第九章原生质体
(2)诱发融合(induced fusion)： 指应用某种诱变剂导致原生质体融合的方法。
(1)异核体或异核细胞：细胞质发生融合，但细胞核 未融合，两个核处在共同细胞质中，这种现象称 为异核体或异核细胞。 (2)杂种原生质体或合子细胞：双核异核体的细胞核 发生融合产生的杂种细胞称为杂种原生质体或合 子细胞。 (3)同核体：两个相同原生质体发生融合，则为同核 体。 (4)非对称杂种或细胞质杂种：异核体中的两个细胞 核，若亲缘关系太远，其中一个核的染色体逐个 被排除掉，这种细胞为非对称杂种。如果整个核 完全消失，细胞质仍为杂合，这种融合产物叫细 胞质杂种。
国内常用EA3-867酶 一种复合酶，其成分含纤维素酶、半纤维素 酶、果胶酶。EA3-867复合酶有害成分少， 优于日本R-10纤维素酶。 蜗牛酶和胼胝质酶 用于花粉母细胞和四分孢子的原生质体分离， 因为花粉细胞和四分孢子外有胼胝质壁， 用其他酶效果较差。
原生质体的 分离
•
分离的原 生质体
优点：酶解法可以获得大量的原生质体，而 且几乎所有植物或它们的器官、组织或细 胞均可用酶解法获得原生质体。
2．原生质体体培养的意义
1）单细胞无性系的建立：通过原生质体培养 可以产生单细胞无性系(monocell clone)， 而单细胞无性系为在细胞水平上进行突变 体的筛选、次生代谢物生产、人工种子 (artificial seed)生产、种质资源库的建立等 提供了非常理想的受体系统。
2）遗传转化的良好受体：原生质体无细胞壁， 易于摄取外源遗传物质、细胞器、微生物 等，为植物基因工程研究提供了理想的遗 传实验操作体系。
培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一 定影响。温度过高，原生质体被杀死或灼 伤；温度太低，培养基凝固迅速，原生质 体分散不均匀，影响细胞的追踪观察。
固体中单细胞生活能力弱，透气状况不良， 第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。
2.浅层液体培养法
在培养皿或三角瓶中注入3-4ml原生质体培 养液，然后将纯净的原生质体，按一定 细胞密度注入并进行培养。
木本植物体细胞分离原生质体
由于细胞壁的构成与草本植物有所不同，因 此其混合酶液的组成和浓度与草本植物有 差异。分解木本植物细胞壁，纤维素酶是 不可缺少的，其浓度范围与草本植物相同， 但果胶酶的使用比草本植物更普遍(见上表)。
成熟花粉粒和四分体小孢子由于细胞壁中含有胼胝 质层，原生质体分离时除需纤维素酶类和果胶酶 类外，尚需降解胼胝质层的蜗牛酶和胼胝质酶， 其浓度为0.5％-2％)。
渗透压稳定剂种类及浓度的选择应根据植 物种类而异：
4.质膜稳定剂
质膜稳定剂的作用：增加完整原生质体数 量、防止质膜破坏，促进原生质体胞壁 再生和细胞分裂形成细胞团。 常用的原生质膜稳定剂：葡聚糖硫酸钾浓 度0.2％-0.3％、MES[2-(N-码琳)-乙烷磺 酸](弱酸)、氯化钙浓度0.1-1.0mmol／L 磷酸二氢钾。
分离的原 生质体
• 原生质体分离与培养.swf
三、原生质体活力测定
1．形态识别 形态上完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常球形原 生质体为有活力原生质体。如果进一步将其转入 低渗培养液或洗涤液中，可见到分离操作中被高 渗溶液缩小了的原生质体会恢复原状，这种正常 膨大的原生质体即为有活力的原生质体。 2．相差显微镜观察法 在相差显微镜下观察细胞质环流和正常细胞核的存 在与否来鉴别细胞的活性。 3．酚藏花红染色法 酚藏花红(phenosafranine)能使无活力的原生质体染 成红色，有活力的原生质体不着色。酚藏花红的 浓度为0．1％。
缺点 优 点
获得完整的原生质体的数量比较少，能够用 此法产生原生质体的植物种类受到限制。 该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。
2.酶解分离法
用细胞壁降解酶，脱除植物细胞壁，获得原生质体的方法。
原生质体分离常用的酶种类： 纤维素酶类 纤维素酶(cellulase) 半纤维素酶(hemicellulase) 崩溃酶(driselase) 果胶酶类 果胶酶(pectinase) 离析酶(macerozyme) 蜗牛酶(snailase) 胼胝质酶(callosease)等。
四、影响原生质体数量和活力的因素
1．供试材料 （1）自然生长材料的幼嫩叶片 （2）无菌实生苗子叶和下胚轴 （3）外植体来源的愈伤组织和细胞悬浮培 养物 （4）花粉细胞
2．酶的种类、组合和酶解时间
野大麦幼穗原生质体的分离
草本植物体细胞分离原生质体
利用纤维素酶类和果胶酶类中的2～3种酶组 合成的混合酶液即可达到原生质体分离的 目的，纤维素酶浓度一般为0.5％-3％，果 胶酶浓度为0.1％-1％(见上表)。
界面法
这种梯度的制备方法：
离心管中先加入溶于培养基中500mmol/L蔗糖。 加入溶于培养基中的140mmol/L蔗糖和360mmol ／L山梨醇。 最后一层是悬浮在酶液中的原生质，其中含有 300mmol/L山梨醇和100mmol/LCaCl2。 经400g、5min离心后，在蔗糖层上出现一个纯净 的原生质体层，而碎屑则位于管底。
五、原生质体培养及其技术关键
（一）原生 质体培养 方法
1.固体薄层培养法(平板培养法)
指将一定体积(3-4ml)的原生质体按照一定细胞密 度(104-105个细胞/L)与等体积的处于45℃的琼 脂培养基混合，在培养皿内制成薄层(1mm)固 体平板的方法。
优点：这种培养方法使原生质体处于固定位置， 避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原 生质体由细胞壁再生及细胞团形成的全过程进 行定点观察。
由于脱壁的原生质体对光非常敏感，分离原 生质体的过程一般是在黑暗条件下进行的。
胡萝卜：25℃保温2h，原生质体开始释放， 保温10-121h，原生质体大量释放。 月季：25-33℃ ，保温24h。 柑橘：37℃ ，保温2-4h。 蚕豆：28—30℃，保温1-3h。 烟草：26℃，黑暗保温1h(四分体)、2.5h(成 熟花粉)。
细胞壁降解酶的种类和组合 ： 例：叶片及其培养细胞：纤维素酶和果胶酶 根尖细胞：以果胶酶为主附加纤 维素酶或粗制 纤维素酶 花粉母细胞和四分体期小孢子：蜗牛酶和胼胝 质酶 成熟花粉：果胶酶和纤维素酶
3.渗透压稳定剂
用酶法降解细胞壁前，为防止原生质体的破 坏，一般需先用高渗液处理细胞，使细胞处于微 弱的质、壁分离状态，有利于完整原生质体的释 放。把这种高渗液称为渗透压稳定剂。 常用的渗透压稳定剂： 甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类(KCl， MgSO4· 20)等。 7H 在降解细胞壁时，渗透压稳定剂往往和酶制剂混合 使用。通常用渗透压稳定剂稀释酶制剂、渗压压 稳定剂中，用得最多的是甘露醇。
缺点：酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧 化物酶以及酚类物质。 用酶法降解细胞壁，会影响所获原生质体的 活力。酶解法分离原生质体要注意根据植 物种和该种类植物细胞壁的结构，选择酶 种类和酶浓度。
实例 胡萝卜(悬浮培养细胞)： 1％纤维素酶， 0.5％半纤维素酶 月季(悬浮培养细胞)： 3％纤维素酶 柑橘(胚愈伤组织)： 蚕豆(根尖)： 5％EA-867复合酶 2％EA-867复合酶
第九章 原生质体培养和细胞融合
教学目的和要求：
(1)了解原生质体培养的意义。 (2)掌握原生质体分离的大致步骤。 (3)掌握原生质体培养的方法。
第一节 植物原生质体培养和体细胞杂交 的概念及意义
一、原生质体培养的概念及意义 1．原生质体培养的概念： （1）原生质体（Protoplast） Hamstein（1880） 指的是“被去掉细胞壁的由质膜包裹着的，具有生活力 的裸细胞”。 （2）原生质体培养（protoplast culture） 给予游离出的植物原生质体适当的培养条件，使之重新 形成细胞壁，并开始分裂增殖直至分化形成再生植株 的过程。
3）多种基础研究的实验体系：利用原生质体 可以进行基础理论的研究，如细胞生理、 基因调控、分化和发育、细胞质膜结构和 功能、植物细胞壁再生、病毒侵染机理等 方面研究。 4）体细胞杂种的形成：由于细胞壁被溶解， 有利于细胞间相互融合，克服了常规育种 中远缘种属间由于生殖隔离而造成的杂交 障碍，实现了远缘种属间遗传信息的交流。
烟草(花粉)四分体孢子：2％果胶酶 1％蜗牛酶(降解胼胝质壁)
成熟花粉： 1％；1.5％பைடு நூலகம்胶酶； 2％纤维素酶
二、原生质体纯化
1.沉降法
利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中， 先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的 原生质体沉积于试管底部。
优缺点：沉降法纯化原生质体比较简单。但 由于原生质体沉积在试管底部，造成相互 间的挤压，常引起原生质体的破碎。
原生质体 融合的不 同产物
2．体细胞杂交的意义
（1）细胞膜和细胞器行为的研究：
（2）染色体行为的研究：
（3）远缘杂种的形成：
第二节 植物原生质体的培养
一、原生质体的分离方法 1.机械分离法 先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻 微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械 法磨碎组织，从伤口处可以释放出完整的原生质 体。用这种方法曾成功地分离出藻类原生质体。
分离原生质体时，酶液的pH值，因植物种 类不同而有差异。
如 胡萝卜pH值＝5.5 月季pH值＝5.5-6.0 烟草pH值=5.4-5.6 柑橘pH值=5.6 蚕豆pH值＝5.6-5.7
6．光照和温度的影响
酶活力与温度也有关系，分离原生质体所用 的各种酶的最适温度是40-50C，但这种温 度细胞无法适应。分离原生质体所用的温 度一般为25-30℃。
5.pH值对原生质体数量和活力的影响
酶活性与pH有关。酶活力和细胞活力最适pH不 完全一致，如纤维素酶R-10和离析酶R-10的最 适pH分别为5-6和4-5，而细胞活性的pH一般 为5-6。
低pH值下(pH值＜4.5）：酶的活力强，原生质体 分离速度快，但细胞活力差，破坏的细胞较多； pH值偏高：酶活力差，原生质体分离速度慢完 整的质体数目较多。
8原生质体的分离、培养和融合
③几乎可以从任何组织（只要细胞还没有木质化）分离 出原生质体。
现在为常规方法。
二、酶解法的材料来源
1、叶肉细胞 取材方便，供应及时，细胞排列疏松，易于酶解液的处 理，有叶绿素标记。 温室生长的植物，叶片干净幼嫩，是较好的材料来源。
无菌苗的叶片更具优势。
2、悬浮培养的细胞或愈伤组织
由禾本科的植物叶片获得适于培养的原生质体是相当 困难的，可以利用培养细胞制备原生质体。
增加膜的透性。 以盐类调节培养基的渗透压对原生质体往往是有害的。
2. 酶解 材料→ 撕掉下表皮→ -修剪成2cm见方小块 → 置于6cm 直径培养皿中(下表面朝下0.5g) → 加2ml酶解液→置于 25-27°C下保持3-4小时左右--轻轻震荡—原生质体释出。 3、影响酶活性和酶解效果的因素 纯度：纯化的酶活性可能降低 PH值：4.7-6.0之间 温度：酶活性的最适温度40-50℃，植物所需温度为25-30 ℃ 时间：30分钟-20小时 用量：1g鲜组织用10ml酶解液的效果很好。
A：6%的聚蔗糖和9%的聚蔗糖（溶于其他盐类和7%山梨醇 中），组成梯度离心液，经150g离心5分钟。细胞残片留于 管底，原生质体上浮。
B：400g5分钟离心，在蔗糖层之上出现纯净的原 生质体层，碎屑在管底。
原生质体悬浮液，
300mmol/L山梨醇+ 100mmol/LCaCl2
140mmol/L蔗糖+ 140mmol/L山梨醇
第四节 植物原生质体融合
诱导不同来源的原生质体发生原生质体融合，是获得体细胞 杂种的唯一途径
一、体细胞杂种植物
1、科间（融合）杂种 融合产物可以进行细胞分裂，但亲本之一的染色体会选择性 地消失。 2、属间（融合）杂种
原生质体概述
• 培养及成分对再生的影响
原生质体置于再生培养基上，壁的再生以及结构和功 能的修复往往同时进行，互为协调。再生培养基中的某些 物质既可作为细胞生长发育的营养元素，又可作为细胞壁 合成的前体物质起到促进其结构和功能的修复作用，同时 也能维持原生质体再生的渗透压平衡。
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PEG诱导融合 以PEG作为 融合剂 （相邻原生质体 的分子桥）
PEG-高pH-高Ca2+诱导 融合:是PEG诱导融合法 和高pH-高Ca2+诱导融 合法的结合。
影响原生质体融合的因素
• 无机离子对原生质体融合的影响
原生质体融合过程中需要一定量的Ca2+和Mg2+促进融合，而 K+、Na+会显著降低融合率。
4.1原生质体再生
酶解去壁后或融合后的原生质体应具有 再生能力，即能重建细胞壁、细胞结构与 功能得以修复、细胞正常分裂和萌发。这 也是原生质体融合育种的必要条件。原生 质体的再生能力与原生质化的条件息息相 关。
4.2影响原生质体再生的因素
• 破壁后的残余胞壁成分对再生的影响
原生质体制备体系直接影响到再生过程。破壁后的适 宜胞壁成分可促进细胞壁的再生。经酶解后一定量的细胞 残壁可作为合成细胞壁的“半成品”，有助其再生。
• 融合剂PEG对原生质体融合的影响
仅将原生质体混合在一起融合率并不高，需要添加融合剂来提高 融合率。PEG较常使用。PEG的相对分子质量和浓度高低对融合都有 较大的影响。PEG浓度过高会导致原生质体皱缩甚至是中毒，过低导 致原生质体破裂。
• 融合时间和温度对原生质体融合的影响
PEG处理时间是融合的最关键因素之一，尤其是对高Ca2+和高 pH值溶液处理时，时间处理非常重要。PEG溶液加入后，原生质体 间即强烈的发生黏着，融合能长时间有效进行，因此PEG处理时间常 很短。温度对原生质体融合也有一定影响，细胞膜在较高温度下流动 性增加，PEG黏度下降，有利于原生质体融合。（细菌原生质体融合 的温度往往偏低，一般4℃、20 ℃ 优于37 ℃ 。）
第九章原生质体培养与体细胞杂交
培养基
基本培养基 不同植物原生质体要求有不同的基本培养 基。使用什么基本培养基，可以参照相应 培养愈伤组织或细胞的培养基。一般认为， 原生质体培养基种的大量元素应比愈伤组 织培养基中的大量元素浓度低。由于 Ca2+ 影响到膜的稳定性，因此较高 Ca2+ 浓度的对原生质体分裂有利。
湖北生态工程职业技术学院生物工程系 2019年4月11日
原生质体的分离
——机械法
高产量、高质量的分离原生质体是进行原生 质体培养和操作的前提。
方法：机械法、酶解法
机械法：通过对植物组织进行切割、研磨等 方法破坏植物细胞壁，使原生质体游离出来 的一种方法
缺点:效率极低、原生质体破碎严重，完好的原生 质体数量少 优点：对原生质体以后的负面影响小
湖北生态工程职业技术学院生物工程系
2019年4月11日
原生质体的用途
植物原生质体是没有细胞壁的裸露细胞，它在一些研 究方面具有独特的优势。
原生质体是研究细胞骨架、细胞壁的形成与功能、 细胞膜的结构、大分子物质进出细胞的过程与机理 等问题的良好实验体系。 遗传转化：原生质体与外源DNA共培养时，原生质 体可以直接吸收外源DNA，并整合到染色体上，从 而实现对植物细胞的遗传转化。通过植株再生就可 以得到转基因植物。
湖北生态工程职业技术学院生物工程系
2019年4月11日
具体步骤：
湖北生态工程职业技术学院生物工程系
2019年4月11日
原生质体的分离
——酶解法
材料的选择 材料来源：细胞分裂旺盛的外植体，如幼嫩小苗 的根、胚轴、子叶、幼叶等；处于快速生长期的 愈伤组织或悬浮细胞.
原生质体的形成和功能研究
原生质体的形成和功能研究原生质体是一种关键的生物组成部分，该结构存在于所有真核生物中，并具有细胞内全局调节的重要功能。
原生质体形成的机制一直是生物学家们的研究重点之一。
本文将探讨原生质体的形成和功能的相关研究进展。
一、什么是原生质体？原生质体是一种包含质子的膜限制性空间，被包含在细胞膜内，并包含了细胞质中的大多数有机分子。
原生质体的大小和形状会随着细胞类型和细胞状态的变化而发生变化。
在动物细胞中，原生质体通常呈球形，而在植物细胞中，则呈现较为不规则的扁平形态。
二、原生质体的形成机制原生质体的形成机制是一个令人着迷的问题，其过程非常复杂和多变。
有多种模型被提出来解释原生质体的形成过程，其中膜受限聚集（membrane bound aggregation）可能是最为接近现实情况的模型之一。
该模型认为，在一定的限制能量下，膜的额外面积会被捏合成相对至少中等大小的空间，形成了原生质体。
研究发现，某些蛋白质和分子在原生质体的形成过程中发挥了关键作用。
CPEB4是一种转录调节因子，可以影响翻译后的CPE同源物（cytoplasmic polyadenylation element, CPE）启动子，从而影响蛋白质合成。
研究人员发现，CPEB4和其他蛋白质在体外形成的类似液态的斑块，可能对原生质体的形成过程做出了贡献。
三、原生质体的功能原生质体在细胞中具有多种重要的功能，其中最为显著的就是细胞内局部调节的作用。
原生质体可以从细胞核中运输相应的mRNA，使其在细胞质中进行局部翻译。
这种机制可以被用来调节胚胎发育过程中不同细胞间基因表达的差异，同时也可用来调节同一细胞中基因表达的时空差异。
此外，原生质体在卵细胞中也发挥着重要的作用。
卵细胞中的原生质体可以通过不同的路径逐渐运输到分化的细胞中，从而使得细胞在分化的同时也可以通过一系列复杂的机制来控制其基因表达和命运。
四、原生质体的发展前景尽管我们在理解原生质体的形成和功能方面已经取得了很大的进展，但我们仍然需要进一步的研究才能充分了解这种神秘的细胞组分。
原生质体的结构及其生理功能
原生质体的结构及其生理功能原生质体是细胞质中的一个重要部分，也是所有真核细胞都拥有的一个基本结构。
它是由细胞膜、细胞器和细胞核所组成的一种半流动性物质，承载着细胞内的各类物质和代谢过程。
本文将从结构和功能两个方面来探讨原生质体在细胞内的角色。
一、原生质体的组成结构原生质体是由膜系统和原生物质两个部分所组成的。
膜系统包括细胞膜和质膜，聚合在一起形成了一个覆盖在原生物质外围的膜层；而原生物质则包括基质、松散分散的细胞骨架和负责细胞杂事的各类蛋白质、酶类等物质。
细胞膜是由脂质分子组成的薄膜，质膜则是一种纤维素的质地。
两者的区别在于，细胞膜大致呈现出异构性分布，对于一些离子和大分子物质有着可以穿透的通道，而质膜则更像是一个开放的网状网络，可以允许有更多分子从细胞内部流向外部。
原生物质除了包括水分子和各种无机盐之外，还有各种蛋白质、酶、核酸分子等物质。
其中一些蛋白质起到了细胞内骨架的作用，一些酶则负责代谢新陈代谢过程中的物质。
二、原生质体的生理功能1.细胞内代谢细胞的许多代谢功能是在原生质体内完成的，例如糖酵解、氧化磷酸化等。
原生质体内的酶具有催化作用，使这些代谢过程能够顺利进行。
2.运输和分泌原生质体内也负责着物质的运输和分泌。
细胞膜通过质膜间隙向外分泌物质，细胞内则通过原生质体伸长和变形的方式来完成对物质的摄取和传输。
3.细胞骨架原生生质内膜较软，但通过细胞内的骨架，细胞可以呈现出多种形态。
微管、微丝和中间纤维可以协同作用，形成细胞内的具体形态和运动机能。
4.分裂和增生原生质内的蛋白质以及细胞内的核酸、ATP等分子也参与了细胞的分裂和增生过程中。
例如，有一类酶就专门负责维持位于原细胞质中的MT和MF，保证该纤维系统参与到细胞分裂的过程中。
总的来说，原生质体的结构和生理功能非常繁琐，具体的并不在本文所及。
了解其内部机能不止可以帮助我们理解细胞以及生命的本质，而且在现代化学工业和新药研发等方面也将极大地帮助我们加速这项技术的进步。
第九章：原生质体培养与体细胞杂交
优点： 融合成本低，勿需特殊设备； 融合子产生的异核率较高； 愈伤组织 融合过程不受物种限制。
不定芽 缺点： 融合过程繁琐 根形成 PEG 可能对细胞有毒害。
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诱导融合方法
（二）电融合法：利用改变电场来诱导原生
质体彼此连接成串，再施以瞬间强脉冲使质膜 发生可逆性电击穿而使原生质体融合的方法。
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2、培养方法
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液体浅层培养
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄 层，封口后进行培养。 优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易 于添加新鲜培养基转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质 体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发 育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情 况。
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1、原生质体的纯化方法
（3）梯度离心法：利用比重不同的溶液，经离心 后使完整无损的原生质体处在两液相的界面之间， 而细胞碎片等杂质则沉于管底。用这种方法可以 获得更为纯净的原生质体。
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原生质体的纯化步骤
用300-400目不锈钢网过滤酶解材料,弃去残渣
600rpm, 5-10min
吸去上清 原生质体重悬于0.16mol/L CaCl2· 2H2O溶液中
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机理：
1、NaNO3诱导融合
原生质体表面带有负电荷(-10～-30mV)，同性 质电荷彼此凝聚的原生质体质膜无法靠近到足 以融合的程度。 NaNO3中的钠离子能中和原生质体表面的负 电荷，使凝聚的原生质体质膜紧密接触，促进 细胞融合.
融合率 0.1%-4%。
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2、PEG（聚乙二醇）与高pH、 高Ca2+相结合诱导融合
PEG，能与水、蛋白质、糖等具有正极性基团的极 性物质形成氢键，在相邻原生质体表面间作为分子 桥，使原生质体发生粘连
第九章 原生质体育种
一、微生物原生质体再生育种
1．原生质体再生育种的一般程序 ： 出发菌株的选择→菌种活化和预培养→原生质体 制备→原生质体再生→高产菌株分离（初筛） →复筛→遗传稳定性鉴定→菌种特性及发酵特 性研究。 2．原生质体再生育种实例 敏感，细胞壁的重建 和分裂能力的再生， 小单孢菌福堤霉素
对数期细胞，不需要 遗传标记
亲本原生质体诱导融合；
融合重组体（称为融合子）分离； 遗传特性分析与测定；
①超声波处理菌体释放原 生质体 一、直接亲本及其遗传标记的选择 ②酶解脱壁释放原生质体
一般把诱变系谱中筛选获得的不同正突变株作为 直接亲本 直接亲本都带有遗传标记
二、原生质体制备与再生
（一）原生质体制备
最有效和最常用的是酶法。 处理细菌细胞壁用酶 处理放线菌细胞壁用酶 溶菌酶Lysozyme Lytic Enzyme裂解酶、 Lysozyme溶菌酶
原生质体的好坏与培养基成分、培养条件，菌龄和预处 理等因素有关。 1、 酶法分离原生质体的影响因素 （1）培养基组成 （2）菌体培养方式：丝状菌常用平板玻璃纸法，细菌 和酵母菌多用振荡沉没培养法。 （3）菌体菌龄：丝状真菌以年轻的菌丝用来分离原生 质体最佳。尤其是菌丝体尖端细胞。认为对数期的前 期和对数期效果最好。
四、融合体再生
（一）融合体再生
双亲融合后形成的融合体不等于重组体，以霉菌 来说，可能是异核体或杂合二倍体或重组体，它们融 合后营养互补，经过再生，均可在基本培养基上形成 菌落。 融合体的再生包括融合体细胞壁的合成、重建和 融合体的再生。 酵母菌、细菌常用双层平板法，与融合前原生 质再生率测定相同。霉菌和放线菌除了用双层平板法 外，也可把原生质体直接分离到高渗培养基平板上， 同样能得到再生菌落。 复原：原生质体本身形成细胞壁，而且还能从原生质 体细胞上长出有细胞壁的菌丝体
第9章 植物原生质体培养和融合
第一节
原生质体的特性及其应用
3 原生质体的应用
（3）便于开展那些因细胞壁存在而难以进行研究的问 如质膜的表面特性、细胞壁再生与细胞骨架、 题，如质膜的表面特性、细胞壁再生与细胞骨架、离 子的吸收与转运（膜转运）、细胞周期、 ）、细胞周期 子的吸收与转运（膜转运）、细胞周期、气孔开关机 用保卫细胞原生质体可研究气孔开关）等等。 理（用保卫细胞原生质体可研究气孔开关）等等。 （4）原生质体的质膜经一定处理可以摄取外源遗传物 如细胞器、病毒、DNA等等 或发生内吞作用， 等等） 质（如细胞器、病毒、DNA等等）或发生内吞作用，是 遗传转化的理想受体系统。例如： PEG或电击处理造 遗传转化的理想受体系统。例如：经PEG或电击处理造 成质膜瞬间局部穿孔，可将外源DNA导入细胞。 DNA导入细胞 成质膜瞬间局部穿孔，可将外源DNA导入细胞。
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第二节
原生质体的游离
6，收集与纯化
酶解结束（判断的标准： 酶解结束（判断的标准：原来的植物材料已经 “溶化”，或通过显微镜观察确认大量原生质体 溶化” 的产生）后，小心操作进行收集和纯化。 小心操作进行收集和纯化。 的产生） 收集：采用一定孔径（250-320目 收集：采用一定孔径（250-320目）的筛网过滤酶 解物，50-80 g 离心 5-10 min。 min。 解物，50纯化：用原生质体洗液或培养基洗若干次（ 纯化：用原生质体洗液或培养基洗若干次（沉降 法），或（结合）用20－25％蔗糖漂浮纯化。 ），或 结合） 20－25％蔗糖漂浮纯化。
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第二节
原生质体的游离
5，酶解处理
提高游离效果的方法 将材料浸泡到酶液中以后， 将材料浸泡到酶液中以后，搅拌使材料表 面都被酶液所覆盖。 面都被酶液所覆盖。 移入可抽空气减压的器皿中进行减压处理， 移入可抽空气减压的器皿中进行减压处理， 使植物组织间隙中的气体排除；恢复气压后， 使植物组织间隙中的气体排除；恢复气压后， 原来的间隙吸入充满了酶液。 原来的间隙吸入充满了酶液。
细胞工程原生质体的概念及培养的流程
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第九章原生质体培养及体细胞杂交
选用结构疏松并处于对数生长期的细胞 培养体系——叶肉组织细胞 选用生长旺盛，生命力强的组织作 为分离材料——人工气候箱中的烟 草花叶。
9.1.1.2 材料的预处理
（1 ）暗处理 （2） 预培养 （3） 预萎焉 （4） 预质壁分离
9.1.1.3分离方法
（1）机械分离法
优点： （1）能排除酶的有害影响； 缺点： （1）原生质体的产量低； （2）方法繁琐费力； （3）局限性大
9.2 原生质体培养
9.2.1培养基 原生质体培养基成分和培养细胞的培 养基成分相似 1. 无机盐（高浓度的钙离子有利；用有 机氮代替铵态氮） 2 渗透稳定剂（一定浓度的渗透稳定剂保 持原生质体稳定。如：葡萄糖 甘露聚唐 山梨醇 蔗糖 ）
有机成分（有利于细胞分裂如 km8p。不同的植物需要不同，需严 格控制） 4 植物生长物质（对细胞壁的生长， 细胞分裂启动，愈伤组织形成植物 再生都非常重要。如2，4D）
本章主要内容:
9.1 原生质体的分离与纯化 9.2 原生质体培养 9.3 体细胞杂交
原生质体（Protoplast）
含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、
具有生活力的裸露细胞。
第9章 原生质体培养 与和体细胞杂交
9.1、原生质体分离及纯化
9.1.1、原生质体分离
双子叶外植体
胚性细胞
9.1.1.1 材料选择
细胞工程学
之原生质体培养和体细胞杂交
西华师范大学生命科学学院 生物技术专业08级6班 田东 学号 200811440637
第9章 原生质体培养与 体细胞杂交
（云杉） （海藻酸钙凝胶
本章教学目的与要求
(1)了解原生质体培养的意义； (2)掌握原生质体分离的大致步骤； (3)掌握原生质体培养的方法； (4)掌握体细胞杂交融合的方法。