工程实验》课程实验教学大纲（制药工程）课程名称（中文）分子生物学与基因工程实验课程性质独立设课课程属性专业必修课教材及实验指导书名称《分子生物学实验》学时学分：总学时总学分实验学时45 实验学分 2.5应开实验学期二年级四学期先修课程微生物学、生物化学一．课程简介及基本要求分子生物学与基因工程实验是分子生物学和基因工程基础理论课的配套课程，与理论课密不可分，是医学、药学和生物学重要的基础课之一。
根据课程的性质、任务、要求及学习的对象，将课程内容分二个层次：基础实验与综合设计性实验。
基础实验是学生需要掌握的基本原理与技能。
由于实验的特殊性，必须由教师准备，学生按实验操作进行。
综合设计性实验是当学生有一定的实验基础时，在教师的指导下，拟定实验方法和步骤后进行实验。
经过分层次，多方式教学的训练后，学生应达到下列要求：1．进一步巩固和加深分子生物学和基因工程基础理论知识的理解，提高综合运用所学知识，独立完成实验的能力。
2．能正确使用仪器设备，掌握仪器设备的工作原理。
3．能掌握实验设计的原理，独立完成实验设计，准确分析实验结果，得出正确的结论。
二．课程实验目的要求《分子生物学与基因工程实验》是理论教学的深化和补充，具有较强的实践性，是一门重要的技术基础，可独立设课和非独立设课作为药学、制药工程、生物技术、生物工程和生物制药专业的必修课。
随着分子生物学的发展与拓宽，分子生物学方法与技术显得尤为重要。
因此，熟悉掌握分子生物学方法与技术，特别是基因操作技能的建立对其它很多学科的发展有直接的影响。
分子生物学实验主要目的是使学生掌握研究与应用分子生物学的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术，使学生具有适应于从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的实验技能。
三．适用专业：制药工程四．主要仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌器、干热灭菌箱、空气浴振荡器、恒温水浴箱、电泳仪、凝胶成像系统、电磁炉、微波炉、CO2培养箱、荧光显微镜、核酸蛋白检测仪、PCR仪、酶标仪、高速冷冻离心机、高速离心机等。
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导(总45页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除分子生物学实验指导分子生物学实验课程的内容是从亚克隆一个基因直到最终表达出该基因产物的一个完整的科研项目。
以表达纳豆激酶为例，从已经克隆在pMD-18-T 载体上的纳豆激酶酶原基因上用PCR扩增出837bp的纳豆激酶成熟肽基因片段，与T载体连接后转入DH5菌中筛选鉴定，然后用双酶切下纳豆激酶成熟肽基因片段，插入带有6个组氨酸标签的原核表达载体pET-Trx，在表达菌BL(21)DE3中诱导表达出纳豆激酶蛋白质并用SDS-PAGE鉴定。
整套实验围绕纳豆激酶基因的亚克隆、重组、转化、筛选直到表达这一研究顺序进行操作。
其间共涉及学习约11种基因操作的基本技术，我们按这些操作技术出现的先后顺序分别编为实验一至实验十一。
各个实验之间具有很强的逻辑性和连贯性，前一个实验的结果就是下一个实验的原料。
整套实验设计实际上是一个基因操作实验平台，随时能根据需要更改外源基因和表达载体或进一步扩充实验内容。
我们在每年的教学实践中会不断增加目的基因和表达载体的种类，以便于学生实验小组能够从事不同的项目，减少雷同，增加兴趣。
分子生物学实验的宗旨是让学生在独立实践操作中学习分子生物学的基本研究方法和体会分子生物学研究的严密逻辑和科研理念。
实验教学的组织方式是科研项目式管理，即在教师的总体指导下，在给定的实验材料和实验条件的基础上，让学生独立思考、自行规划实验流程、制定实验计划、准备实验材料、动手操作、整理和分析实验结果，最后完成实验项目，写出实验论文。
因此学生在实验前要认真预习实验内容，结合学过的分子生物学原理，弄懂每一步实验的目的和原理，了解实验的内容和总体实验方案，写出分子生物学大实验《开题报告》，交教师审阅和讨论修改后才能进入实验室操作。
在实验过程中，教师不干涉学生的实验安排和操作程序，仅以导师的身份对学生的实验操作进行现场巡回指导、回答学生的疑问、为学生示范一些高档实验仪器和软件的使用，提供公用的试剂（如酶）等，并对学生的每一步实验结果进行评价和把关。
药学专业分子生物学课程教学实践与探索
分 子生物学是人类从分子水平认识生命世界 ， 从被动适应
自然界到主动改造 自然界 的基础学科 ， 目前 已渗透到药学专业
题， 参与课堂讨论 ， 并提 出自己对某个知识 点的见解 。 ３ 转变实验教 学模 式
够理解所学的分子生物学知识 ， 大部分学生不能真正掌握和理 解， 仅靠死记 硬背来保证考试 过关 ， 导致分 子生物学 知识不能 融入其 他药学学科 中， 不能学 以致用 ， 失去 了开设该课 程的意
义。
相关 的技 术等 ， 通 过动 画和 图片演示 ， 清 晰 明了 ， 易于 学生 理
础， 对实验现象更容易理解 。药 学专业开设的生物学相关课程
较少 ， 分子生 物学理论教学往往 难度较 大 ， 很 多知识 点学生掌
握起来 比较困难 ， 也不容易理解 。 调查发现 ， 仅有少部分学生能
解。多媒体教学极大地提 高了学生学习兴趣 ， 学生从被 动学 习 转变为主动从 网上查 找相关动画或视频进行学习 ， 积极 提出 问
载精美的 图片 、 ｌ ｆ ａ ｓ ｈ动画或教师 自己制作简 易动画等 方式 ， 对
分子生 物学重要知识点进行 多媒体演示 ，吸引学生注意力 ， 让
学生从宏 观上理解一些微观现象。例如 ， Ｄ Ｎ Ａ Ｄ的复制 、 转录和 翻译及其调控等过程 ， 限制性 内切酶 的酶 切过程 ， 与Ｐ Ｃ Ｒ技 术
Ｖ０ １ ． ３ ３ ２ ０ １ ５ Ｎｏ ． １ ５
药 学专业分子 生物学课程教学实践 与探索 彩云
（ 滨州医学院烟台校区药学院 ， 山东 烟台 ２ ６ ４ ０ ０ ３ ）
大学生物教案：分子生物学实验的操作指南
大学生物教案：分子生物学实验的操作指南1. 引言本指南旨在提供大学生物专业的教师和学生们关于分子生物学实验的具体操作步骤与技巧。
分子生物学是现代生命科学研究中至关重要的一部分，通过实验操作可以加深对分子级别生命现象的理解。
在这个指南中，我们将介绍几个常见的分子生物学实验，并提供详细步骤以及相关注意事项。
2. 实验1：DNA提取2.1 实验原理在本节中，我们将介绍DNA提取实验的基本原理和背景知识。
这包括了DNA 提取方法、材料准备和实验目标等内容。
2.2 实验步骤•样品准备：选择适当来源（如水果、血液等）并根据实验要求进行预处理。
•细胞破碎：使用细胞裂解缓冲液和搅拌器将样品细胞破碎。
•DNA沉淀：添加盐和酒精使DNA沉淀出来，并用无菌水洗涤。
•DNA溶解：使用缓冲液溶解沉淀的DNA。
2.3 注意事项•材料应严格按照实验要求选用，确保实验结果的可重复性。
•使用无菌操作技巧以避免外源性DNA污染。
•注意个人安全，佩戴实验室所需的防护装备。
3. 实验2：PCR扩增反应3.1 实验原理在本节中，我们将介绍PCR（聚合酶链式反应）扩增反应的原理和背景知识。
这包括了PCR技术的基本原理、引物设计和酶选择等内容。
3.2 实验步骤•反应体系准备：根据实验目标计算并配置PCR反应所需的试剂和底物。
•DNA模板制备：提取样品中的DNA，并以适当浓度加入到PCR反应中。
•PCR反应设置：配置好PCR反应管，包括引物、酶和缓冲液等。
•PCR条件设定：根据要扩增的序列特点合理设定温度和时间参数。
3.3 注意事项•注意使用不同样本DNA之间相互污染的可能性，避免交叉污染。
•检查引物设计是否正确并符合预期扩增目标。
4. 实验3：凝胶电泳分析4.1 实验原理在本节中，我们将介绍凝胶电泳分析的原理和背景知识。
这包括了DNA迁移速度、凝胶类型选择和标记物设计等内容。
4.2 实验步骤•凝胶制备：根据实验需要配置适当浓度的琼脂糖凝胶。
《分子生物学大实验》实践教学大纲.docx
《分子生物学大实验》实践教学大纲一、课程基本信息1. 课程编号：1117045072. 课程类别：集中实践课程3. 课程性质：必修课4. 学时/学分：2周/2学分5. 先修课程：分子生物学基因工程发酵工程细胞工程6. 适用专业：生物制药本科二、课程目标及学生应达到的能力本课程是生物工程专业的一门必修实践课程。
目前，以分子生物学为基础的基因克隆重组技术已成为现代生物技术的核心。
因此，本实践课程通过从基因分离、目的基因克隆及鉴定等一系列的实验，帮助学生巩固和掌握有关分子生物学和基因工程的相关理论与实验方法，提高学生操作技能、及独立分析问题、解决问题的能力，为学生从事分子生物学技术方面的相关研究奠定实践基础。
具体课程目标及能力要求如下：课程目标1:学生掌握下列主要的分子生物学实验技术：质粒DNA的分离及纯化，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，DNA重组、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化，转化与检测实验等。
课程目标2:使学生熟悉现代分子生物学实验的基本原理、操作技能，能够理论联系实际学会应用，提高学生独立分析问题、解决问题的能力。
本课程采用实验教学方法，2-3人一组操作，结合小组讨论与集体讨论、分子生物学相关实验小技巧介绍等多种教学手段，要求学生认真预习，熟悉实验的内容，了解所用的仪器用具；实验中严格按操作规程进行，仔细观察，及时记录实验现象及结果，认真做好每一天的实验报告：实验结束后仔细分析和总结实验结果，帮助学生通过本实践课程的学习全面地掌握分子生物学的基本实验方法与技能以及实验设计的思路，提高学生从事科学研究的综合素质。
五、课程的考核环节1、评定方法本课程要求学生对每次实验进行认真学习操作，详细观察和记录，实验结束后形成完整实验资料和结果分析，在此基础上撰写完整的实验报告，作为实验考核的主要依据；同时，每次实验由指导老师对操作环节进行等级评定。
实验成绩按照考勤占10%,实验操作占40%,实验报告成绩占50%o 实验成绩分：优、良、中、及格、不及格五级评定。
医学实验教案分子生物学实验设计与操作
酶切反应条件设置
将酶切反应体系置于适当温度下进行反应， 注意反应时间和温度的控制。
酶切产物检测
使用凝胶电泳等方法检测酶切产物的特异性 和大小。
注意事项
选择合适的限制性内切酶和反应条件，避免 非特异性切割和星号活性等问题。
05
数据记录、结果分析与讨论
数据记录表格设计要点
表格标题
简明扼要地概括实验内容和记录重点。
01
细胞裂解
通过化学或物理方法破坏细胞膜 和核膜，释放细胞内的DNA。
02
03
DNA与蛋白质分离
DNA纯化
利用蛋白酶K等酶去除蛋白质， 使DNA与蛋白质分离。
通过酚/氯仿抽提、乙醇沉淀等 方法去除RNA、蛋白质等杂质， 得到纯化的DNA。
PCR扩增技术原理
01
02
03
引物设计
根据目标DNA序列设计特 异性引物，引物与模板 DNA互补配对。
数据分类
根据实验步骤和结果类型，合理划分数据区域， 如原始数据、处理数据、结果分析等。
ABCD
表头设计
包含实验名称、实验者、实验日期等基本信息， 方便追溯和归档。
数据记录规范
统一数据格式和计量单位，确保数据的准确性和 可比性。
结果分析方法论述
统计分析
运用统计学方法对实验数据进行 处理和分析，如描述性统计、方 差分析等，揭示数据间的关系和 规律。
数据分析
学习数据分析方法，能够对实验数据 进行整理、统计和分析，得出科学结 论。
提高实验操作规范性和准确性
实验操作规范
严格遵守实验室安全规定和实验操作规范，确保实验过程的安全和顺利进行。
实验结果准确性
学习提高实验结果准确性的方法，包括优化实验条件、控制实验误差等。
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实验项目一：总RNA的提取（必做）一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习总RNA的提取和分析方法。
三、实验内容利用匀浆裂解细胞，采用TRilzol试剂盒抽提RNA去除蛋白质和DNA。
四、实验要求学会提取基因组RNA的方法和操作过程提取RNA时，要特别注意防止RNase的污染，所用玻璃器皿均应用0.1％的二乙基焦碳酸盐(diethyl pyrocarbonate，DEPC)处理。
塑料器材均使用一次性用品，并高压灭菌处理，必要时，也可用0.1%DEPC处理。
五、实验所需仪器设备与试剂仪器：移液器及吸头，电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪等试剂：TRIzol 试剂、氯仿、异丙醇、75% 乙醇（DEPC H2O 配制）、DEPC H2O六、实验原理TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。
最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。
在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。
取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；七、实验步骤1. 颈椎脱臼法处死大鼠，打开大鼠腹腔，取出肝脏2. 将肝脏用ddH2O冲洗几遍，去除血液3. 将大鼠肝脏放入研钵，用剪刀剪成绿豆大小的组织块，4．冷冻离心机冷却到4℃（预冷半个小时）。
准备冰盒。
5．戴口罩，戴手套。
6. 每个EP管中，加入100mg左右的组织，加入1mL Trizol 试剂，7. 超声破碎仪破碎细胞8. 剧烈震荡30秒，室温静置10分钟。
9．加入200uL氯仿（三氯甲烷），剧烈震荡30秒，室温静置5分钟。
10. 离心：4℃，13,000rpm，10min。
11．取新EP管。
将上层水相（约600uL）加入新EP管，12. 再加入500uL异丙醇，室温静置10分钟。
13. 离心：4℃，13,000rpm，10min。
14. 去上清夜，加入20-30 uL DEPC水，55℃10min，以完全溶解RNA。
15 .-70度保存提取的总RNA。
八、注意事项1．RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA 酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套。
2．RNA提取用品准备：1）普通的玻璃器皿：180℃烘干8小时（玻璃），研钵，小勺，试剂瓶若干个。
2）一次性使用的塑料制品：枪头、EP管等先用DEPC水处理然后高压灭菌，烘干。
3）用烘烤过的药勺称取试剂。
4）用DEPC水配制试剂：0.1%DEPC水：37℃至少处理12小时，高压灭菌15min。
实验结果:成功从植物中分离得到总RNA实验项目二：总RNA的纯化和鉴定（必做）一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习总RNA的纯化和利用琼脂糖电泳鉴定的方法三、实验内容1、通过选择性沉淀RNA分子去除DNA。
2、琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA四、实验要求1、学会纯化植物总RNA的方法2、学会定量、定性检测RNA的方法五、实验所需仪器设备移液器及吸头，水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪,照相机、紫外分光光度计六、实验原理乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。
在阳离子的足量时，可以中和暴露的磷酸残基的电荷，使RNA沉淀。
反复利用乙醇沉淀RNA，可以起到纯化RNA的作用。
由于细胞中70-80%的RNA为rRNA，总RNA电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。
动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA；植物叶片中由于含有大量的叶绿体RNA，可见4条或更多rRNA；细菌rRNA大小分别约为4kb和2kb，分别相当于细菌23S和16S rRNA。
RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。
出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。
高质量的RNA样品，OD260/OD280值（10mM Tris, pH7.5）在2.0左右。
OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。
同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）=OD260×n (稀释倍数)×40七、实验步骤（一）总RNA的纯化1．提取的总RNA，加入75%乙醇500uL洗涤。
2. 离心：4℃，7,500rpm，5min。
3．去上清液，加入无水乙醇500uL洗涤。
4 离心：4℃，7,500rpm，5min。
5．去上清液，空气干燥5-10分钟。
（RNA不可以完全干燥，防止复溶的时候困难）6. 加入20-30 uL DEPC水，55℃10min，以完全溶解RNA。
（二）总RNA质量的检测（完整性的检测）1．称取琼脂糖0.25 g，溶于盛有30ml的 50×TAE（电泳缓冲液）的锥形瓶中；母液为50×TAE: 242 g Tris 碱+ 57. 1 ml 冰醋酸+ 37. 2 g Na2EDTA·2H2O 配成1L 于4 ℃储备)，2．将上述液体置于微波炉中火煮2-3分钟（以琼脂糖完全熔化为准）；加热时应盖上盖子,以减少水份蒸发。
3．在微波的过程中取出电泳板放在干净的一次性手套上，用清洁的挡板封住电泳板的两端形成模具；4．从微波炉中取出已经完全熔化的凝胶溶液，片刻冷却后，用吸管吸一定量的凝胶溶液将电泳板的两边封住；5．向锥形瓶中加入10 mg/ml的溴化乙锭（EB）1 µl（终浓度0.5 µg/ml，EB插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间后，能形成一种在紫外光下发光的络合物，容易观察）,轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液；6．将凝胶溶液匀速倒入电泳模具中（避免出现气泡）；倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。
如果出现明显的气泡，可用刀片赶走，然后插入合适的梳子形成加样孔。
梳齿的位置应在电泳板底面以上0.5 ~ 1.0 mm,这样琼脂糖浇灌到电泳模具中时将形成符合要求的加样孔；7．让凝胶溶液在室温下完全凝结（需1 h左右）后小心将梳齿拔起；待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶。
8．将凝胶安放到电泳槽内，向电泳槽加入电泳缓冲液（1 ´ TAE），要求没过凝胶；因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
9．在干净的一次性手套上混合RNA样品和6 ´ 上样缓冲液（5 µl 样品混合1 µl 6 ´ 上样缓冲液）；10．用枪将样品混合液缓慢加入点样孔内；每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
并加入4ul的DNA marker，作为标记。
11．接好电极插头。
出孔电压为100 v（约2min）；出孔以后电压用70 v，电流在40mA以上；电泳30分钟左右，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳，关上电源。
注意DNA或RNA的泳动方向，防止反方向泳动而跳海。
12 观察：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察电泳胶板。
RNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。
紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。
电泳可见明显两条带，RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，说明抽提的RNA质量高。
常用电泳缓冲液制备：1×TAE: 40Mm Tris-乙酸 1mM EDTA1×TPE: 90mM Tris-磷酸 2mM EDTA0.5×TBE: 45Mm Tris-硼酸 1mM EDTA凝胶加样缓冲液：0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 40%蔗糖或（15%聚蔗糖400 30%甘油）（三） RNA浓度与纯度的检查1．取样本RNA 1 µl加99 µl DEPC处理水（稀释100倍）；2．准备一管DEPC处理水以调零；3．开仪器后部的开关；4．按“RNA”键即为检测RNA；5．取比色皿一个，用DEPC处理水洗一遍；6．加DEPC处理水到比色皿后将比色皿放置在仪器指定位置，按“blank”键调零（放比色皿时注意光面和毛面；手接触毛面，光线透过的应该是光面）；7．取出比色皿，吸干前液；8．吸样品液到比色皿的凹槽内，将比色皿放置在仪器指定位置，按“sample” 键后记录下仪器显示的样品浓度和A260/A280值（其比值可以判断核酸样品的浓度，对于DNA样品比值应在1.6-1.8之间，小于1.6有蛋白质的污染，大于1.8有RNA污染对于RNA比值应在2.0以上，如果小于2.0表示蛋白质或苯酚的污染。
）9．实验结束后将比色皿洗干净备用。
10. 以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）=OD260×n (稀释倍数)×40八、注意事项1．RNA纯化时动作轻柔，防止RNA分子断裂2. 防止RNA酶水解RNA3. 乙醇沉淀RNA时，不可完全干燥，否则不可以RNA难以复溶4. 由于细胞中70-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。
动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA；植物叶片中由于含有大量的叶绿体RNA，可见4条或更多rRNA；细菌rRNA大小分别约为4kb和2kb，分别相当于细菌23S和16S rRNA。
RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。
出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
5.不同组织或细胞中提取RNA预期得率植物叶片100－200 μg/g 叶片动物组织200－400 μg/g 肝脏组织动植物培养细胞5－10 μg/106细胞革兰氏阴性细菌2－10 μg/ml DH5α过夜菌血液3－5 μg/ml 人全血实验结果：电泳可见明显两条带，RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA 亮度的1.5-2.0倍，说明抽提的RNA质量高。
并且紫外分光光度法测得的RNA的浓度和纯度复合实验预期，可以进行下一步的RT-PCR的实验。
实验项目三：PCR基因扩增一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。