转基因猪研究新进展

转基因猪研究新进展作者：孙武娜日苏来源：《安徽农业科学》2014年第15期摘要由于猪既是重要的经济动物，又是常用的实验动物，并且因为其解剖、组织、生理和营养代谢等方面与人类相似，因此转基因猪的研究意义重大。

纵观转基因猪的发展历史，关键核心技术包括显微注射技术、体细胞核移植技术、精子载体技术、胚胎干细胞介导技术、病毒转染技术、基因打靶、ZFN技术和TALENS技术。

科学家们通过这些技术对猪进行了大量研究，已经在生命科学领域取得了令人欣慰的成就。

关键词转基因猪；基因打靶；锌指核酸酶；RNA干扰；转录激活因子效应物核酸酶中图分类号S828文献标识码A文章编号0517-6611（2014）15-04650-03AbstractPorcine is an important economic animals in livestock， and is commonly used as experimental animals model. The characteristic of pigs in anatomy， tissue physiology and nutrition metabolism is similar with human， therefore， the research about transgenic pigs is significant. Throughout the history of gene transfer in pigs， the key core technologies include：microinjection， somatic cell nuclear transfer， sperm vector， embryonic stem cellmediated， viral transfection， gene targeting， ZFN technology， TALENS technology. By studying these techniques scientists have done has made a lot gratifying achievements in pigs， in life sciences today.Key wordsTransgenic pigs； Gene targeting； ZFN； RNAi； TALENS转基因动物是指借助基因工程技术将外源目的基因导入生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体染色体上稳定整合，能将外源目的基因传给子代的个体，即转基因动物（Transgenic animal）。

1 转基因技术1.1 显微注射技术显微注射法是指将外源基因直接注射到受精卵的细胞核或细胞质中。

核显微注射法也是转基因猪研究中最常用的技术方法。

1985年Hammer等首次利用显微注射技术将人的生长激素基因导入猪受精卵中，获得1头转基因猪，与同窝非转基因猪相比，生长速度显著提高。

Brazitikos利用此方法研究了微型猪的视网膜。

Uchida利用原核显微注射获得了小型转基因猪。

Lee通过胞浆内显微注射也获得了克隆猪。

2014年Ivics等利用胞浆内显微注射技术得到了猪的转基因胚胎[1]。

显微注射在猪的转移率和整合效率为0.98%。

由于该技术效率低，许多研究者分别从基因构件的设计、显微注射各技术环节的改进与完善等方面进行研究，以期提高生产转基因猪的效率。

1.2体细胞核移植技术体细胞核移植（Somatic cell nuclear transplantation，SCNT）技术是先将外源基因整合到供体细胞上，然后将供体细胞的细胞核移植到去核卵母细胞，组成重构胚胎，再将其移植到假孕母体，待其妊娠、分娩后便可得到转基因的克隆猪。

此方法具有相对较大的优越性，转基因效率较高。

Prather等最早从事猪胚细胞核移植工作并获得成功，于1989年获得了8头猪胚细胞核移植后代。

Park等用转染绿色荧光蛋白（EGFP）基因的成纤维细胞和耳上皮细胞作为核供体，获得了转基因仔猪。

Lai等将着床35 d猪胎儿组织剪碎培养获得纤维原细胞，用复制缺陷逆转录病毒作为载体，秋水仙碱处理供体核，通过核移植获得了表达转基因猪[2]。

Nagashima等用猪的胎儿成纤维细胞作为核供体，以体外成熟的猪卵母细胞作为核受体，比较了核移植后电刺激和显微注射对胚胎发育的影响。

2004年日本静冈县家畜实验场和北里大学合作成功克隆了体内含有水母基因的转基因克隆猪。

外源性促红细胞生成素（EPO）和促红细胞生成素衍生物（EPO-DS）对于保护视网膜至关重要。

Cho等利用SCNT 生产出转人红细胞生成素（hEPO）基因的转基因猪。

Lu等利用SCNT法得到能表达红色荧光蛋白（RGFP）的五指山小型转基因猪。

Shimatsu等也利用SCNT方法构建α-1，3半乳糖转移酶基因敲除的猪[3]。

Li等利用SCNT生产的转基因猪的骨髓间质细胞是器官移植很好的供体细胞[4]。

Kong等通过SCNT技术将曲古抑菌素A转移到猪的克隆胚胎中以促进端粒的延伸[5]。

Bao等用含等位基因的成纤维细胞通过体细胞核转移（SCNT）生产出了3头GGTA1基因敲除的仔猪[6]。

1.3胚胎干细胞介导技术及生殖干细胞胚胎干细胞介导技术（Embryonic stem cell-mediated technology）是指将胚胎干细胞（ES）作为一种载体，将外源 DNA导人ES细胞就可以实现由此发育而成的转基因动物。

Tamm等对胚胎干细胞技术操作进行了进一步优化，对利用胚胎干细胞介导技术生产转基因猪起到指导性的作用[7]。

该技术的优点是外源基因的整合率很高，约50%；缺点是不易建立ES细胞系。

猪的胚胎干细胞的分离比较困难，前后有多人进行了研究，但进展不大。

Wheeler等用分离的胚胎干细胞生产转基因嵌合体仔猪。

中国农业科学院冯书堂等多年来也一直从事猪的胚胎干细胞研究工作，在2003年8月成功获得了国内首例嵌合体猪。

随着科技的进步，生殖干细胞（GSC）的遗传修饰逐步成为产生大量转基因动物的另一个新突破口。

1994年Labosky等通过胰岛素样生长因子2受体（IGF2R）基因的甲基化化印记研究了小鼠胚胎生殖细胞（EGC）系和胚胎干细胞（ESC）系区别。

Zeng等借助胚胎生殖细胞（EGC）介导技术将转基因的生殖干细胞（GSC）移植到受体睾丸里产生了供体来源的转基因精子[8]。

1.4病毒转染技术病毒介导载体法是将含有外源基因的动物病毒在感染宿主细胞后重组到宿主的基因组中，其启动子能被宿主细胞识别，可引发导入基因的表达。

病毒介导载体法包括慢病毒载体法和逆转录病毒载体法。

Farre等尝试通过反转录病毒与精子载体技术相结合的方法生产转基因猪。

Cabot等等利用携带EGFP蛋白基因的复制缺陷型MoM LV作为载体转染体外成熟的猪卵母细胞后进行体外受精，获得了表达EGFP的转基因猪。

Lai等用复制缺陷逆转录病毒作为载体亦获得了表达转基因猪。

2003年Clark等利用慢病毒载体生产了1只转基因绵猪只需5只受体母猪，而传统的纤维注射法则需70只受体母猪。

Kim等用慢病毒转导法对猪睾丸细胞及基因组进行了遗传修饰[9]。

Hickey等借助嵌合体腺病毒介导的基因敲除技术获得了高效的生产出了杂合子缺失的转基因猪[10]。

Luo等通过重组腺病毒载体获得了基因组修饰的转基因猪[11]。

Braucher等用复制缺陷型腺病毒给猪进行鼻内接种，使猪获得了一定的保护性免疫能力[12]。

Zhang等结合慢病毒与精子载体技术成功的构建了转基因猪[13]。

2013年，Sun等利用复制缺陷重组腺病毒共表达了猪瘟病毒的Ems和E2基因，最终构建出来的转基因猪可以免受猪瘟病毒的入侵[14]。

最近研究人员开始掀起了将转基因配子病毒载体移植到生殖细胞的研究热潮。

Zeng等已经成功地将以腺病毒（AAV）和慢病毒（LV）为基础的载体有效转入猪生殖干细胞（GSC）中，并在受体公猪上产生转基因的精子[8]。

这不仅展示了腺病毒介导的转导GSC的另一大型动物模型（猪），而且又一次证实了前期慢病毒LV介导生产转基因猪的可行性。

1.5精子载体技术精子载体技术生产转基因动物方法简单，只需将处理好的精子和外源DNA共同孵育后，然后通过体外受精、人工授精转染到胚胎中，从而得到转基因动物。

最近也有研究表明透明带（ZP）的存在加速了精子穿入胞质从而促进体外受精（IVF）的进程，结果表明在猪的体外受精过程中透明带对于精子结合、顶体反应以及IZUMO功能的揭露甚至精卵融合都是很关键的因素[15]。

Lavitrano成功利用精子载体法生产出转染人衰退加速因子（hDAF）基因的仔猪，以用于器官移植的研究。

Chang等利用LB-SMGT（Linker based sperm-mediated gene transfer）得到了转基因猪和小鼠。

Naruse等通过精子载体法获得了转人血清白蛋白（HAS）和绿色荧光蛋白（EGFP）融合的转基因仔猪。

Webster等通过精子载体法生产出同时转绿色（EGFP）、蓝色（EBFP）、和红色（DsRed2）3种荧光的转基因猪。

单精子卵胞浆内显微注射（ICSI）技术是借助显微操作系统将单一精子注射入卵子内使其受精，其受精生理机能与自然受精完全不同，受精的不同机制都会导致ICSI不同的结果，而精子细胞膜、核以及DNA的完整性都会影响受精率及胚胎发育率[16]。

ICSI技术在猪上的应用也十分广泛。

Lai等首次报道利用ICSI方法生产转基因猪。

Yong等通过改良传统的ICSI技术得到了表达EGFP的转基因猪。

Yong等通过ICSI技术比较了离心与电刺激对猪雄原核形成及卵母细胞胚胎发育的影响。

Watanabe等利用ICSI方法研究了经二硫苏糖醇（DTT）处理后的精子注射到卵母细胞后对正常受精、囊胚形成率、雄原核形成以及胚胎发育的影响，结果发现DTT处理30分钟后可以增加正常受精和囊胚形成率及胚胎发育率。

Mayuko等利用ICSI方法也得到了转基因猪。

Watanabe等利用细菌人工染色体（BAC）的构造及胞浆内单精子注射介导的基因转移（ICSI-MGT）方法成功构建了能表达人类蛋白（胶原蛋白和白蛋白）的转基因猪[17]。

这一重大成果意义深远，因为大多数的转基因动物所转入的基因大部分都是编码序列中很小的一段区域，然而Watanabe则首次在猪上成功转入了能够编码2种人类蛋白的完整基因组区域，这对今后人类的器官移植的研究非常有用。

1.6基因敲除基因敲除（Gene knockout），又称为基因打靶（Gene targeting），是通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，精细地定点修饰和改造基因DNA片段的技术。