水产过敏原的模拟胃肠液消化(精)
海藻酸钠-纳米纤维素胶粒对乳酸菌胃肠液耐受性的影响
海藻酸钠-纳米纤维素胶粒对乳酸菌胃肠液耐受性的影响陈秉彦1,2,3，林晓姿1,2，李维新1,2，林晓婕1,2，郑宝东3，何志刚1,2,*（1.福建省农业科学院农业工程技术研究所，福建福州 350002；2.福建省农产品（食品）加工重点实验室，福建福州 350002；3.福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002）摘 要：为提高海藻酸钠胶粒对乳酸菌在胃肠液中的保护作用，分别利用豆渣纤维素纳米微纤丝与纤维素纳米微晶协同钙离子交联海藻酸钠包埋乳酸菌制备载菌海藻酸钠-纳米纤维素胶粒，并对海藻酸钠-纳米纤维素胶粒进行微观结构观察、傅里叶变换红外光谱分析、低频氢谱核磁共振分析，同时测定载菌海藻酸钠-纳米纤维素胶粒胃肠消化前后的活菌数量，研究海藻酸钠-纳米纤维素胶粒对乳酸菌胃肠液耐受性的影响。
结果表明，纳米纤维素可提高海藻酸钠胶粒的包埋率并减少胶粒表面的孔隙结构，纳米微纤丝较纳米微晶能更好地改善海藻酸钠体系的氢键结合能力，促进海藻酸钠分子链与Ca2＋间形成盐桥，强化凝胶体系的网络结构，从而提高海藻酸钠胶粒的机械强度。
进一步研究发现，海藻酸钠-纳米微纤丝胶粒经胃肠液消化后活菌数下降1.51（lg（CFU/g）），显著低于纳米微晶组（2.16（lg（CFU/g）））以及海藻酸钠组（2.99（lg（CFU/g）））（P＜0.05）。
综上，纳米微纤丝可作为强化海藻酸钠载体的优良壁材提高乳酸菌的胃肠道耐受性。
关键词：海藻酸钠；纤维素；纳米微纤丝；纳米微晶；益生菌；模拟胃肠液Effects of Sodium Alginate-Nanocellulose Beads on the Viability of Lactic Acid Bacteria in SimulatedGastrointestinal FluidCHEN Bingyan1,2,3, LIN Xiaozi1,2, LI Weixin1,2, LIN Xiaojie1,2, ZHENG Baodong3, HE Zhigang1,2,*(1. Institute of Agricultural Engineering and Technology, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350002, China;2. Fujian Province Key Laboratory of Agricultural Products (Food) Processing Technology, Fuzhou 350002, China;3. College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)Abstract: For improved protective effect of sodium alginate (SA) beads on lactic acid bacteria (LAB) exposed to simulated gastrointestinal fluid (SGF), soybean cellulose nanocrystals (SCNC) or cellulose nanofibrils (SCNF), both of which were prepared from soybean okara, in combination with SA was used to encapsulate LAB with calcium ions as a cross-linker.The microstructure of SA-nanocellulose beads was observed, Fourier transform infrared spectroscopy and low frequency nuclear magnetic resonance were analyzed. The effect of SA-nanocellulose beads on the viability of LAB in SGF was investigated by determining the number of viable bacteria before and after gastrointestinal digestion. Nanocellulose could increase the encapsulation efficiency of SA beads and decrease the surface pores. In addition, SCNF was better than SCNC in improving the hydrogen bonding capacity of SA, promoting the formation of a salt bridge between the SA chain and Ca2+, strengthening the structure of the gel network, and ultimately enhancing the mechanical strength of SA beads. Furthermore, SA-SCNF beads provided better protection of LAB after exposure to SGF with a reduction in viable cell count of1.51 (lg(CFU/g)), significantly lower than that observed for SA beads (2.99 (lg(CFU/g))) and SA-SCNC beads (2.16 (lg(CFU/g)))(P < 0.05). These results indicated that SCNF can be applied as a nano-carrier for the encapsulation of LAB to keep it stable in the gastrointestinal tract.Keywords: sodium alginate; cellulose; nanofibrils; nanocrystals; probioticd; simulated gastrointestinal fluidDOI:10.7506/spkx1002-6630-20200214-141中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2021）03-0179-07收稿日期：2020-02-14基金项目：福建省农产品（食品）加工重点实验室开放项目（NJG2018001）；福建省区域发展项目（2019N3008）；福建省省属公益类科研院所基本科研专项重点项目（2019R1032-6）第一作者简介：陈秉彦（1988—）（ORCID: 0000-0002-5583-9722），男，助理研究员，博士，研究方向为食品加工、淀粉及纤维素改性与结构设计。
动物生理学实验课件(五) 鱼类胃肠道运动的观察
1.操作要细心，不要损伤迷走神经；不要损伤迷走神经与 胃的联系。
2.注意经常用任氏液湿润神经和胃肠道，以防止干燥，但 应注意不要让电极短路。
3.每次刺激前后，应仔细比较胃肠道运动的变化情况。
实验五 鱼类胃肠道运动的观察
六.作业与思考
1.胃肠道肌肉有什么生理特性？ 2.胃肠道运动有哪些形式？你观察到有哪些？ 3.比较刺激胃肠道前后胃肠道运动有什么不同，并分析其
实验五 鱼类胃肠道运动的观察
三.实验材料与用具
胡子鲶或乌鳢，培养皿、烧杯、滴管，烧瓶夹，注射 器1支，生理试验多用仪1台，刺激用保护电极1根，普通 电极1根，支架、常用手术器械、蛙板、蛙心夹、污物缸、 纱布1块、棉线、抹布1块，鱼用任氏液，肾上腺素（1： 10000），乙酰胆碱（1：10000）。
7.当胃肠道强烈运动时，将肾上腺素溶液滴加在胃肠道上， 观其反应。完成后用鱼用任氏液清洗腹腔。
8.当胃肠道运动减弱后，将乙酰胆碱溶液滴加在胃肠道上， 观其反应。完成后用鱼用任பைடு நூலகம்液清洗腹腔。
实验五 鱼类胃肠道运动的观察
9.重复第7项内容。
10.按第6项的刺激参数，对胃肠道肌肉直接进行电刺激， 观其反应。
四.实验操作与观察
1.破坏延脑等脑组织。
2.打开腹腔，暴露其内脏。不拨动胃肠道的条件下观察胃 肠道运动形式和运动程度。
实验五 鱼类胃肠道运动的观察
3.拨动胃肠道之后，再观察胃肠道的运动情况。
4.小心地摘除掉肝脏和胆囊。
5.观察食道左侧迷走神经的走向和分布。分离该迷走神经， 穿线备用。
6.电刺激迷走神经，观察胃肠道运动情况的变化。
实验五 鱼类胃肠道运动的观察
课件制作 吴洪流
模拟胃液和肠液的配制
含有胃蛋白酶的模拟胃液，英文全称为Simulated Gastric Fluid，简写为SGF。
有时亦可附有下标“sp”，缩写为SGF[sp]。
其配制方法——
【中国药典】取稀盐酸16.4ml（相当于盐酸3.84ml），加水约800ml与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释成1000ml，即得。
【美国药典】取2.0氯化钠和3.2g胃蛋白酶（标识应为每mg中含800~2500个活度单位），加7.0ml盐酸和水使溶解至1000ml，即得。
该溶液pH值应为1.2。
注释：两配制法有一定差异，研究者可酌情选择。
含有胰酶的模拟肠液，英文全称为Simulated Intestinal Fluid，简写为SIF。
有时亦可附有下标“sp”，缩写为SIF[sp]。
其配制方法——
【中国药典】取磷酸二氢钾6.8g，加水500ml使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH 值至6.8；另取胰酶10g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000ml，即得。
【美国药典】取磷酸二氢钾6.8g，加水250ml使溶解，加0.2mol/L氢氧化钠溶液77ml和500ml水，再加胰酶10g使溶解后，用0.2mol/L氢氧化钠溶液或0.2mol/L盐酸溶液调节pH 值至6.8±0.1，再加水稀释至1000ml，即得。
¾注释：两配制法基本一致。
体外模拟胃肠消化法在食物消化行为中的研究进展
体外模拟胃肠消化法在食物消化行为中的研究进展作者：那吉杨婷赵檑来源：《食品界》2021年第11期摘要：人体胃肠道在食物消化以及营养物质吸收过程中具有极其重要的地位与作用。
但由于在研究人体胃肠功能过程中存在一定的伦理性问题，若使用体外人工模拟胃肠消化系统则能够有效解决此类问题，这将有助于促进胃肠道功能及食物消化行为方面的研究。
基于此，本文以体外胃肠模拟消化概述为切入点，研究并分析体外模拟胃肠消化法在食物消化行为方面的研究现状，展望未来体外模拟胃肠系统的研究与应用进程，以期能为体外模拟消化的研究工作者提供一定的参考。
关键词：体外模拟胃肠系统;人工模拟;食物消化行为引言食物进入人体经咀嚼后，会在胃部中停留约8min-3h，之后才会被运输到小肠或十二指肠，其在胃、肠道的消化情况受pH值、消化酶、无机盐等多种生理因素的影响。
BOUAYED J等人发现胃消化作用能对植物中的多酚和黄酮等抗氧化活性成分的释放和吸收产生较大影响。
不可否认的是，直接使用人体进行消化实验所得数据更为精确，但由于在研究人体胃肠功能过程中存在一定的伦理性问题，研究结果还可能存在个体差异，故难以在实验过程中得到普及。
而人体外模拟消化模型因具有方便易于控制、成本低、可以一次检测多个样品等优点而受到广大科学研究工作者的青睐。
体外模拟胃肠系统（ivHGSS）是基于人类胃肠中各种生理机制在实现对食物消化作用的模拟科学研究体系，是根据人体胃肠消化液的成分及消化环境建立起来的体外消化环境，其能在一定程度上真实模仿人体内环境，主要可适用于替代生物活体的动物实验和科学研究。
该方法于1999年由Garrett等人最早提出，并成功将其应用于测定婴儿食品中β-胡萝卜素的生物利用度。
现阶段，体外胃肠模拟系统主要可分成三类：单相静态、半连续稳态与连续动态，被广泛应用在食物胃肠代谢动力学、食物营养物质生物利用评估及其重金属残留评估及等方面。
本文首先分析了体外模拟胃肠模型的分类，在此基础上针对体外模拟胃肠系统在食物消化行为中的研究进展做出了综述，以期进一步扩大体外模拟胃肠消化系统的应用范围，为体外模拟胃肠系统在食物消化行为方面的研究提供更多的思路与参考。
模拟肠液胃液实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解模拟肠液和模拟胃液的制备方法。
2. 掌握模拟肠液和模拟胃液在实验中的应用。
3. 研究模拟肠液和模拟胃液对蛋白质稳定性的影响。
二、实验原理模拟肠液和模拟胃液是模拟人体胃肠环境的溶液，用于体外研究蛋白质在胃肠环境中的稳定性。
模拟胃液主要模拟胃酸和胃蛋白酶的作用，而模拟肠液则模拟胰酶和肠内环境的作用。
三、实验材料与仪器1. 材料：模拟胃液配方（磷酸二氢钾、盐酸等）、模拟肠液配方（磷酸二氢钾、氯化钠、胰酶等）、蛋白质样品、植物油、试管、振荡器、37℃恒温箱等。
2. 仪器：分析天平、移液器、烧杯、pH计、电热恒温水浴锅等。
四、实验方法1. 模拟胃液的制备（1）称取磷酸二氢钾6.8g，加水500ml使溶解。
（2）用盐酸调节溶液pH值至1.2。
（3）过滤后，将溶液转移至棕色瓶中，备用。
2. 模拟肠液的制备（1）称取磷酸二氢钾6.8g，加水500ml使溶解。
（2）称取氯化钠1.0g，加入上述溶液中。
（3）用胰酶调节溶液pH值至7.0。
（4）过滤后，将溶液转移至棕色瓶中，备用。
3. 蛋白质稳定性实验（1）将蛋白质样品分别加入模拟胃液和模拟肠液中，振荡均匀。
（2）将振荡后的溶液置于37℃恒温箱中，分别孵育1小时。
（3）取出溶液，分别测定溶液中蛋白质的浓度。
（4）比较模拟胃液和模拟肠液对蛋白质稳定性的影响。
4. 植物油消化实验（1）将植物油加入模拟胃液和模拟肠液中，振荡均匀。
（2）将振荡后的溶液置于37℃恒温箱中，分别孵育1小时。
（3）取出溶液，观察植物油的消化情况。
五、实验结果与分析1. 模拟胃液和模拟肠液的制备按照上述方法制备模拟胃液和模拟肠液，并测定其pH值。
结果显示，模拟胃液的pH值为1.2，模拟肠液的pH值为7.0。
2. 蛋白质稳定性实验将蛋白质样品分别加入模拟胃液和模拟肠液中，孵育1小时后，测定溶液中蛋白质的浓度。
结果显示，模拟肠液对蛋白质的稳定性有较好的保护作用，而模拟胃液对蛋白质的稳定性影响较大。
模拟肠道消化实验报告
一、实验目的为了探究食物在人体肠道中的消化过程，本实验采用模拟肠道消化方法，对某种食物进行体外消化实验，观察食物在模拟肠道环境中的消化情况，并分析消化产物。
二、实验材料1. 实验试剂：模拟消化液、酶制剂、pH缓冲液、指示剂等；2. 实验器材：离心机、恒温箱、分光光度计、消化装置、烧杯、试管等；3. 实验样品：某种食物（如面粉、米饭等）。
三、实验方法1. 模拟消化液的制备：根据模拟肠道消化液成分，配制pH值为6.8的缓冲液，加入适量的消化酶，使酶浓度与人体肠道消化酶浓度相当。
2. 样品处理：将实验样品粉碎，过筛，称取适量样品置于烧杯中，加入适量的模拟消化液，搅拌均匀。
3. 模拟消化过程：将烧杯置于恒温箱中，模拟人体肠道温度（37℃），消化时间为2小时。
4. 消化产物检测：消化结束后，将消化液离心，取上清液进行以下检测：（1）蛋白质含量测定：采用双缩脲法检测消化液中的蛋白质含量；（2）淀粉含量测定：采用碘液法检测消化液中的淀粉含量；（3）脂肪含量测定：采用索氏抽提法检测消化液中的脂肪含量；（4）氨基酸含量测定：采用高效液相色谱法检测消化液中的氨基酸含量。
5. 数据分析：将实验数据与对照样品进行对比分析，评估实验样品在模拟肠道环境中的消化情况。
四、实验结果1. 蛋白质含量：实验样品在模拟肠道环境中的蛋白质含量较对照样品降低，说明蛋白质在模拟消化过程中得到了部分分解。
2. 淀粉含量：实验样品在模拟肠道环境中的淀粉含量较对照样品降低，说明淀粉在模拟消化过程中得到了部分分解。
3. 脂肪含量：实验样品在模拟肠道环境中的脂肪含量较对照样品降低，说明脂肪在模拟消化过程中得到了部分分解。
4. 氨基酸含量：实验样品在模拟肠道环境中的氨基酸含量较对照样品增加，说明蛋白质在模拟消化过程中被分解为氨基酸。
五、实验结论本实验采用模拟肠道消化方法，对某种食物进行了体外消化实验，结果表明：1. 实验样品在模拟肠道环境中的蛋白质、淀粉和脂肪含量均有所降低，说明这些营养成分在模拟消化过程中得到了部分分解；2. 实验样品在模拟肠道环境中的氨基酸含量增加，说明蛋白质在模拟消化过程中被分解为氨基酸。
【国家自然科学基金】_模拟胃液消化_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140730
2013年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
科研热词 推荐指数 鳖甲 1 鲢 1 表没食子儿茶素没食子酸酯 1 肝组织蛋白结合率 1 细胞内ph 1 燕麦β -葡聚糖 1 模拟胃肠液 1 模拟胃液 1 模拟肠液 1 小清蛋白 1 寡肽 1 存活率 1 吸附 1 单核细胞增多性李斯特菌 1 加工 1 免疫活性 1 体外消化道模型 1
2012年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
科研热词 推荐指数 生物可及性 2 体外消化模型 2 黄曲霉毒素类 1 高效液相色谱 1 食品安全 1 食品 1 重金属 1 藻胆蛋白 1 葛仙米 1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don) 1 胃肠道存活率 1 模拟胃肠液 1 模拟胃液消化 1 模拟消化液 1 提取性 1 抗氧化 1 抗原性 1 微胶囊 1 土壤 1 喷雾冷凝法 1 变性淀粉 1 体外消化方法 1 低聚异麦芽糖 1 乳酸菌 1 乳清蛋白 1
2008年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
科研热词 结晶结构 稳定性 生物可接受率 牛初乳igf-i 消化道靶向性 消化性能 汞 模拟人工胃肠液 朱砂 抗消化淀ห้องสมุดไป่ตู้薄膜 体外消化透析法
推荐指数 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2009年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8
科研热词 辐照处理 蟹类 肝性脑病 氨 模拟胃液消化 微乳 原肌球蛋白 免疫检测
推荐指数 1 1 1 1 1 1 1 1
2010年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
中国药典人工胃液的配制方法
中国药典人工胃液的配制方法
人工胃液是一种用于模拟胃液的化学品，可以用于研究消化液的化学
性质和胃道消化过程的研究。
以下是配制人工胃液的方法：
配料：
盐酸（HCl）4.1g，氢氧化钾（KOH）6g，人工胃液粉末25g（包括牛
胃黏蛋白、胃蛋白酶、胆汁酸、胰蛋白酶等成分），去离子水1000ml。
步骤：
1. 将HCl溶解在500ml去离子水中。
2. 将KOH溶解在500ml去离子水中。
3.将HCl溶液倒入随后的KOH溶液中，慢慢加入，同时搅拌至pH值
达到1.2。
4.加入25g人工胃液粉末，搅拌至粉末完全溶解。
5. 用去离子水定容至1000ml，搅拌均匀即可。
注意事项：
1.在配制过程中保持室温下进行，并避免发生溅入物的情况。
2.在使用过程中，要严格遵守实验规程，正确佩戴个人防护用品。
3.配制好的人工胃液应该在使用前保持密封，并保存在干燥、阴凉处，避免受到阳光直接照射。
以上是中国药典人工胃液的配制方法，供参考。
太平洋牡蛎肌肉蛋白的模拟胃肠液消化研究
太平洋牡蛎肌肉蛋白的模拟胃肠液消化研究张凌晶;蔡秋凤;刘光明;曹敏杰【摘要】采用美国药典提供的模拟胃液、肠液配方,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(Western blot),分析了太平洋牡蛎肌肉过敏蛋白和非过敏蛋白在体外模拟胃液、肠液消化稳定性的差异.结果表明:在模拟胃液中,非过敏蛋白均能被胃蛋白酶快速降解,而主要过敏蛋白原肌球蛋白在60 min时仍未被完全分解;在模拟肠液中,肌浆蛋白不易被分解,肌原纤维蛋白和原肌球蛋白都能在一定程度上被胰蛋白酶分解.可见,太平洋牡蛎的主要过敏蛋白原肌球蛋白相对于非过敏蛋白具有一定的耐消化性.【期刊名称】《集美大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(016)002【总页数】6页(P81-86)【关键词】太平洋牡蛎;肌肉蛋白;模拟胃肠液;过敏原;原肌球蛋白【作者】张凌晶;蔡秋凤;刘光明;曹敏杰【作者单位】集美大学生物工程学院,福建,厦门,361021;福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室,福建,厦门,361021;集美大学生物工程学院,福建,厦门,361021;福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室,福建,厦门,361021;集美大学生物工程学院,福建,厦门,361021;福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室,福建,厦门,361021;集美大学生物工程学院,福建,厦门,361021;福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室,福建,厦门,361021【正文语种】中文【中图分类】S917牡蛎是世界上第一大养殖贝类，也是我国四大养殖贝类之一.它不仅肉质鲜美，而且其中的蛋白质及糖元含量丰富，具有很高的营养价值，有“海中牛奶”之称.随着研究的深入，发现牡蛎还具有许多生物学活性，如降血压、抗肿瘤、提高机体免疫力等.目前，国内外除了将牡蛎作为海味直接食用外，还开发了大量以牡蛎为主要成分的保健品、食品、调味剂等多种产品［1－2］.与此同时，由于食用牡蛎引起的过敏反应也引起了人们的关注.有研究发现，原肌球蛋白(Tropomyosin，TM)是牡蛎中的主要过敏原［3－4］.但关于牡蛎原肌球蛋白在消化道中的消化稳定性等问题，目前尚未有研究报道.与食物中的其他成分不同，食物过敏原通常被认为更能耐受胃肠液消化，因此，模拟胃肠液消化实验是研究蛋白质致敏性的一个重要手段［5］.本文以太平洋牡蛎(Crassostrea gigas Thunberg)为研究对象，通过体外模拟胃液、肠液消化体系，比较牡蛎的肌浆蛋白、肌原纤维蛋白以及主要过敏原原肌球蛋白在模拟胃肠液中消化稳定性的差异，为牡蛎肌肉蛋白在人体内的消化吸收研究提供理论参考.1.1 原料、试剂与仪器新鲜太平洋牡蛎(Crassostrea gigas Thunberg)，购自厦门集美市场.SDS－PAGE用标准蛋白为Fermentas公司产品;Western blot用标准蛋白从New England BioLab公司购得;羊抗兔IgG－HRP由DAKO公司购得;兔抗中华绒螯蟹原肌球蛋白多克隆抗体由本研究室制备，并经Protein A Sepharose纯化;猪胰蛋白酶为Sigma公司产品;猪胃蛋白酶由本研究室纯化;其他试剂均为国产分析纯.高速冷冻离心机 (Avanti，Beckman，美国);凝胶成像仪 (Vilber Lourmat，法国);组织捣碎机(Kinematica，瑞士);恒温水浴锅 (Memmert，德国);电泳及电转移装置 (Bio－Rad，美国).1.2 实验方法1.2.1 肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的制备肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的制备参照CAO等的方法［6］，并作少量修改.取新鲜牡蛎，去除内脏，剁碎，加入10倍体积(V∶m)的冰冷20 mmol/L Tris－HCl缓冲液 (pH=7.5)，用组织捣碎机捣碎，重复两次 (每次不超过20 s，间隔1 min)，8 000 r/min离心15 min，分别取上清液和沉淀，其中上清液经绢布过滤后即为肌浆蛋白 (4.5 mg/mL).将沉淀重悬于5倍体积的上述缓冲液中并捣碎，再以同样条件离心，取沉淀，如此重复4次.将最后一次离心得到的沉淀溶解在含有0.5 mol/L NaCl的0.1 mol/L Tris－HCl缓冲液 (pH=7.5)中，得到的溶液即为肌原纤维蛋白 (5.0 mg/mL).1.2.2 原肌球蛋白的制备原肌球蛋白的制备参考ISHIKAWA等［3］的方法.取新鲜牡蛎，去除内脏，剁碎，加入1倍体积(V∶m)的冰冷20 mmol/L Tris－HCl缓冲液 (pH=7.5)，用组织捣碎机捣碎，重复2次 (每次不超过20 s，间隔1 min)，得到的悬浮液于100℃加热10 min，用冰水立即冷却到4℃，18 000 r/min离心15 min，经绢布过滤取上清液，即为原肌球蛋白粗提液 (5.4 mg/mL).1.2.3 模拟胃液 (Simulated Gastric Fluid，SGF)消化实验模拟胃液主要参照美国药典［7］的方法配制，并略作修改.在模拟胃液消化实验中，参与消化反应的酶是猪胃蛋白酶，活力为100 U/mg蛋白，1 L模拟胃液中含NaCl 2 g，用HCl调pH值至1.2，酶质量浓度为150 μg/mL.体外模拟胃液消化实验主要参照THOMAS等人［8］的方法，并作适当修改.取两根玻璃试管，其中一管先加入模拟胃液，另一管为对照不加酶，于37℃预热5 min，再将预热后的牡蛎蛋白加入试管中混匀，总反应体系为1 mL，胃蛋白酶与牡蛎蛋白的比例为1∶200，其中蛋白终质量浓度为1.8 mg/mL.分别在反应0，1，2，5，10，15，30，60 min后取出100 μL反应液于1.5 mL离心管中，迅速与30 μL Na2CO3(200 mmol/L)混匀，使其达到碱性，终止反应，并置于冰上.其中0 min样品是将含有胃蛋白酶的SGF先与Na2CO3中和终止反应，再加入同等量的牡蛎蛋白.1.2.4 模拟肠液 (Simulated Intestinal Fluid，SIF)消化实验模拟肠液主要参照美国药典［7］的方法配制，并略作修改.参与反应的猪胰蛋白酶酶活力是30 U/mg 蛋白，1 L缓冲液含6.8 g KH2PO4，用NaOH调pH值至7.5±0.1，酶质量浓度为500 μg/mL.体外模拟肠液流化实验的过程:取两根玻璃试管，其中一管先加入模拟肠液，另一管为对照，于37℃预热5 min，再将预热后的肌肉蛋白加入试管中混匀，总反应体系为1 mL，胰蛋白酶与牡蛎肌肉蛋白的比例为1∶200，其中蛋白终质量浓度为 1.8 mg/mL.分别在反应 0，1，15，30，60，120，180，240 min后取出100 μL反应液于1.5 mL离心管中，在95℃下加热5 min使酶失活终止反应，并置于冰上.其中0 min样品是先将含有胰蛋白酶的SIF在95℃下加热5 min终止反应，再加入同等量的牡蛎蛋白.1.2.5 SDS－PAGE及Western blot 取肌浆蛋白、肌原纤维蛋白或原肌球蛋白100 μL置于1.5 mL的Eppendorf管中，加入33 μL的4×SDS凝胶加样缓冲液［200 mmol/L Tris－HCl(pH=6.8)，质量分数8%SDS，质量分数0.4%溴酚蓝，质量分数40%甘油］，并在95℃下加热5 min后上样于SDSPAGE.凝胶用考马斯亮蓝染色.Western blot按以下的方法进行:电泳结束后将凝胶上的蛋白电转移至硝酸纤维素膜，用质量分数5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗在室温下反应2 h，用TBST［20 mmol/L Tris－HCl(pH=8.0)，0.145 mol/L NaCl，体积分数0.05%Tween20］洗净后，用二次抗体反应1 h.硝酸纤维素膜经TBST充分洗净后，以二氨基联苯胺 (3，3'－diaminobenzidine，DAB)显色.2.1 肌浆蛋白的模拟胃肠液消化图1为肌浆蛋白模拟胃肠液消化情况.由图1a可见，在胃蛋白酶的消化作用下，大部分肌浆蛋白在1 min内即被大量降解，仅能观察到120、25、20 ku处的蛋白质条带.2 min后，120、25 ku蛋白质变化不明显，30 ku蛋白质明显减少，而20 ku蛋白质条带已被降解完全.5 min后就仅能检测到120、25 ku处蛋白质条带.30 min后大分子蛋白质被完全降解，但25 ku蛋白质60 min后仍可见其条带.对照样品经60 min加热也发生了某种程度的降解，尤其是在30～116 ku之间的大部分蛋白质在此条件下发生了自我分解.图1b中，在胰蛋白酶的作用下，肌浆蛋白的降解并不明显，可能是由于肌浆蛋白中含有胰蛋白酶抑制剂［9－10］.同样，对照样品在37℃下反应240 min也没有发生明显变化.2.2 肌原纤维蛋白的模拟胃肠液消化图2为肌原纤维蛋白的模拟胃肠液消化情况.由图2可知，肌原纤维主要含有4种蛋白质，即200 ku的肌球蛋白重链 (myosin heavy chain，MHC)、94 ku的副肌球蛋白 (paramyosin)、45 ku的肌动蛋白 (actin)和16 ku的肌球蛋白轻链(myosin light chain，Myl)，这4种蛋白质在胃肠液的消化作用下均发生了明显的降解.图2a中，肌球蛋白重链1 min后即被大部分降解，产生了约120 ku的降解条带，10 min就被完全分解;副肌球蛋白的消化比肌球蛋白重链慢，直到60 min仍有条带，其降解模式呈阶梯状;肌动蛋白的降解很快，1 min后就发生了95%以上的降解，此后变化不大，到了30 min后几乎被完全降解;在胃蛋白酶作用的60 min内，肌球蛋白轻链逐渐被消化完全.在图2b中，肌球蛋白重链的降解速度慢些，消化60 min后原始条带完全消失;与此类似，副肌球蛋白的稳定性良好，尽管240 min后原始条带被降解完全，但相对分子质量为66 ku的降解产物仍清晰可见;肌动蛋白降解也较为缓慢，其下方的降解蛋白质较为丰富;肌球蛋白轻链1 min时仅有轻微降解，15 min后降解明显，但此后在该相对分子质量处仍有微弱条带.2.3 原肌球蛋白的模拟胃肠液消化2.3.1 原肌球蛋白的粗提由图3a可见，泳道1中的肌浆蛋白，加入DTT至终浓度为0.1 mol/L，120 ku处的细条带消失，而在40 ku处条带变粗，如泳道2所示;泳道3为肌浆蛋白经加热处理后的样品，除去了大部分的蛋白质，但120、40 ku 处蛋白质条带变浓.加入还原剂后，120 ku处的蛋白质基本消失，而在40 ku处的蛋白质明显增加，且40 ku处蛋白质出现两条带.由于原肌球蛋白单体的相对分子质量约为40 ku，并且具有较高的热稳定性，因此，利用抗中华绒螯蟹原肌球蛋白的多克隆抗体，采用Western blot方法对肌浆蛋白条带进行了分析，结果如图3b所示，40、120 ku处蛋白质均发生了特异性免疫交叉反应，验证了其为原肌球蛋白.2.3.2 原肌球蛋白的模拟胃肠液消化图4为原肌球蛋白 (非还原形式)的模拟胃肠液消化情况.由图4可知，在胃蛋白酶与原肌球蛋白比例为1∶200的条件下，随着消化时间的延长，蛋白质不断被分解，但直到60 min仍未被分解完全.而若在同样的酶、蛋白质比例条件下，胰蛋白酶作用1 min就把加热处理后的原肌球蛋白消化完全了，所以稀释比例至1∶3 000，得到了图4b，其中消化1 min后120 ku蛋白质被轻微降解，单体浓度增大.随着时间的延长，120 min后该蛋白质被降解完全，但仍可见其在100 ku处的降解条带，240 min后，单体原肌球蛋白仍不能被消化完全.图5为原肌球蛋白 (还原形式)的模拟胃肠液消化情况.还原状态的原肌球蛋白单体在胃蛋白酶消化作用下，1 min就发生了降解，而后逐渐被分解，得到的电泳图谱呈弥散状态;而在模拟肠液中，原肌球蛋白降解得到的蛋白质条带较清晰，呈阶梯状，说明这两种酶对原肌球蛋白的酶切位点有明显的差别.早期的研究表明，牡蛎的主要致敏原是原肌球蛋白，其可溶于水及低盐溶液中［11－13］.参照ISHIKAWA等［3］的方法，本文对肌浆中的原肌球蛋白进行提取，并采用美国药典的方法进行了模拟胃肠液消化的实验，结果表明，牡蛎原肌球蛋白在胃肠液中的消化稳定性存在很大的差异.有研究报道，软体动物中由于富含副肌球蛋白，导致肌原纤维中肌动蛋白和肌球蛋白含量减少［14］.本实验也发现，牡蛎肌原纤维中的原肌球蛋白含量很低，在提取到的肌原纤维中通过SDS－PAGE 无法观察到.而肌浆中原肌球蛋白含量丰富，且以多种形式存在.单体形式的原肌球蛋白在电泳图谱上呈两条带，这是由原肌球蛋白的α螺旋结构特点所决定的，相似结果也在CAO等［15］的研究中被发现;而120 ku处蛋白质特异性免疫交叉反应相对较弱，其可能不完全是原肌球蛋白聚合体，而是原肌球蛋白与其他蛋白质形成的复合物.在胃液中，原肌球蛋白虽能被胃蛋白酶消化降解，但直到60 min后仍有约30%的蛋白质未被分解;而同样条件下，在肠液中原肌球蛋白能迅速被胰蛋白酶降解完全，将胰蛋白酶浓度稀释一定比例后才得到其对原肌球蛋白的酶解图谱.此处的显著差异可能是由于不同的蛋白酶对原肌球蛋白的酶切位点不同所致.胃蛋白酶A切割肽链的苯丙氨酸或酪氨酸C端［16］，而胰蛋白酶主要对亲水性氨基酸(赖氨酸、精氨酸)的C端具有特异的分解作用［17］.蟹类原肌球蛋白的模拟肠液消化情况与此不同，在胰蛋白酶作用240 min后仍然可见原肌球蛋白的降解条带［18］，这可能是由于不同来源的原肌球蛋白具有差异性，对蛋白酶的耐分解性也不同.本研究通过比较牡蛎肌浆蛋白、肌原纤维蛋白及主要致敏蛋白原肌球蛋白的模拟胃肠液消化差异，显示了绝大多数牡蛎肌肉蛋白在体内易被消化.与非过敏蛋白相比，原肌球蛋白在胃液中具有一定的耐消化性，这可能是该蛋白质是牡蛎的主要致敏原的重要原因之一.【相关文献】［1］叶盛权，吴晖，赖富饶，等.牡蛎蛋白的研制［J］.现代食品科技，2009，25(4):391-393. ［2］谭雯文，周延华，梁海秋，等.牡蛎蛋白的纯化及酶解条件的研究［J］.现代食品科技，2006，22(2):79-82.［3］ ISHIKAWA M，SHIMAKURA K，NAGASHIMA Y，et al.Isolation and properties of allergenic proteins in the oyster Crassostrea gigas［J］.Fisheries Science，1997，63(4):610-614.［4］ ISHIKAWA M，NAGASHIMA Y，SHIOMI K，et al.Identification of the oyster allergen crag 2 as tropomyosin ［J］.Fisheries Science，1998，64(5):854-855.［5］李英华，董杰，李剑虹，等.外源蛋白在模拟胃肠环境中稳定性测定模型初探［J］.卫生研究，2004，33(4):433-436.［6］ CAO M J，SHAO W，LI Y，et al.Identification of a myofibril-bound serine proteinase in the skeletal muscle of silver carp ［J］.Journal of Food Biochemistry，2004，28:373-386.［7］ US Food and Drug Administration.The national formulary:Simulated gastric fluidand simulated intestinal fluid，TS［M］.Washington:Rockville，1995:2053.［8］ THOMAS K，AALBERS M，BANNON G A，et al.A multi-laboratory evaluation of a common in vitro pepsin digestion assay protocol used in assessing the safety of novel proteins［J］.Regulatory Toxicology and Pharmacology:RTP，2004，39(2):87-98.［9］ CAO M J，OSATOMI K，MATSUDA R，et al.Purification of a novel serine proteinase inhibitor from the skeletal muscle of white croaker(Argyrosomus argentatus)［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2000，272:485-489. ［10］ MICKOWSKA B.Purification and characterization of a1-proteinase inhibitor and antithrombinⅢ:major serpins of rainbow trout(Oncorhynchuss mykiss)and carp(Cyprinus carpio)blood plasma ［J］.Fish Physiol Biochem，2009，35:231-240.［11］ BALLEY B Y.Tropmyosin:a new asymmetric protein component of the muscle fibril ［J］.Biochemical Journal，1948，43(2):271-279.［12］ TSAO T C，BAILEY K.The extraction，purification and some chemical properties of actin ［J］.Biochimica et Biophysica Acta，1953，11:102-113.［13］ TAYLOR S L.Molluscan shellfish allergy ［J］.Advances Food and Nutrition Research，2008，54:139-168.［14］纪家笙，黄志斌，杨运华，等.水产品加工手册［M］.北京:中国轻工业出版社，1999:30. ［15］ CAO M J，HARA K，OSATOMI K，et al.Myofibril-bound serineproteinase(MBP)and its degradation of myofibrillar proteins［J］.Journal of Food Science，1999，64(4):644-647.［16］ MIKITA C P，PADLAN E A.Why is there a greater incidence of allergy to the tropomyosin certain animals than to that of others? ［J］.Medical Hypotheses，2007，69(5):1070-1073.［17］ BARRETT A J，RAWLINGS N D，WOESSNER J F.Handbook of proteolytic enzymes ［M］.2nd ed.London:Elsevier，2004.［18］黄园园，刘光明，周利亘，等.蟹类主要过敏原的模拟肠胃液消化及其对过敏原活性的影响［J］.中国食品学报，2009，9(4):15-22.。
模拟胃的实验报告
一、实验目的1. 了解胃的消化功能及其机理。
2. 掌握模拟胃实验的操作步骤和注意事项。
3. 通过实验验证胃酸、胃蛋白酶对食物的消化作用。
二、实验原理胃是人体消化系统中最重要的器官之一，具有储存、混合、消化食物等功能。
胃酸和胃蛋白酶是胃的主要消化酶，它们在消化过程中起着至关重要的作用。
本实验通过模拟胃的消化过程，研究胃酸和胃蛋白酶对食物的消化作用。
三、实验材料1. 实验器材：试管、烧杯、量筒、滴管、酒精灯、温度计、玻璃棒、纱布、剪刀等。
2. 实验试剂：胃酸、胃蛋白酶、淀粉、蛋白质、脂肪等。
四、实验步骤1. 准备实验材料：将淀粉、蛋白质、脂肪等食物分别放入三个试管中，加入适量的水，搅拌均匀。
2. 模拟胃酸分泌：向每个试管中加入适量的胃酸，观察食物的溶解情况。
3. 模拟胃蛋白酶分泌：向每个试管中加入适量的胃蛋白酶，观察食物的消化情况。
4. 观察并记录实验结果：观察食物在胃酸和胃蛋白酶作用下的溶解和消化情况，记录数据。
5. 实验结束后，清洗实验器材，整理实验场地。
五、实验结果与分析1. 实验结果显示，胃酸和胃蛋白酶对食物的消化作用明显。
在胃酸的作用下，食物的溶解度有所提高；在胃蛋白酶的作用下，食物的消化程度明显加深。
2. 通过对比实验，可以得出以下结论：a. 胃酸对食物的消化作用主要是溶解食物，提高食物的溶解度；b. 胃蛋白酶对食物的消化作用主要是分解食物中的蛋白质，使其变为氨基酸；c. 胃酸和胃蛋白酶在消化过程中相互协同，共同完成食物的消化。
六、实验结论1. 胃是人体消化系统中重要的器官，具有储存、混合、消化食物等功能。
2. 胃酸和胃蛋白酶是胃的主要消化酶，它们在消化过程中起着至关重要的作用。
3. 本实验通过模拟胃的消化过程，验证了胃酸和胃蛋白酶对食物的消化作用。
七、实验注意事项1. 实验过程中，应严格遵守实验操作规程，确保实验安全。
2. 实验过程中，注意观察实验现象，及时记录实验数据。
3. 实验结束后，清洗实验器材，整理实验场地。
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水产过敏原的模拟胃肠液消化
近年来,食物过敏问题受到了越来越多人的关注,也被认为是食品安全问题的一个重要方面。
在FAO公布的八大类主要过敏食物中,水产品占了两类。
虽然迄今为止已有不少关于食物过敏机理的研究报道,但食物过敏原是通过什么途径引发过敏的以及食物过敏原在消化道中的稳定性等问题,目前仍不是很清楚。
绝大部分食物过敏原是通过肠胃接触引发的,因此通常认为食物过敏原能耐受肠胃消化。
在转基因食品致敏性的评估方面,已经将模拟胃肠液消化作为评价转基因蛋白致敏性的重要指标。
但是近年来很多研究者对这种评估的有效性提出了质疑。
所以,对该问题仍然需要进一步的研究。
锯缘青蟹(Scylla serrata)、中华绒螯蟹(Eriocheir sisensis)、斑节对虾(Penaeus monodon)和南美白对虾(Penaeus vannamei)等甲壳类动物肉质鲜美,营养丰富,是我国乃至全世界水产养殖业的重要对象。
白鲫鱼(Carassius auratus)、白鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)则是我国淡水养殖具有重要经济价值的优质鱼类。
我国国民由于消费上述水产品而引发食物过敏的报道屡见不鲜,但有关水产过敏原的体外模拟消化鲜见报道。
本研究以上述几种水产品为研究对象,通过模拟胃肠液消化试验分析甲壳类和鱼类主要过敏原(分别为原肌球蛋白和小清蛋白)的消化特性、消化过程中影响消化性的因素、消化对过敏蛋白致敏性的影响等指标,以期为解明水产动物过敏原的消化稳定性以及今后开发低过敏性水产食品提供参考。
首先,参考美国药典描述的模拟胃、肠液配方,测定了纯化的既?嘣?∏虻鞍缀陀憷嘈∏宓鞍自谔逋饽Ｄ馕浮⒊σ合???讨械奈榷ㄐ?以十二烷基
硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(Western blot)进行分析。
结果发现在模拟胃液消化试验中,甲壳类动物原肌球蛋白具有较高的稳定性,而鱼类小清蛋白则能被较快的分解。
在模拟肠液消化试验中,原肌球蛋白则能被不同程度地分解,并产生一些降解条带,而小清蛋白则几乎不被分解。
其次,对甲壳类肌原纤维蛋白和鱼类肌浆蛋白进行体外模拟胃、肠液消化,比较过敏蛋白与其他蛋白消化特性的区别。
结果显示在模拟胃液中,相对于原肌球蛋白,肌球蛋白重链、肌动蛋白能被快速的分解;在模拟肠液消化中,蟹类肌动蛋白比原肌球蛋白要耐降解,而虾类则相反,说明过敏蛋白不一定都比其他蛋白稳定,消化稳定性和过敏性没有必然的联系。
分别采用兔抗蟹类原肌球蛋白、兔抗鱼类小清蛋白特异性多克隆抗体的免疫印迹检测粗提蛋白中过敏蛋白的分解情况,结果表明其他蛋白的存在对甲壳类原肌球蛋白和鱼类小清蛋白的消化特性基本没有影响。
考虑到人体的实际生理情况,研究酶/蛋白比值和pH值对模拟胃液消化过敏蛋白稳定性的影响。
结果表明,提高胃蛋白酶的相对比例有利于原肌球蛋白的降解,但是原肌球蛋白的降解产物具有较强的稳定性,即使当酶/蛋白比值提高到
10/1时,一些稳定的降解条带仍未被完全分解;当pH≥5时,胃液消化会受到抑制,原肌球蛋白和小清蛋白均不会被消化分解。
最后,采用免疫印迹(IgE-immunoblotting)和抑制性酶联免疫吸附试验(Inhibition-ELISA)检测甲壳类原肌球蛋白消化产物的IgE结合情况及消化对蛋白致敏性的影响。
结果发现,模拟胃、肠液消化能在不同程度上降低甲壳类原肌球蛋白的致敏性,其中以胰蛋白酶作用最为明显;胰凝乳蛋白酶对蟹类原肌球蛋白致敏性的降低作用明显强于胃蛋白酶,但是,二者对于虾类原肌球蛋白致敏性的降低作用均不明显。
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致敏性; SDS-PAGE; 免疫印迹; 抑制性ELISA
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