鸡卵类粘蛋白提取

摘要：本实验利用蛋白质在等电点处会沉淀和丙酮分级沉淀的特征，对样品进行粗处理。在对处理过的样品进行细分离，其方法是凝胶过滤。最后通过SDS—PAGE电泳对粗样品进行细分离和对样品的分子量进行分析。有实验可得鸡卵类粘蛋白的分子质量为32187Da。

关键词：鸡卵类粘蛋白，凝胶过滤，SDS—PAGE

第一章前言

1.1鸡卵类粘蛋白的介绍

鸡卵类粘蛋白是由鸡卵清中制得的一种糖蛋白，它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用，常用与胰蛋白酶的酶学性质的研究。也可将其制成吸附亲合剂，通过亲和层析技术有效分离与纯化胰蛋白酶。

鸡卵类粘蛋白是至今还未能获得单一组分的制品，在电泳行为上常呈现不均一性。目前至少已经获得4种不同组分，它们在抑制胰蛋白酶的性质上和氨基酸的组成上没有多大区别，但是在糖蛋白的糖蛋白部分（主要是D-甘露糖，D-半乳糖，D-葡萄糖胺和唾液酸）的含量上有差别。它们的等电点有一定的范围，是在pH3.9-4.5。相对分子量28000。

鸡卵类粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高溶度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度比较高时迅速失活。鸡卵类粘蛋白除对猪和牛的胰蛋白酶有强烈的抑制作用外，对枯草杆菌蛋白酶也有一定程度上的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，另外对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。

1.2对样品前处理的原理

先由鸡蛋清经三氯乙酸（TCA）-丙酮溶液处理，除去沉淀物，然后经丙酮分级沉淀获得粗品，经分离从而获得粗品。

1.3凝胶过滤的原理

凝胶过滤也称为排阻层析，分子筛层析和凝胶层析。凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，其内部具有许多细微的多孔网状结构。凝胶层析的机理是分子筛效应，当凝胶颗粒在合适的溶剂中浸泡，充分吸液膨胀，然后转入到层析柱内，加入欲分离的混合物，再以同一洗脱液洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而在凝胶颗粒的空隙最先流出柱外，

而小分子物质可以进入凝胶颗粒的内部的多孔网状结构，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质按照顺序分离开。

1.4SDS-PAGE测定鸡卵类粘蛋白的分子量

SDS-PAGE是在要将进行电泳的样品中加入含有SDS和β-巯基乙醇的样品处理液，SDS 即为十二烷基磺酸钠，是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，强还原剂β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。电泳样品加入样品处理液后，要在沸水中处理3-5min，使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。SDS与蛋白质结合后使蛋白质-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS 分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。有上述可以知道，在SDS-PAGE电泳中蛋白质就按分子量的大小分离出来。

第二章鸡卵类粘蛋白的粗提取

2.1 试剂与仪器

试剂：鸡蛋，丙酮，TCA-丙酮：34.5g三氯乙酸溶于38.3ml蒸馏水，再加入100.5ml 丙酮配成150mlTCA-丙酮溶液，5mol/L NaOH，5mol/L HCl。

仪器：低速离心机和高速冷冻离心机，水浴锅，真空干燥仪。

2.2 实验步骤

1.取一只鸡蛋，先讲蛋的一端开一个小洞，然后将蛋放在100ml量筒上，再将蛋的另一端也开一个小洞，蛋清就会流入100ml量筒的里，取45ml蛋清倒入100ml小烧杯里。

2.25-30℃水浴下不断搅拌，慢慢加入等体积TCA-丙酮溶液，此时其pH约为1.5。用5mol/LNaOH将pH调至

3.5，调至3.5后，继续搅拌30min。4℃静止80min，3000rpm离心30min，取上清。边搅拌上清加入4倍体积的预冷的丙酮，4℃静止80min，掉到部分上清，3000rpm离心15min，取沉淀真空干燥。

第三章凝胶过滤层析法纯化鸡卵类粘蛋白

3.1试剂与仪器

试剂：葡聚糖凝胶G-100，pH6.5的0.02mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）。

仪器：电子天平，离心机，柱层析系统：层析柱，核酸蛋白检测仪，部分收集器，微量泵，记录仪。

3.2实验步骤

1.装柱：装柱前，必须用真空干燥器抽空凝胶中的空气，并将凝胶上面的多余的水倒掉，并且柱子底部要留一点水。

2.平衡：用pH6.5的0.02mol/LPBS平衡柱子，平衡是的流速为0.7-0.8ml/min。平衡要充分，否则会影响分离效果。

3.样品处理：取鸡卵类粘蛋白粗制品60-80mg，放入10ml试管中，用0.7ml的PBS溶解，用玻璃棒搅匀后，转移至1.5ml小离心管中，3000rpm离心5min，取上清为样品。

4.上样：把样品加入到层析柱中。

5.洗脱：用PBS进行洗脱，用蓝色葡聚糖和铬酸钾来测出柱子的外水体积和内水体积。

7.绘制洗脱曲线。

第四章SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）测定鸡卵类粘蛋

白的分子质量

4.1 试剂与仪器

试剂：低分子量分子标准蛋白。10%SDS溶液，10%TEMED，10%AP，样品缓冲液，10mmol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液，凝胶贮液，凝胶缓冲液，固定脱色剂，染色液脱色液。

仪器：直流稳压电泳仪，垂直平板电泳槽，凝胶成像系统。

4.2 实验步骤

1.配胶

分离胶（t=12%）浓缩胶

dH2O 3.2ml dH2O 3.2ml

pH8.8缓冲液 2.5ml pH8.8缓冲液 2.5ml

10%SDS 0.1ml 10%SDS 0.1ml

Acr/Bis 4.0ml Acr/Bis 4.0ml

10AP 60ul 10AP 60ul

10%TEMED 60ul 10%TEMED 60ul

总体积10ml 总体积10ml

2.样品处理：称取鸡卵类粘蛋白10-20mg，用蒸馏水溶于10ml试管中，使其浓度为50mg/ml，称取鸡卵类粘蛋白15ul，放入1ml离心管中，在加入30ul样品缓冲液，沸水煮加热3-5min。

3.点样：用微量玻璃针加样，每个孔加入20ul。

4.电泳：开始电泳时的电流为15mA，待样品进入分离胶是，电流改为20mA，当溴酚蓝前面距分离胶0.4厘米时，停止电泳。

5.凝胶分离：点用结束时，取下凝胶模，用塑料或不锈钢药勺小心撬开分离胶的胶板，在用塑料小心把凝胶从胶板上取下来，直接放入含有固定染色液中。

6.固定染色：先用固定脱色液固定20min，在用染色液染色30mim。

7.用固定脱色液脱色，没40min换脱色液，换两次过夜，第二天观察。

第五章结果分析

5.1凝胶过滤结果分析

图1 凝胶过滤层析洗脱图

从图中可以看出，前面两个锋为蓝色葡聚糖的洗脱锋，也就是外水体积V0，当时的洗脱流速为10min收集1ml，所以可知，外水体积是：40min×1ml/min=40ml。第二个锋是重铬酸钾的洗脱锋，是床体积V T，所以其床体积为：140min×1ml/min=120ml。由于凝胶的型号

不是葡聚糖凝胶G-100的所以导致不能很好分离出鸡卵类粘蛋白。从图中可以推断出所用的凝胶可能是G-50或者是交联度更大的凝胶。

5.2 SDS-PAGE结果分析

图2 SDS-PAGE电泳分离图

兔磷酸化酶BSA 兔肌动蛋白牛磷酸酐酶胰蛋白酶抑制剂溶菌酶长度(cm) 1.28 2.50 3.19 4.46 5.90 6.25

迁移率0.2045 0.3994 0.5096 0.7125 0.9425 0.9984

分子量97400 66200 43000 31000 20100 14400

分子量对数 4.9886 4.8209 4.6335 4.4914 4.3032 4.1584

表1 各种标准蛋白的迁移率

图3 标准曲线

由电泳可以测定，样品的长度为4.11cm，迁移率为0.6563，求的分子量对数为4.5377，分子量为32187Da。

第六章讨论

取鸡蛋清是应防治吸入蛋黄，要保证只是蛋清。因为掺了蛋黄就会引入一些杂蛋白，会影响后续的实验。在操作中要时刻注意记录数据。

凝胶过滤一定要把凝胶的型号选择正确，要不然无法分离出有效成分。

在SDS-PAGE凝胶电泳过程中，一定要使样品梳垂直平稳拔出，梳底需水平。在加样时，用微量取样器吸取已处理好的样品20μ1(由于样品需分别单个加入胶孔,而只用1支微量取样器,则在加入第1个样品后,应洗净后才能吸取第2个样品,以免相互污染)。将取样器针头穿过凝胶孔上的缓冲液,使样品落在凝胶面上,推取样器时要慢,用力过猛会使样品扩散到缓冲液中.。剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分，脱色要完全。由本实验可知在样品相同浓度不同的情况下，迁移率相同。由于在提纯过程中有失误，造成粘蛋白浓度较低，且取样时样品较少，造成本实验中的纯品部分出现的条带不太明显。

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鸡卵粘蛋白的提取及猪胰蛋白酶的分离纯化

鸡卵粘蛋白的提取及猪胰蛋白酶的分离纯化摘要：鸡卵类粘蛋白是由鸡卵清中制得的一种糖蛋白，具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究和胰蛋白酶的亲和层析纯化制备。胰蛋白酶Trypsin (Parenzyme) 为蛋白酶的一种，EC3.4.21.4。在脊椎动物中，作为消化酶而起作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。本实验以鸡蛋清为原料，提取猪胰蛋白酶的天然抑制剂鸡卵粘蛋白，并以此为配基，偶联到琼脂糖凝胶上，制成鸡卵粘蛋白的亲和吸附剂，然后通过亲和层析直接从猪胰脏的粗提液中纯化猪胰蛋白酶。并设计了酶活性测定以对纯化过程进行监测和对纯化效果进行评价；设计了电泳实验对制备的猪胰蛋白酶进行纯度和分子量的测定。关键词：鸡卵粘蛋白；胰蛋白酶；亲和层析；分离纯化；酶活性。鸡卵粘蛋白（chicken ovomucoid简称CHOM）是鸡蛋清中的一种糖蛋白，至今还未能获得单一组分，在电泳行为上常呈现不均一性。不同来源的卵类蛋白末端基有很大差别，鸡卵类蛋白N-末端基为丙氨酸。卵类粘蛋白在中性活酸性溶液中对热和高浓度的脲是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定，尤其温度较高是易迅速失活，在50%丙酮或10%三氯乙酸溶液中仍有较好的溶解度。它们的等电点有一定的范围，大致在3.9—4.5之间。鸡卵粘蛋白除对牛和猪的胰蛋白酶有强烈的抑制作用外，对枯草杆菌蛋白酶也有一定的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，对人的胰蛋白酶也无明显抑制作用，因此常用于胰蛋白酶酶学性质的研究。在pH7.8～8.0碱性条件下，CHOM可可逆性的结合胰蛋白酶，以CHOM为配基制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术对胰蛋白酶进行分离纯化。 1材料与方法 1.1材料与试剂市售鲜鸡蛋，10%TCA，1mol/L NaOH ，5mol/L NaOH ，1mol/L HCl，5mol/L HCl，丙酮（A.R），葡聚糖凝胶G-25（ SephadexG-25)，0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液，DEAE-52离子交换纤维素，离子交换剂（0.5mol/L HCl ，0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl ），洗脱液（0.3mol/L NaCl—0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液）,透析袋（φ2.7cm）,标准胰蛋白酶溶液（1mg/ml），0.05mol/L PH7. 8 Tris- HCl缓冲液，BAEE底物缓冲溶液（0.05mol/L CaCl2- 0.05mol/L PH8.0 Tris- HCl缓冲液），1mmol/L BAEE底物溶液，Sepharose 4B，0.5mol/L NaCl，2mol/L NaOH，0.2mol/L PH9.5碳酸钠缓冲液，56%1，4-二氧六环（V/V），环氧氯丙烷（A.R），亲和柱平衡液（0.5mol/L KCl，0.05mol/L CaCl2—0.1mol/L, Tris—HCl PH7.8缓冲液），亲和柱洗脱液（0.5mol/L KCl—0.1mol/L PH2.5甲酸溶液），，无水氯化钙，亲和柱平衡液新鲜猪胰脏，PH2.5-3.0乙酸酸化水，2.5mol/L H2S0 4 （ 0.5mol/L KCl，0.05mol/L CaCl2—0.1mol/L, Tris—HCl PH7.8缓冲液），亲和柱洗脱液：（0.5mol/L KCl— 0.1mol/L PH2.5甲酸溶液）等。 1.2主要仪器与设备 DELTA320型酸度计，离心机，磁力加热搅拌器，恒流泵，紫外检测仪，N2000生化工作站软件，?16×400mm 层析柱，电脑，布氏漏斗、抽滤瓶，循环水真空泵，?10×200mm 层析柱，紫外可见扫描分光光度计，微量可调取液器，石英比色皿（d=1cm），恒温摇床，紫外分光光度计，循环水真空泵，DS型高速组织捣碎机，电子天平，精密试纸

2018西综考研名词解释：粘液样变性

2018西综考研名词解释：粘液样变性 16. 粘液样变性(mucoid degeneration)：是指间质内有粘多糖(透明脂酸等)和蛋白质的蓄积。常见于间叶组织肿瘤、风湿病、动脉粥样硬化和营养不良时的骨髓和脂肪组织等。镜下：间质疏松，有多突起的星芒状纤维细胞散在于灰蓝色粘液样的基质中。 17.病理性色素沉着(pathologic pigmentation)：有色物质(色素)在细胞内外的异常蓄积称为病理性色素沉着。 18.脂褐素(lipofuscin)：是蓄积于胞浆内的黄褐色的微细颗粒，电镜下显示为自噬溶酶体内未被消化的细胞器碎片残体，其中50%为脂质。附睾管上皮细胞、睾丸间质细胞和神经节细胞的胞浆内正常时便含有脂褐素。 19.病理性钙化(pathologic calcification)：在骨和牙齿以外的软组织内有固体钙盐(主要是磷酸钙和碳酸钙)的沉积称为病理性钙化。 20.营养不良性钙化(dystrophic calcification)：继发于局部变性、坏死组织或其他异物(如血栓、死亡的寄生虫卵)内的钙化，称为营养不良性钙化。营养不良性钙化体内钙磷代谢正常。 21.转移性钙化(metastatic calcification)：由于钙磷代谢障碍(高血钙)所致正常肾小管、肺泡壁、胃粘膜等处的多发性钙化，称为转移性钙化，可影响细胞、组织的功能。甲状旁腺功能亢进、骨肿瘤破坏骨组织、维生素D过量摄入等可引发高钙，导致转移性钙化。 22.坏死(necrosis)：是活体内范围不等的局部细胞死亡，死亡细胞的质膜(细胞膜、细胞器膜等)崩解、结构自溶(坏死细胞被自身的溶酶体酶消化)并引发急性炎症反应。 23.核固缩(pyknosis)：表现为核缩小、凝聚，呈深蓝染，提示DNA停止转录。 24.核碎裂(karyorrhexis)：表现为染色质崩解成致密蓝染的碎屑，散在于胞浆中，核膜溶解。 25. 核溶解(karyolysis)：染色质中的DNA和核蛋白被DNA酶和蛋白酶分解，核淡染，只见或不见核的轮廓。 26. 凝固性坏死(coagulative necrosis)：坏死的细胞的蛋白质凝固，还常保持其轮廓残影。这可能是由于死死局部的酸中毒使坏死细胞的结构蛋白和酶蛋白变性，封闭了蛋白质的溶解过程。凝固性坏死好发于心肌、肝、脾、肾等。 27. 干酪性坏死(casepis necrosis)：是彻底的凝固性坏死，是结核病的特征性病变。镜下：不见坏死部位原有组织结构的残影，甚至不见核碎屑，肉眼观：坏死呈白色或微黄，细腻，形似奶酪，因而得名。 28. 坏疽(gangrene)：是身体内直接或间接地与外界大气相通部位的较大范围坏死，并因有腐败菌生长而继发腐败。坏疽分为干性、湿性和气性三种。 29. 液化性坏死(liquefactive necrosis)：是坏死组织因酶性分解而变为液态。最常发生于含可凝固的蛋白少和脂质多的脑和脊髓，又称为软化(malacia)。化脓、脂肪坏死和由细胞水肿发展而来的溶解性坏死(lytic necrosis)都属于液化性坏死。 30. 纤维素性样坏死(fibrinoid necrosis)：曾称为纤维素样变性。发生于结缔组织和血管壁，是变态反应性结缔组织病(风湿病、类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮、结节性多动脉火等)和急进性高血压的特征性病变。镜下，坏死组织成细丝、颗粒状的红染的纤维素(纤维蛋白)样，聚集成片块。纤维素样坏死物质可能是肿胀、崩解的胶原纤维(由于抗原-抗体复合物引发)，或是沉积于结缔组织中的免疫球蛋白，也可能是由血液中渗出的纤维蛋白原转变成的纤维素。

盐析法快速分离鸡蛋清卵白蛋白的初步研究

盐析法快速分离鸡蛋清卵白蛋白 2 摘要：鸡蛋清原液用pH 9.0的Tris-HCl缓冲液稀释5倍，4℃下静置至少6 h，采用30%～80%不同饱和度的硫酸铵分离卵白蛋白，采用Bradford法测定盐析后蛋白含量，SDS-PAGE检测其纯度，结果表明，60%饱和度的硫酸铵分离鸡蛋清卵白蛋白效果较好。关键词：盐析法；鸡蛋清；卵白蛋白鸡蛋中含有丰富的生命必需元素，营养价值较高。随着对鸡蛋生理生化活性研究的不断深入，对鸡蛋的利用逐渐超越简单的初加工阶段，趋向于开发具有较高附加值的生理活性物质[1-2]。蛋清是一种以水为分散介质，以蛋白质为分散相的典型胶体物质，鸡蛋清中的蛋白质含量约为总量的11%，除不溶性的卵黏蛋白外，均为可溶性蛋白质。卵白蛋白、卵铁传递蛋白和溶菌酶是其中3种主要的生物活性蛋白质。卵白蛋白是蛋清中主要的活性蛋白，约占蛋清蛋白质含量的54%。卵白蛋白具有许多功能特性[3]，例如，卵白蛋白对胰蛋白酶有强烈抑制作用，能部分抑制枯草杆菌蛋白酶活性[4]；Fujita用胃蛋白酶水解卵白蛋白，并用RP-HPLC分离出具有血管舒张活性的物质OA358-365[5]；Davalos和Xu等研究发现，卵白蛋白酶降解物具有强抗氧化活性的多肽[6-7]。卵白蛋白是生物化学中一种重要的参考蛋白质，包含所有的必需氨基酸，而且比例合理。高度纯化和结晶的卵白蛋白可以作为载体、稳定剂、封阻剂或标准物等，也可作为营养添加剂应用于食品工业。虽然许多学者对卵白蛋白进行了大量研究，但对其生物学特性和功能的了解仍不够全面，本文采用硫酸铵盐析的方法，对鸡蛋清中的卵白蛋白进行了快速初步分离，为其进一步开发利用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料新鲜鸡蛋，购自超市；卵白蛋白标准品，Sigma公司；硫酸铵分析纯，购自天津市风船化学试剂科技有限公司；透析袋，Amersham Bioscicnccs(SF)Corp。 1.2 试验方法 1.2.1 鸡蛋清原液的制备取新鲜鸡蛋，用双层灭菌纱布过滤得到水样成分，充分搅拌30 min（搅拌剧烈程度以不起泡沫为准）。为了降低鸡蛋清粘度以利于后续试验，取5 mL鸡蛋清用pH 9.0的Tris-HCl缓冲液（50 mL 0.1M Tris-base 溶液与5.7 mL 0.1M HCl溶液混匀后，冷却到室温，加水定容到100 mL）进行5倍稀释，4℃下静置至少6 h。 1.2.2 鸡蛋清卵白蛋白盐析法分离将静置蛋清4℃、10000 rpm离心10 min，取上清液，缓慢多次加入烘干研磨成粉末的硫酸铵，磁力搅拌，使加入粉末溶解，并参考硫酸铵溶液饱和度计算表，使其饱和度分别达到30%、40%、50%、60%、70%和80%。4℃静置过夜，于4℃、12000rpm离心10 min，不同饱和度离心所得沉淀均用pH 9.0的Tris-HCl 缓冲液溶解，并在4℃、0.05 M的Tris-HCl缓冲液中进行透析。期间更换透析液2~4次，透析过夜。 1.2.3 蛋白质检测蛋清盐析蛋白质含量采用Bradford法测定[8-9]：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合则呈现蓝色，蛋白与考马斯亮蓝反应后，溶液在分光光度计波长595 nm处吸光度与蛋白质含量成正比。用BSA蛋白标准液在波长595 nm处测得的吸光值绘制标准曲线（见表1），不同饱和度盐析得到的蛋白样品在595 nm波长测得的吸光值，通过标准曲线得到蛋白含量。采用SDS-PAGE检测盐析后卵白蛋白的纯度。表1 标准曲线配比表处理序号0.01%BSA标准液（μL）蒸馏水（μL）考马斯亮蓝（μL）蛋白质含量（μg/mL） 1 0 200 1000 0 2 40 160 1000 20 3 80 120 1000 40 4 120 80 1000 60 5 160 40 1000 80

生物技术制药

1. 生物技术制药：采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。 2. 抗体：能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 3.疫苗：是指将病原微生物(细菌、病毒、真菌、立克次氏体、支原体、衣原体等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭火或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的免疫制剂。 4.反义核酸：包括反义DNA分子，或由部分RNA和部分DNA形成的RNA-DNA 嵌合分子，以及经高度化学修饰的寡聚核酸类似物。 5.载体分为：质粒载体和λ噬菌体载体。①质粒载体涉及三个要素：复制子、选择标记、多克隆位点、几种质粒载体（克隆载体、表达载体、突变载体、报告载体）②λ噬菌体载体：常用于构建基因组文库和cDNA 文库。λ噬菌体载体通常分为插入型载体和置换型载体，插入型载体是指载体中一个酶切位点用于外源DNA的插入，置换型载体是指外源DNA通过置换载体上非必需序列插入载体。 6.目的基因常用的制备方法：化学合成法、PCR法、基因文库法、cDNA 文库法。 7.基因工程药物制造程序：获得目的基因→构建基因工程菌→工程菌大规模培养→产物分离纯化→除菌过滤→半成品检测→成品加工→成品检测。 8.基因工程菌的培养过程:（1）摇瓶操作：了解工程菌生长的基础条件（温度、pH、培养基组分及C/N），分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响。（2）培养罐操作：确定培养参数、控制方案及顺序。基因工程菌的培养方式:（1）补料分批培养：将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。（2)连续培养：将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后,开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。两阶段连续培养，控制和优化诱导水平、稀释率、细胞比生长速率。（3）透析培养：利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。（4）固定化培养：维持质粒稳定性(5）分批培养:DO-Stat 法：调节搅拌转速和通气速率控制溶氧在 20%，补料的流加速率是关键。Balanced DO-Stat 法：控制溶氧、搅拌转速、糖的流加速率，使乙酸维持在低浓度。控制菌体比生长速率的方法：在最优表达水平获得高密度、高表达。9.基因工程菌发酵工艺的影响因素:（1）培养基的影响（2）接种量的影响（3）温度的影响（4）溶解氧的影响（5）诱导时机的影响（温度、氧、营养）（6）pH的影响（细胞生长期、外蛋白表达期）（7）诱

卵菌的研究进展

卵菌的研究进展草业科学---林艳艳---20104033107 【摘要】卵菌是一类重要的病原生物，可以侵染人类、动物和植物，尽管形态上与真菌类似，但是卵菌在进化上与硅藻和蓝藻亲缘关系更近；多种植物病原菌属于卵菌。卵菌是多分枝的群体,包括60 多种疫霉菌多个活体营养的霜霉菌和100 多种腐霉菌,其中许多是植物病原菌。卵菌在系统进化上有别于其它植物病原真菌,形成一个独立的群体,所致病害给许多农作物和花卉植物造成毁灭性危害。近年来，随着基因组学理论和技术的发展，大量的卵菌基因组相关的数据库被建立。【关键词】卵菌，独立群体，基因，致病一、卵菌的独立性： 1.过去很长时间以来，人们都认为卵菌是真菌，因为卵菌也是丝状体，获得营养的方式也是吸收。但卵菌有很多其独特的特征（表1），其单倍体的卵子接合产生二倍体的卵孢子，而真真菌不产生卵孢子；细胞壁成分是b-葡聚糖和纤维素，而真真菌则是几丁质。卵孢子产生游动孢子，游动孢子的鞭毛有二种类型，一种是以鞭动形式，后导向；而另一种则是茸鞭毛，前导向。所以，又称该群生物为异鞭毛生物。尽管真真菌中的壶菌也产生游动孢子，但其游动孢子的鞭毛只有一种鞭动后导向鞭毛。第四个显著的不同是卵菌的营养细胞一般是多核菌丝，无隔膜，核是二倍体，其生活史中主要是二倍体。而真真菌绝大多数的菌丝有隔膜，一个细胞中含有一个、二个或多个单倍体核。但一些卵菌也能够产生单细胞的菌丝。电镜观察卵菌和真真菌的超显微结构也有明显不同。卵菌的线粒体是管状脊，与异鞭毛藻类相似，而真真菌的线粒体是板片状脊。因此，卵菌应属于无色的藻类而不是真真菌。推测卵菌可能是管藻失去叶绿体后改变为腐生型，但有待进一步的证据。————————文献: ●林奈《自然系统》，贝塞（1950）的分类系统， ●安斯沃思（Ainsworth，1971、1973）的分类系统， ●阿尔克斯（1981）的近代分类系统 ●余永年;卵菌的系统学和分类学[J];武汉植物学研究;1986年04期 2. rDNA序列分析表明，卵菌和异鞭毛藻类或藻类具有共同的祖先，尤其是卵菌中的丝壶菌门（Hyphochytridiomycota）和网黏菌门（Labyrinthulomycota）与藻类的关系更为紧密。藻类中的异鞭毛藻与其他藻类明显不同，其具有和卵菌相同的线粒体管状脊和其他超显微结构。能够进行光合作用的藻类含有叶绿素c和其他色素，这些色素在其他生物中没有。二、卵菌的近代研究进展： 1.卵菌的基因组学研究进展 1.1由于卵菌与真菌以及其他物种不同，尽管其引起的病害十分严重，但其治理，不同行为的生物学机制以及不同发育阶段的分化机制在分子水平上却远未得到研究。近年来，随着生命科学其他领域的理论和科技的发展与渗透，很多研究方法与技术引入到卵菌研究中，如线性DNA转化技术、报告基因的使用、基因沉默及RNAi【3】，随着大豆疫霉（Phytophthorasojae）、橡树疫霉（P.ramorun）全部

人卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)酶联免疫分析试剂盒使用说明

人卵清蛋白特异性IgE（OVA sIgE）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用特异性：本试剂盒可同时检测人OVA sIgE，且与其他抗体无交叉反应。有效期：6个月预期应用：ELISA法半定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中OVA sIgE含量。说明 1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。 2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。 4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。实验原理用OVA包被酶标板，制成固相载体。向微孔中先加入待测样品进行反应，然后再加入辣根过氧化物酶标记抗人IgE抗体进行反应，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的OVA sIgE呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品中OVA sIgE的效价（抗血清最终能显色的最高稀释倍数记为效价）。试剂盒组成及试剂配制 1.酶联板（Assay plate）：一块（96孔）。 2.样品稀释液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。 3.辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgE抗体稀释液（HRP-anti-guinea IgE Diluent）：1×10ml/瓶。 4.辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgE抗体（HRP-anti-guinea IgE）：1×120μl/瓶（1：100）。 5.底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 6.浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 7.终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

生化分离《生物分离与纯化技术》实验题目

2009生化分离工程实验（闭卷考试） 2012生化工艺实验简答题（23选6题，每个实验选一题） 1.在咖啡因的提取实验中，为什么加CaO？ 2.索氏提取装置由哪几部分组成（画图）？工作原理？ 3.咖啡因升华过程中用到了什么装置？咖啡因的升华结晶应注意哪些操作？ 4.茶叶咖啡因的提取实验中，浓缩去除乙醇的过程中用到了哪些设备？ 5.动物脏器DNA提取实验中，蛋白质是如何去除的？ 6.动物脏器DNA提取实验中，如何鉴定DNA的纯度？ 7.动物脏器DNA提取实验中，RNA是怎样去除的？ 8.动物脏器DNA提取实验中，氯仿-异戊醇的作用是什么？离心后分哪几层？ 9.动物脏器DNA提取实验中，为什么用0.1M NaCl-SSC间歇式的搅拌猪肝？ 10.离子交换层析分离鸡卵黏蛋白实验（上半部），粗提过程中用哪种试剂去除杂蛋白？用哪种试剂沉淀得到粗黏蛋白？ 11.鸡卵黏蛋白离子交换层析实验中，所用树脂是哪种？树脂为什么预处理，如何预处理？ 12.DEAE-纤维素是哪种类型离子交换剂，如何预处理DEAE-纤维素？ 13.在鸡卵黏蛋白离子交换层析实验中固定相、流动相分别是什么？ 14.简要画出离子交换层析系统中所用设备组成图。 15.离子交换层析分离鸡卵黏蛋白实验（上），为什么提取液的pH在3.5左右？ 16.离子交换层析分离鸡卵黏蛋白实验（下），pH6.5的用意何在？ 17.简述反胶团萃取甘薯中淀粉酶的实验原理 18.栀子黄提取实验中，栀子苷是如何去除的？为什么用此方法去除？ 19.栀子黄提取实验中，如何鉴定藏花红素中栀子苷的去除情况？ 20.栀子黄提取实验中，吸附前为什么将滤液稀释至240mL乙醇？ 21.栀子黄提取实验中，吸附前为什么将滤液pH调至3 22.大蒜SOD提取实验中，是如何去除杂蛋白的？PBS与丙酮的作用分别是什么？ 23.大蒜SOD提取实验中，用哪种方法测定SOD活性？其原理是什么？ 1. 在咖啡因的提取实验中，为什么加CaO? 答:吸取水分，防止咖啡因蒸汽溶于水；中和鞣酸； 2. 索氏提取装置有哪几部分组成？（画图）

生化技能大赛

鸡卵类粘蛋白的分离与纯化一．前言鸡卵类粘蛋白（chicken ovomucoid 简称CHOM）是鸡卵清中含有的一种糖蛋白，在电泳行为上常出现不均一性，这主要与糖蛋白的分子量不均一性有关。鸡卵类粘蛋白具有强烈抑制胰蛋白酶的作用，是胰蛋白酶的天然抑制剂，胰蛋白酶抑制剂是一类具有胰蛋白酶抑制作用的物质，该类物质的来源不同 ,其活性和作用的酶也不同，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究[1]。另外对牛和猪的胰蛋白酶有强烈的抑制作用，对枯草杆菌蛋白酶也有一定的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。另外,蛋白酶抑制剂可以抑制昆虫的生长和发育，近年来在抗虫基因工程得到了广泛的应用[2]。CHOM在中性和偏酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，在50%丙酮或10%三氯乙酸溶液中仍有较好的溶解度，但在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度较高时易迅速失活。由于CHOM在PH7.8～8.0的碱性条件下具有很强的结合胰蛋白酶的活性而且这种结合是可逆的，可以CHOM为配基制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效的分离和纯化胰蛋白酶。二．实验目的：了解并熟悉鸡卵类黏蛋白的提取、分离、纯化的方法,掌握凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析、透析纯化等方法分离纯化鸡卵类黏蛋白的原理及操作方法。三．实验原理鸡卵类黏蛋白的提取【基本原理】鸡卵黏蛋白是一种糖蛋白，存在于鸡蛋清中，在10％三氯乙酸或50％丙酮溶液中有较好的溶解度。选择合适的pH值，三氯乙酸浓度和丙酮浓度，可以从蛋清中获得鸡卵黏蛋白的粗提液。凝胶层析对鸡卵类黏蛋白提取液的纯化【基本原理】蛋白质混合溶液在经过凝胶层析柱时，大分子蛋白质沿颗粒间的空隙以较快的速度流过凝胶柱，最先流出柱外。而盐或其他小分子物质因进入凝胶颗粒的微孔中向下移动的速度较慢，所以最后流出柱外。因此通过凝胶层析可以达到除去小分子物质的目的。鸡卵类黏蛋白纯品的制备【基本原理】初步提取得到的鸡卵类粘蛋白，经DEAE-纤维素离子交换柱进一步纯化，可除去少量的杂蛋白。得到鸡卵类粘蛋白的纯溶液。然后经透析、丙酮沉淀、抽真空干燥即可获得鸡卵类粘蛋白纯品。四．材料与试剂仪器：紫外分光光度计电泳仪摇床离心机核酸蛋白检测仪透析袋铁架台层析柱恒温水浴锅电磁炉 4℃冰箱微量取液器材料与试剂：鸡蛋尺子三氯乙酸丙酮磷酸盐缓冲液 DEAE-纤维素 0.3M氯化钠-0.02M PH6.5磷酸盐缓冲液 1M 氯化钠-0.02M PH6.5磷酸盐缓冲液 0.05M PH8.0 Tris-Hcl BAEE 胰蛋白酶 BSA Marker 0.05%考马斯亮蓝R250染色液7%乙酸

兔(Rabbit)卵清蛋白特异性IgG(OVA-sIgG)-NEWA

上海笃玛生物科技有限公司本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断兔（Rabbit）卵清蛋白特异性IgG（OVA-sIgG） ELISA 检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被抗卵清蛋白特异性IgG（OVA-sIgG）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的卵清蛋白特异性IgG （OVA-sIgG）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。样品收集、处理及保存方法1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。 3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。 4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。自备物品 1.酶标仪（450nm） 2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL 3.37℃恒温箱操作注意事项1. 试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。3. 浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。4. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

湖南省株洲市2018届高三年级教学质量统一检测理综生物部分(word)

株洲市2018届高三年级教学质量统一检测(二) 理科综合能力测试一、选择题：本题共13小题，每小题6分。在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。 1.下列关于细胞的叙述正确的是 A.小分子物质和离子可通过被动运输或主动运输进入细胞 B.细胞分裂的方式有三种：有丝分裂、无丝分裂、减数分裂 C.所有细胞正常代谢都离不开其生活的稳定的内环境 D.癌细胞是动物细胞内具有自养能力并能快速增殖的细胞 2.精卵识别后，精子头部的顶体释放顶体酶使卵子外部结构溶出一条孔道，以利于精卵融合成受精卵。下列叙述正确的是 A.顶体内储存的顶体酶是在精子的溶酶体中合成的 B.精卵细胞的识别、结合与膜表面蛋白质的结构特异性有关精子游冋卵子所需的能量来自线粒体内葡萄糖的氧化分解 D.卵子既供质基因又供核基因，所以受精卵中遗传物质的嘧啶和嘌呤数目不相等 3.下列关于实验的叙述正确的是 A.观察人体口腔上皮细胞的线粒体时，用健那绿染色前需要先用盐酸处理 B.在“生物体维持PH稳定的机制”的实验中，清水组和缓冲液组都可作为对照组 C.不可用绿色植物成熟叶肉细胞进行细胞失水和吸水的观察实验 D.可用澄清的石灰水检验CO2的生成，来探究酵母菌的呼吸方式 4.下列关于植物生长素及其类似物的叙述，不正确的是 A.豌豆幼苗切段中乙烯的合成受生长素浓度的影响 B.生长素是色氨酸在植物体内经过一系列反应转变而来的 C.去掉顶芽，侧芽附近的生长素来源暂时受阻，浓度降低 D.生长素浓度超过最适浓度，随其浓度升高对植物生长抑制作用增强 5.乳头瘤病毒(HPⅤ)是一种球形DNA病毒，人感染可诱发宫颈癌等恶性肿瘤。研究机构为评估某种HPV疫苗的效果，在志愿者中进行接种。一段时间后，统计宫颈癌出现癌前病变(癌变前病理变化，可发展为恶性肿瘤)的人数，结果见表。下列分析错误的是 A.Bl组人群中出现癌前病变比例显著高于A1组，可推测HPV是诱发癌前病变因素

实验五鸡蛋清中卵类粘蛋白分离纯化及活性测定

实验五鸡蛋清中卵类粘蛋白分离纯化及活性测定一、实验目的和要求 1）设计从鸡蛋清中分离纯化卵类粘蛋白的试验方案。 2）设计从鸡蛋清中分离纯化卵类粘蛋白的试验操作条件。 3）了解离子交换层析系统中四大组成部分和实验主要影响因素。 4）掌握熟离子交换层析层析仪的使用方法和注意事项。 5）学会凝胶预处理和装柱、平衡、洗脱的方法。二、器材和试剂 1．实验器材：层析系统LH-2，（包括自动部分收集器，紫外检测仪，记录仪，蠕动泵，梯度混合器）6套；高速离心机；布氏漏斗；烧杯500ml,100ml，各16个；移液管1、2、5ml, 各16个；量筒50ml,100ml，各16个；真空干燥器 4个；滴管， 16个；滤纸φ120， 1盒； 2．实验试剂： (1)丙酮；(2)1％，pHl.15的三氯乙酸：将称取的三氯乙酸置烧杯内，加入2／3总体积的蒸馏水溶解，用6mol／L氯氧化钠调至约pHl.15，静置约1h，然后在pH计上校正至pH 1.15，最后补充水到所配体积；(3)0.02 mol／L,pH6.5，磷酸盐缓冲液；(4)0.5mol／L 氯化钠—0.5mol／L氢氧化钠溶液；(5)0．5mol／L盐酸溶液；(6)0.3mol/L氯化钠—0.02mol ／L磷酸盐缓冲液，pH6.5；(7)底物缓冲液：0.05mol／L，Tris-HCl缓冲液，pH8.0，内含2.22mol／L的氯化钙；(8)2mmol／1,BAEE底物：用底物缓冲液配制；(9)lmg／mL胰蛋白酶溶液：用0.001 mol／L盐酸配制；(10)DEAE-纤维素粉(DE-32)；(11)SphadexG-25；（12）鸡蛋 30个；（13）1％硝酸银三、实验原理 1．蛋清中蛋白质结构组成为：卵清蛋白、卵转铁蛋白、卵类粘蛋白、卵粘蛋白、溶菌酶、G2、G3球蛋白、卵抑制素、卵糖蛋白、黄素蛋白、卵巨球蛋白、蛋白抑制剂、抗生物素蛋白。2．鸡卵类粘蛋白(chickenovomucoid，CHOM)的性质: 鸡卵类黏蛋白(chickenovomucoid，CHOM)是由鸡卵清中制得的一种糖蛋白，可强烈地抑制胰蛋白酶，对枯草芽孢杆菌蛋白酶也有一定程度的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。常用于胰蛋白酶酶学性质的研究。也可将其制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效地分离与纯化胰蛋白酶。

实验六鸡蛋清中清蛋白的提取与定量测定

实验八：鸡蛋中卵清蛋白的提取和定量测定分16组，每组两人一、目的掌握盐析沉淀法提取鸡蛋卵清蛋白的提取和定量测定（考马斯亮蓝G-250）二、原理沉淀法也称溶解度法。其纯化生物大分子物质的基本原理是，根据各种物质的结构差异（如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团之间比例的差异）来改变溶液的某些性质,(如PH，极性离子强度，金属离子等)，就能使抽提液中有效成分的溶解度发生变化。换句话说就是，不同物质置入相同的溶液，溶解度是不同的；相同的物质置入不同的溶液，溶解度也是不一样的。因此选择适当的溶液就能使欲分离的有效成分呈现最小溶解度，而使杂质呈现最小的溶解度，或者相反，有效成分呈现最小溶解度，而杂质呈现最大的溶解度，然后经过适当的处理，即可达到从抽提液中分离有效成分的目的。盐析法是根据蛋白质再稀盐溶液中，溶解度会随着盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直到蛋白质析出（盐析），盐析导致蛋白质分子表面电荷被中和，水化膜被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液析出。三、实验材料鸡蛋

四、实验步骤 1.将鸡蛋一端敲一小孔，用吸管吸取卵清蛋白 2.5毫升，加生理盐水 2.5毫升得到稀释液 2.逐滴加入饱和硫酸铵溶液5毫升（边加边搅拌）静置10分钟，3000转每分钟离心10分，弃沉淀，取上清液。 3.再在上清液中加固体硫酸铵，至不能在溶解硫酸铵为止，静置10分钟 4. 置于离心管中以3000转每分钟离心十分钟，弃上清液，沉淀用5毫升生理盐水溶解（粗产品） 5. 取1毫升粗产品进行稀释，使其吸光值在0.1-1之间。 6. 用1毫克每毫升的标准牛血清蛋白溶液制作标准曲线及测定上述稀释后产品的蛋白含量 7.记录结果，数据处理。

科技论文

胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究署名：谢昊（北京理工大学珠海学院09级生物工程1班）摘要胰蛋白酶（trypsin）的分离纯化及动力学研究，是一个综合性设计实验，包括胰蛋白酶亲和配基CHOM的制备、胰蛋白酶的亲和层析分离纯化、凝胶电泳鉴定及分子量测定、胰蛋白酶的动力学研究等四个部分。最后得出结论，亲和层析法相比于沉淀离心法，分离纯化的效果显著，以及酶的高效性。 ◆关键词：胰蛋白酶、CHOM、动力学、亲和层析、凝胶电泳 Ⅰ

目录摘要引言 1 胰蛋白酶的亲和配基—鸡卵粘蛋白的分离与定量1.1 CHOM的沉淀分离 1.2 以Bradford法定量蛋白质 1.2.1 标准曲线的制作 1.2.2 样品的测定 2 亲和层析法分离纯化胰蛋白酶 2.1 亲和吸附剂的制备 2.2 装柱和平衡 2.3 上样和平衡 2.4 洗脱 2.5 数据处理 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 3.1 组装电泳槽 3.2 分离胶的选择和装配方法 3.2.1 分离胶的选择，见附录，表C1 3.2.2 分离胶的灌制 3.2.3 浓缩胶的配制和灌制 3.3 样品的处理 Ⅱ

3.3.1 标准蛋白样品的制备 3.3.2 待测样品的制备 3.4 电泳 3.5 染色与脱色 3.6 对结果进行处理分析 4 酶的动力学研究 4.1 酶蛋白含量和酶活力的测定 4.1.1酶液蛋白含量测定 4.1.2 酶活力的测定 4.1.3 数据处理 4.2 胰蛋白酶的酶促反应的米氏常数Km及最大速率Vm的测定 4.2.1 绘制时间-光吸收关系曲线 4.2.2 胰蛋白酶的酶促反应的米氏常数Km及最大速率Vm的计算 4.2.3 胰蛋白酶抑制剂的动力学研究结果处理及分析结论致谢参考文献附录 Ⅲ

实验一鸡蛋清中卵白蛋白和卵球蛋白分离与纯化

实验一鸡蛋清中卵白蛋白和卵球蛋白分离与纯化一、实验目的了解盐析分级分离蛋白质的基本原理及操作. 了解葡聚糖凝胶SephadexG-25分离蛋白质的基本原理和凝胶柱的制备及洗脱技术. 二、实验原理据研究结果分析每百克鸡蛋含蛋白质12.8克，主要为卵白蛋白和卵球蛋白，还含有少量的卵粘蛋白、卵转铁蛋白、类卵粘蛋白、溶菌酶等，其中含有人体必需的8种氨基酸。本次实验利用盐析法和柱层析法分离和纯化卵白蛋白和卵球蛋白。盐析的原理：蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质胶体的稳定性遭到破坏而沉淀析出。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质的种类及pH有关。分子量大的蛋白质(球蛋白)比分子量小(白蛋白)易析出。改变盐浓度，使不同分子量的蛋白质分别析出。脱盐的原理：含盐蛋白质溶液流经凝胶层析柱时，小分子量的盐分子因进入凝胶的筛孔中，向下移动的速度较慢；而大分子的蛋白质不能进入凝胶的筛孔，以较快的速度流过凝胶柱，从而使蛋白质与盐分开。G-25:1000---5000；G-50:1500---30000；G-75:3000---80000 三、实验用品仪器：752型紫外可见分光光度计、离心机、层析装置器皿：5ml试管20支、50ml烧杯2个、试管架、玻棒、石英比色皿、玻璃层析柱药品及材料：新鲜蛋清、固体硫酸铵、饱和硫酸铵溶液、凝胶SephadexG-25 饱和硫酸铵溶液：称固体硫酸铵(分析纯)850g，置于1000ml蒸馏水中，在70-80℃水温中搅拌溶解。将酸度调节至pH7.2，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。四、实验步骤 1、卵清蛋白与卵球蛋白的分离取卵清2mL于试管中；加2mL的半饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，静置2分钟；3000r/min,离心5分钟；沉淀为卵球蛋白(M130000)，加蒸馏水定容至4mL溶液。取上清液，加入固体硫酸铵（计算4mL溶液饱和度由50%变化为100%需要加入硫酸铵的克数1.57g）；3000r/min，离心5分钟；沉淀为卵清白蛋白(M43000)，加蒸馏水定容至4mL溶液。 2、凝胶柱层析（重点讲解，不安排做试验） (1) 凝胶柱的准备：sephadexG-25沸水溶胀30分钟，倾泻法倾去悬浮的小颗粒，湿装法装柱。 (2) 加样和洗脱：先将柱内液体用滴管轻轻吸去，使液面下降到刚与凝胶表面相切，用枪吸取1mL样液沿着管壁加入柱子上方，再加3mL蒸馏水，开始脱盐，每管收集2mL共15管。 (3)收集和测定：280nm紫外吸收测定蛋白质含量或者用考马斯亮蓝法在在595nm波长测吸光度值。 (4)以洗脱体积为横坐标，吸光值为纵坐标,绘制洗脱曲线，将蛋白质溶液收集待用。（5）将每管的洗脱液取出1ml，加入几滴BaCl2溶液，观察是否有沉淀，以此判断脱盐是否完全。五、数据结果与分析

鸡卵类黏蛋白的分离纯化

鸡卵类黏蛋白的分离纯化、活性及分子量测定唐灵杰杨荣燕曹雪文唐威风河北大学生命科学学院 2013生物工程2班摘要：本实验的主要目的是掌握鸡卵类黏蛋白（CHOM）的性质及活性测定方法，了解其应用。掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，掌握电泳仪的使用。掌握离心机、分光光度计的使用。鸡卵类粘蛋白是一种专一性很强的胰蛋白酶抑制剂，胰蛋白酶能水解酯键,酰胺键和肽键,利用这一性质用人工合成的底物或天然的蛋白质可以测定胰蛋白酶的活力,由此可计算类粘蛋白的活力。先通过三氯乙酸-丙酮除去蛋清中的杂蛋白，后经等电点沉淀得到类粘蛋白的粗品；然后经过DEAE纤维素柱层析纯化得到纯品；用Folin-酚法测定粗品和纯品中蛋白质含量，紫外分光光度计测定其抑制活力；最后，通过SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测类粘蛋白的纯度及分子量。关键词：鸡卵类粘蛋白纯化层析抑制活力分子量 Abstract:The main purpose of this experiment is to grasp the nature and activity of chicken ovomucoid CHOM, and to understand its application.. Master polyacrylamide gel electrophoresis technology, master the use of electrophoresis. Master centrifuge, spectrophotometer use. Chicken ovomucoid is a kind of specificity strong trypsin inhibitors, can hydrolyze ester keys, amides keys and peptide bond. Use this nature and synthetic substrate or natural protein can determine the vitality of trypsin, so can calculating the vitality of chicken ovomucoid.First, remove the miscellaneous protein in egg white by TCA –acetone, then get the rough protein by isoelectric precipitation.Then after chromatography column packing column, balance, Sample , elution, rebalance etc to achieve the purification of chicken ovomucoid.then we can get the eligibility product from DEAE cellulose column chromatography at last.The contents of protein in crude and pure products were determined by Folin- phenol method, and the inhibition activity was determined by ultraviolet spectrophotometry.Finally, through SDS-page polyacrylamide gel electrophoresis to determine the purity and molecular weight of chicken ovomucoid.