人顶体酶三维结构的同源模建及其与KF950的分子对接研究
人SEPT9蛋白同源建模和活性位点分析_王俊生
第４２卷 第２期２０１４年３月河南师范大学学报（自然科学版）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏｌ．４２ Ｎｏ．２ Ｍａｒ．２０１４ 文章编号：１０００－２３６７（２０１４）０２－０１０７－０７人ＳＥＰＴ ９蛋白同源建模和活性位点分析王俊生，阮先乐，范小芳，王永立，陈 龙（周口师范学院生命科学与农学学院，河南周口４６６００１）摘 要：利用生物信息学在线软件预测了人ＳＥＴＰ ９蛋白质的二级结构和模体信息，同时对其三级结构进行同源建模和模建结果质量评价，其次预测了该蛋白质的活性位点信息，旨在从蛋白质序列特征和分子结构水平理解其在人类生理病理过程中的作用．结果表明，模建的ＳＥＰＴ ９蛋白结构品质较高，具有７段α－螺旋和２组β－折叠结构，是一个典型的α／β类蛋白，表面呈弱正电势分布；人ＳＥＰＴ ９蛋白具有８个不同模体，可能参与不同生化反应或执行不同的功能．搜寻获得了人ＳＥＰＴ ９蛋白配基结合位点有１０个，其中位点１可能是该蛋白的活性位点．这些研究结果对理解人ＳＥＰＴ ９蛋白功能以及配基结合位点定位非常重要，也为针对ＳＥＰＴ ９蛋白的分子对接和药物从头设计提供了理论基础．关键词：人ＳＥＰＴ ９蛋白；同源模建；活性位点中图分类号：Ｑ５１８．２文献标志码：ＡＳｅｐｔｉｎ广泛存在于真菌［１］、线虫［２］、果蝇［３－４］、爪蟾［５］及哺乳动物［６］等绝大多数真核生物中．研究［７］表明，人基因组中存在多达１３种Ｓｅｐｔｉｎ基因亚家族，并且与细胞的重要生物功能密切相关，从血管生成到小泡运输，从癌症到神经系统一系列疾病等［８－１０］．ＳＥＰＴ ９蛋白最早是在白血病中作为粒细胞／淋巴细胞／白血病的伴随蛋白得到鉴定的［１１］，并且是从胸癌和卵巢癌的等位基因失衡区中克隆获得的［１２，１３］．ＳＥＰＴ９基因位点复杂，至少编码５种不同的蛋白质单体，能够和其他ＳＥＰＴ蛋白形成低聚体复合物［１４，１５］，不同的ＳＥＰＴ ９蛋白单体均具有一个ＧＴＰａｓｅ保守结构域，该结构域含有核定位信号，他们的差异主要表现在氨基酸组成上［７－８］．不同的ＳＥＰＴ９变异剪接本以及ＳＥＰＴ ９蛋白表达的改变被认为与前列腺癌［２］、卵巢癌［９，１６］、胸癌［１７］、结肠癌［１８］、头颈部癌［１９－２０］等疾病密切相关，也与遗传性神经痛性肌萎缩［２１］密切相关．随着对ＳＥＰＴ蛋白的研究日益深入，人类ＳＥＰＴ蛋白之间的互作以及功能不断被证实，如ＳＥＰＴ ９蛋白与ＳＥＰＴ ２和ＳＥＰＴ ７蛋白互作［２２］，可能参与了细胞骨架的组装完成；ＳＥＰＴ ２、６和７之间存在相互作用［２３］，也有研究［２４］表明，该ＳＥＰＴ９与ＡＨＮＡＫ，ｅＩＦ４Ｅ和Ｓ１００Ａ１１基因共同在伪足突起、癌症细胞的迁移和侵袭中表现出很重要的作用．然而，关于蛋白的三级结构信息以及基于三级结构的活性位点信息尚未见报道，因此本研究基于ＳＥＰＴ ９蛋白突变剪接体（ＡＡＨ５４００４．１）氨基酸序列，利用生物信息学方法预测其二级结构、模体类别和数量，并利用同源建模方法模建了该蛋白质的空间结构，分析和平估了模建的质量，最后预测了该蛋白的活性位点信息，为治疗该基因突变引起的人类疾病进行药物设计奠定理论基础．１ 材料和方法１．１ 序列来源在美国国立信息技术中心ＮＣＢＩ数据库中查询下载人ＳＥＰＴ ９蛋白序列，序列获取号为ＡＡＨ５４００４．１，由美国国立卫生研究院、哺乳动物基因中心、国家癌症研究院对人眼部癌变组织的测序项目提供［２５］，该蛋白由４２２个氨基酸组成，定位在人体第１７号人色体上（１７ｑ２５．２－ｑ２５．３），与卵巢癌、遗传性神经痛、肌萎缩、白血病等多种人体病症相关．收稿日期：２０１３－１１－２６基金项目：河南省教育厅项目（１４Ｂ２１００２２）；河南省高校博士科研启动经费（ＺＫＳＹＢＳＣＸ２０１１１０）作者简介：王俊生（１９７０－），男，陕西蒲城人，周口师范学院副教授，博士，主要从事生物信息数据挖掘研究．１．２ 二级结构和蛋白质模体预测利用ＮＰＳ（Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ，ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ－ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ）提供的Ｐｒｏｓｃａｎ，对人ＳＥＰＴ９蛋白序列进行模体预测；使用在线网站Ｅｘｐａｓｙ的Ｃｏｉｌｓ程序预测卷曲螺旋区域，用Ｍｕｌｔｉｃｏｉｌ程序预测二聚体和三聚体．１．３ 模建、蛋白质表面静电构象和模建结果评价分析方法利用ＣＰＨｍｏｄｅｌｓ ３．２在线服务器（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＣＰＨｍｏｄｅｌｓ／）对人ＳＥＰＴ ９蛋白序列（ｇｂ｜ＡＡＨ５４００４．１）进行同源建模，获取其三级结构信息，并且用Ｒａｓｍｏｌ视图软件可视化．模建结果检测评价采用ＮＩＨ ＭＢＩ实验室提供的结构基因组学和蛋白质确证分析服务器（ｈｔｔｐ：／／ｎｉｈ－ｓｅｒｖｅｒ．ｍｂｉ．ｕｃｌａ．ｅｄｕ／ＳＡＶＥＳ／）中提供的不同软件，从拉氏散点图、３Ｄ－１Ｄ符合度两方面进行评价．蛋白质表面静电构象通过计算ＳＥＰＴ ９蛋白（ＡＡＨ５４００４．１）各氨基酸残基的静电，使用软件Ｓｗｉｓｓ－ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ４．０．１模建蛋白质表面静电构象．１．４ 蛋白质活性位点分析活性位点分析采用在线软件Ｑ－ＳｉｔｅＦｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ．ｌｅｅｄｓ．ａｃ．ｕｋ／ｑｓｉｔｅｆｉｎｄｅｒ／）［２６］．均采用软件默认设置参数．２ 结果与分析２．１ 人ＳＥＰＴ９蛋白的二级结构预测利用ＳＰＯＭＡ在线软件对人ＳＥＰＴ ９蛋白二级结构预测结果表明（如图４），该蛋白质序列中α螺旋占２９．６２％，β－延伸链占１２．３２％，β转角占３．３２％，无规则卷曲占５４．７４％，而利用ＧＯＲ４软件对该蛋白二级结构预测表明，该蛋白质序列中α螺旋占３４．３６％，延伸链占１５．６４％，无规则卷曲占５０．００％，无β转角．与ＳＯＰＭＡ软件预测结果基本一致．从ＳＯＰＭＡ预测的β转角结构来看，所有６个β转角结构均不超过４个氨基酸残基（５个由２个残基构成，１个由３个残基构成），因此该蛋白的二级结构中β转角不会形成环（Ｌｏｏｐ）结构．２．２ 人ＳＥＰＴ９蛋白的特殊卷曲螺旋预测对人ＳＥＰＴ ９蛋白二级结构卷曲螺旋区域进行预测，结果（图２－Ａ）表明，在蛋白质序列上分布着几段可能的卷曲螺旋区域，其中２１５－２４２区段形成卷曲螺旋的可能性较大，但预测得分没有超过０．４，其他区段得分更小．使用在线网站Ｅｘｐａｓｙ的Ｍｕｌｔｉｃｏｉｌ程序预测该蛋白质的二聚体、三聚体卷曲螺旋（使用ＰａｉｒＣｏｉｌ算法），蓝线表示二聚体卷曲螺旋预测分值，红线表示三聚体卷曲螺旋预测分值，预测的分值皆为０．因此，该蛋白质难以形成稳定二聚体、三聚体卷曲螺旋（图２－Ｂ）．２．３ 人ＳＥＰＴ９蛋白的模体预测对人ＳＥＰＴ ９蛋白序列进行模体预测，结果（表１）表明，该蛋白包含１个Ｎ－糖基化位点、１个ｃＡＭＰ－和８０１河南师范大学学报（自然科学版） ２０１４年ｃＧＭＰ依赖的蛋白激酶磷酸化位点、４个蛋白激酶Ｃ磷酸化位点、９个酪蛋白激酶ＩＩ磷酸化位点、１个酪氨酸激酶磷酸化位点、１个Ｎ段肉豆蔻酰基化位点、２个酰胺化位点、１个ＡＴＰ／ＧＴＰ结合位点，模体类型和氨基酸位置详细信息见下表．表１ 人ＳＥＰＴ ９蛋白的模体预测模体名称序列号模式类型氨基酸序列随机概率Ｎ－糖基化位点ＰＳ００００１Ｎ－｛Ｐ｝－［ＳＴ］－｛Ｐ｝３６３－３６６：ＮＴＴＨ ５．１３８ｅ－０３依赖ｃＡＭＰ和ｃＧＭＰ的蛋白激酶磷酸化位点ＰＳ００００４［ＲＫ］（２）－ｘ－［ＳＴ］２６７－２７０：ＫＲＬＳ １．５７２ｅ－０３蛋白激酶Ｃ磷酸化位点ＰＳ００００５［ＳＴ］－ｘ－［ＲＫ］７１到７３：ＴＰＲ；９１到９３：ＴＰＲ；１６０到１６２：ＳＲＫ；２５７到２５９：ＳＬＲ１．４２３ｅ－０２酪蛋白激酶ＩＩ磷酸化位点ＰＳ００００６［ＳＴ］－ｘ（２）－［ＤＥ］５７到６０：ＳＲＬＥ；９１到９４：ＴＰＲＤ；１０３到１０６ＳＲＮＥ；１１９到１２２：ＳＩＬＥ；１６７到１７０：ＴＳＥＥ；１９５到１９８：ＴＶＩＤ；２８６到２８９：ＴＬＥＥ；３３８到３４１：ＳＤＨＥ；３６５到３６８：ＴＨＣＥ１．４８２ｅ－０２酪氨酸激酶磷酸化位点ＰＳ００００７［ＲＫ］－ｘ（２，３）－［ＤＥ］－ｘ（２，３）－ｙ１０７到１１４：ＫＡＰＶＤＦＧ４．０７４ｅ－０４４．０８３ｅ－０４Ｎ－肉豆蔻酰基化位点ＰＳ００００８Ｇ－｛ＥＤＲＫＨＰＦＹＷ｝－ｘ（２）－［ＳＴＡＧＣＮ］｛Ｐ｝１４４到１４９：ＧＬＧＫＳ １．３９７ｅ－０２酰胺化位点ＰＳ００００９ｘ－Ｇ－［ＲＫ］－［ＲＫ］３４５到３４８：ＮＧＫＲ；３５０到３５３：ＬＧＲＫＶ８．６３６ｅ－０４ＡＴＰ／ＧＴＰ结合位点ＰＳ０００１７［ＡＧ］－ｘ（４）－Ｇ－Ｋ－［ＳＴ］１４１到１４８：ＧＱＳＧＬＧＫＳ ７．７８１ｅ－０５２．４ 利用ＣＨＰ同源建模法的建模结果与评价以人Ｓｅｐｔｉｎ ３蛋白的ＧＴＰａｓｅ域的三维结构（序列号为３ＳＯＰ．Ｂ，与待建模序列相似性为６９．６％，显著性水平为１ｅ－１０６，模板长度２７０个残基，覆盖待建模板的６３．７％）为模板，利用ＣＰＨｍｏｄｅｌｓ同源建模法进行建模，结果（见图３－Ａ）表明，人ＳＥＰＴ９蛋白三级结构中α－螺旋、Ｂ－折叠、Ｂ－转角，无规则卷曲（白色）结构清晰可见，由７段α－螺旋和２组β－折叠构成，其中１组平行β－折叠片层结构由６个β折叠单链组成，位于蛋白质内部，另一组β－折叠片层结构由３个较小的β折叠单链组成，靠近蛋白质外部，无规则卷曲（包括β－转角）起着连接α－螺旋或β－折叠的作用．因此该蛋白是一个典型的α／β类蛋白．利用Ｗｈａｔ＿ｃｈｅｃｋ程序获得模建结果的拉氏图（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ｐｌｏｔ）（图３－Ｂ），结果表明，拉氏图中最合理区（图３Ｂ中的Ａ，Ｂ，Ｌ区）和一般允许区（图３Ｂ中ａ，ｂ，ｐ）以及免强允许区（图３Ｂ中－ａ，－ｂ和－ｐ区）的残基数占比分别为８７．８％、１１．４％和０％，不允许区（白色区）为０．８％，在允许区内总计占９９．２％，因此，模建结果比较理想；进一步利用ｖｅｒｆｙ３Ｄ－１Ｄ软件检测模建结果的原子结构（３Ｄ）与序列（１Ｄ）的符合度，结果９０１第２期 王俊生，等：人ＳＥＰＴ ９蛋白同源建模和活性位点分析（图４）表明，最大得分０．６８，最小得分－０．０３，并且平均得分大于０．２的残基数占建模总残基数（２７０个氨基酸位置，包含一个空位）的８４．７％，出于可接受的水平．因此，利用ＣＨＰｍｏｄｅｌ同源建模法获得的人ＳＥＰＴ ９蛋白的三级结构符合蛋白质立体化学品质规则．２．５ 人ＳＥＰＴ９蛋白表面电位预测通过计算ＳＥＰＴ ９蛋白（ＡＡＨ５４００４．１）各氨基酸残基的静电，使用软件Ｓｗｉｓｓ－ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ４．０．１模建蛋白质表面静电构象（图５），正电势与负电势共存于蛋白质表面，其中表面正电集团成族分布，占据较多的位置，表面整体呈正弱电势，其中负电势的残基成较小的簇状分布，负电残基分布在１６９、１７０、１７７、１８４、１８６、１８７、１９８、２０４、２０９、２２１、２２４、２２９－２３０、２４１、２６２、２６４、２８３、２８８－２８９、３００、３０７、３１３、３１５－３１７、３１９－３２０、３２５、３２９、３３９、３４１、３６０、３６２、３６８、３７４、３８６和３９４位；其中２８８～２８９位的Ｇｌｕ呈较强负电势分布在表面，３００、３０７、３１５、３１７和３２０位的Ａｓｐ以及３１，３１６，３１９位的Ｇｌｕ形成一个较大的负电集团，也分布在蛋白质表面，这些部位可能会影响到分子间的识别和结合，其余负电散布在蛋白质内部．蛋白内部正负电荷分布相对较均匀，整体偏中性．２．６ 活性位点分析活性位点是指蛋白质立体结构中形成的能够结合配基的活性腔（口袋），利用Ｑ－ＳｉｔｅＦｉｎｄｅｒ软件对人ＳＥＰＴ ９蛋白的配基结合位点进行预测，结果（图６）表明，该蛋白总体积为２．６６６ ３Ｅ－２６ｍ３，含有１０个可能的配基结合位点，大多数靠近蛋白质结构表面；各位点空腔体积（见表２）有明显差异，体积最大的位点１和最小的位点９的体积分别为２．１６和１．２６Ｅ－２８ｍ３．表２表明，组成各配基结合位点的氨基酸残基种类和数目具有较明显差异，可能影响了不同位点的空腔大小．０１１河南师范大学学报（自然科学版） ２０１４年表２ 人ＳＥＰＴ９蛋白配基结合位点信息活性位点序号位点体积／（１Ｅ－３０ｍ３）活性位点氨基酸残基及其位置编号１ ２１６Ｓｅｒ１４８，Ｉｌｅ１５１，Ａｓｎ１５２，Ｓｅｒ１６８，Ｉｌｅ１７２，Ｐｒｏ１７３，Ｌｙｓ１７４，Ｔｈｒ１７５，Ｉｌｅ１７６，Ｇｌｕ１７７，Ｉｌｅ１７８，Ｌｙｓ１７９，Ｉｌｅ１８１，Ａｓｐ１９８２ ２００Ｔｙｒ３０９，ｐｒｏ３１０，Ｇｌｎ３１１，ｐｈｅ３１４，Ａｓｐ３１５，Ａｓｐ３２０，Ａｓｎ３２４，Ａｓｎ３８３，Ａｓｐ３８６，Ｉｌｅ３８７，Ｓｅｒ３９０，Ｉｌｅ３９１３ １６３Ｓｅｒ１４３，Ｇｌｙ１４４，Ｌｅｕ１４５，Ｇｌｙ１４６，Ｌｙｓ１４７，Ｓｅｒ１４８，Ｔｈｒ１４９，Ｉｌｅ１７２，ｐｒｏ１７３，Ｌｙｓ１７４，ｔｈｒ１７５，４ ２００Ａｓｎ１５２，Ｌｙｓ１５６，ｌｙｓ１６２，ｐｒｏ１６６，Ｔｈｒ１６７，Ｓｅｒ１６８，Ｇｌｕ１６９，Ｇｌｕ１７０，Ａｓｐ３３９，Ｈｉｓ３４０，Ｇｌｕ３４１，５ １５２Ｔｈｅ２９８，Ｌｅｕ３０１，Ｌ ｅｕ３０２，Ｉｌｅ３０６，Ａｓｐ３０７，Ｖａｌ３０８，Ｐｒｏ３１０，Ｇｌｎ３１１，Ｌｙｓ３１２，Ａｒｇ３２８，Ｉｌｅ３３１６ １７０Ｍｅｔ２６６，Ｌｙｓ２６７，Ａｒｇ２６８，Ｓｅｒ２７０，Ｌｙｓ２７１，Ｖａｌ２７２，Ａｓｎ３０４，Ｇｌｙ３０６，Ｉｌｅ３０７，Ａｓｐ３１１，Ｇｌｎ３１３，Ｐｈｅ３１４，Ｉｌｅ３８７，Ｉｌｅ３９１，Ｈｉｓ３９２７ １３４Ｇｌｎ２２８，ＧＬｕ２２９，Ｇｌｕ２３０，Ｖａｌ２３１，Ａｓｎ２３２，Ｉｌｅ２３３，Ａｓｎ２３４，Ｌｙｓ２３６，Ｉｌｅ２３９，Ｐｒｏ２４０８ １５３Ｇｌｕ１３４，Ａｓｎ１３６，Ｓｅｒ１８０，Ｔｈｒ１８２，Ｌｙｓ１９３，Ｔｈｒ１９５，Ｉｌｅ１９７，Ｐｈｅ２１８，Ｇｌｎ２２２，Ａｓｐ２４１，Ｔｈｒ２４２，Ａｒｇ２４３，Ｖａｌ２４４９ １２６Ａｓｎ２２０，Ｔｙｒ２２３，Ｌｙｓ２７１，Ｖａｌ２７２，Ｖａｌ２７３，Ｉｌｅ３９１，Ｈｉｓ３９２，Ｐｈｅ３９３，Ａｌａ３９５，Ｔｙｒ３９６，Ｌｙｓ３９９１０ １３３Ｉｌｅ１７８，Ｔｈｒ１９９，Ｐｒｏ２００，Ｇｌｙ２０１，Ｐｈｅ２０２，Ｇｌｙ２０３，Ｈｉｓ２０５，Ｃｙｓ２１１，Ｐｒｏ２１４，Ｉｌｅ２１５注：人ＳＥＰＴ ９蛋白体积为２．６６６３Ｅ－２．６ｍ３３ 讨论和结论本研究预测了人ＳＥＰＴ ９蛋白的二级结构，并以人ＳＥＰＴ ３蛋白结构为模板，采用同源建模方法首次获得了人ＳＥＰＴ ９蛋白的三维结构，模建的原子空间分布质量经拉氏图检验，蛋白质主链上大多数氨基酸的Φ角和Ψ角分布在合理的区域，并且原子空间结构（３Ｄ结构）和氨基酸序列（１Ｄ结构）的兼容性或适配性较好．通过对模建的三级结构可视化，清晰地表明，该蛋白具有７段α－螺旋和２组β－折叠结构，其中１组平行β－折叠片层结构由６个β折叠单链组成，位于蛋白质内部，另一组β－折叠片层结构由３个较小的β折叠单链组成，靠近蛋白质外部，无规则卷曲（包括β－转角）起着连接α－螺旋或β－折叠的作用，这是一个典型的α／β类蛋白；计算其表面电荷分布，表明该蛋白质表面呈弱正电势分布，有２个相对集中的负电集团，内部正负电荷分１１１第２期 王俊生，等：人ＳＥＰＴ ９蛋白同源建模和活性位点分析布较均匀．Ｑ－ＳｉｔｅＦｉｎｄｅｒ通过聚类蛋白质表面上范德华力（甲基）探针有利的区域来定位配体，该算法使用一个精度为基础的阈值来验证成功与否，精度定义为与配体距离１．６埃以内的探针在一个集群内的百分比，并且以２５％的精确度阈值来定义一个成功的预测［２６］．该算法已被证明在前３名有正确预测的情况下，对于Ｎｉｓｓｉｎｋ等描述的ＧＯＬＤ对接测试集（１３４个蛋白质－配体复合体）取得了９０％的成功预测［２７］．Ｑ ＳｉｔｅＦｉｎｄｅｒ预测的第一个位点作为结合位点平均准确率达到了６８％［２６］．本研究预测获得了人ＳＥＰＴ ９蛋白可能的配基结合位点有１０个，空腔体积大小不等，而这些位点体积大小与实际可能结合的配基体积大小差异较小，并具有较高的精确性，这一点在后续的分子对接、从头药物设计或结构鉴定或功能位点比较等研究中具有非常重要的作用［２５］．另外我们也利用基于口袋侦测算法的ＣＡＳＴｐ软件（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｓ．ｂｉｏｅｎｇｒ．ｕｉｃ．ｅｄｕ／ｃａｓｔｐ／ｖｉｅｗ／ｖｉｅｗｅｒ．ｐｈｐ）对该蛋白的配基结合位点进行了预测，结果预测的结合位点中口袋体积最大的位点１与Ｑ ＳｉｔｅＦｉｎｄｅｒ预测的位点１在氨基酸组成上仅２个氨基酸差异，即多了Ｔｈｒ１６７，但缺少了Ｉｌｅ１７８，基本可以肯定两者是同一个活性位点．在一般情况下，利用ＣＡＳＴｐ进行配基结合位点预测，有７４％的蛋白配基结合位点被确定位于最大的口袋［２８］，因此基于两种不同算法获得较为一致的预测结果，可以推测位点１应该是ＳＥＰＴ ９蛋白的真正活性位点，可以考虑把活性位点１作为后续研究重点，用于理论药物设计研究．当然其他配基结合位点能否成为真正的活性位点还需要通过其他技术方法进行进一步的研究．以上研究结果为进一步研究人ＳＥＰＴ ９蛋白结构与功能关系提供了理论依据，同时也为设计新型的人ＳＥＰＴ ９蛋白结构制剂，寻找神经性退行病、癌症和肿瘤缓解药物奠定了基础．参 考 文 献［１］ Ａｄａｍ Ｊ Ｃ，Ｐｒｉｎｇｌｅ Ｊ Ｒ，Ｐｅｉｆｅｒ Ｍ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｅｐｔｉｎｓ ｉｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（Ｐｒｉｎｔ），２０００，１１（９）：３１２３－３１３５．［２］ Ｓｈａｒｏｎ Ａ，Ｗａｎｇ Ｒ，Ｍａｔｚｋｉｎ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｍｓｆ－ａ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ－１ａｎｄ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ－ｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｏ ａｆｆｅｃｔ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６（６６）：８５６－８６６．［３］ Ｂａｒｒａｌ Ｙ，Ｍｅｒｍａｌｌ Ｖ，Ｍｏｏｓｅｋｅｒ Ｍ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｏｒｔｅｘ ｂｙ ｓｅｐｔｉｎｓ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｐｏｌａｒｉｔｙｉｎ ｙｅａｓｔ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，２０００，５（５）：８４１－８５１．［４］ Ｂｅｉｔｅｓ Ｃ Ｌ，Ｘｉｅ Ｈ，Ｂｏｗｓｅｒ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｓｅｐｔｉｎ ＣＤＣｒｅｌ－１ｂｉｎｄｓ ｓｙｎｔａｘｉｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２（５）：４３４－４３９．［５］ Ｂｅｒｌｉｎ Ａ，Ｐａｏｌｅｔｔｉ Ａ，Ｃｈａｎｇ Ｆ．Ｍｉｄ２ｐ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ ｓｅｐｔｉｎ ｒｉｎｇｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ ｉｎ ｆｉｓｓｉｏｎ ｙｅａｓｔ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，１６０（７）：１０８３－１０９２．［６］ Ｂｏｕｒｎｅ Ｈ Ｒ，Ｓａｎｄｅｒｓ Ｄ Ａ，Ｍｃｃｏｒｍｉｃｋ Ｆ．Ｔｈｅ ＧＴＰａｓｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３４９（６３０５）：１１７－１２７．［７］ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｓ Ｅ，Ｈａｌｌ Ｐ Ａ．Ｓｅｐｔｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ａ ｒｏａｄ ｌｅｓｓ ｔｒａｖｅｌｌｅｄ［Ｊ］．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，３９２（８／９）：７６３－７６７．［８］ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｅ Ａ，Ｐｅｔｔｙ Ｅ Ｍ．Ｃｏｎｑｕｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｏｒｌｄ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｐｔｉｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１０，７７（６）：５１１－５２４．［９］ Ｃｏｎｎｏｌｌｙ Ｄ，Ａｂｄｅｓｓｅｌａｍ Ｉ，Ｖｅｒｄｉｅｒ－Ｐｉｎａｒｄ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｐｔｉｎ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，３９２（８／９）：７２５－７３８．［１０］ Ｒｏｅｓｅｌｅｒ Ｓ，Ｓａｎｄｒｏｃｋ Ｋ，Ｂａｒｔｓｃｈ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｐｔｉｎｓ，ａ ｎｏｖｅｌ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｉｎ ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ．［Ｊ］．Ｋｌｉｎｉｓｃｈｅ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｅ，２００９，２２１（３）：１５０－１５５．［１１］ Ｏｓａｋａ Ｍ，Ｒｏｗｌｅｙ Ｊ Ｄ，Ｚｅｌｅｚｎｉｋ－ｌｅ Ｎ Ｊ．ＭＳＦ（ＭＬＬ ｓｅｐｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｆｕｓｉｏｎ），ａ ｆｕｓｉｏｎ ｐａｒｔｎｅｒ ｇｅｎｅ ｏｆ ＭＬＬ，ｉｎ ａ ｔｈｅｒａｐｙ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｕｔｅ ｍｙｅ－ｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｗｉｔｈ ａｔ（１１；１７）（ｑ２３；ｑ２５）［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９９，９６（１１）：６４２８－６４３３．［１２］ Ｋａｌｉｋｉｎ Ｌ Ｍ，Ｓｉｍｓ Ｈ Ｌ，Ｐｅｔｔｙ Ｅ Ｍ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ ｓｐｌｉｃｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＭＬＬ ｓｅｐｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｆｕｓｉｏｎｇｅｎｅ（ＭＳＦ）ｔｈａｔ ｍａｐ ｔｏ ａ １７ｑ２５ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｌｏｓｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ ｏｖａｒｉａｎ ｔｕｍｏｒｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０００，６３（２）：１６５－１７２．［１３］ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｓ Ｅ，Ｍｃｉｌｈａｔｔｏｎ Ｍ Ａ，Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｊ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｓｅｐｔｉｎ ｇｅｎｅ ｔｏ ａ ｒｅｇｉｏｎ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １７ｑ，ｃｏｍ－ｍｏｎｌｙ ｄｅｌｅｔｅｄ ｉｎ ｓｐｏｒａｄｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｔｕｍｏｒｓ．［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，６０（１７）：４７２９－４７３４．［１４］ Ｓａｎｄｒｏｃｋ Ｋ，Ｂａｒｔｓｃｈ Ｉ，Ｂｌ ｓｅｒ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｐｔｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．［Ｊ］．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，３９２（８／９）：７５１－７６１．［１５］ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｅ Ａ，Ｋａｌｉｋｉｎ Ｌ Ｍ，Ｓｔｅｅｌｓ Ｊ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｅｐｔ９ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｓｅｐｔ１４，ａ ｎｏｖｅｌ ｔｅｓｔｉｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｐｔｉｎ［Ｊ］．Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ，２００７，１８（１１）：７９６－８０７．２１１河南师范大学学报（自然科学版） ２０１４年［１６］ 吕讷男．Ｓｅｐｔｉｎ－９和Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ在卵巢上皮性癌患者外周血和肿瘤组织中的蛋白水平及其临床意义［Ｄ］．北京：北京协和医学院，２０１１．［１７］ Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｍ Ｅ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｅ Ａ，Ｐｒｉｖｅｔｔｅ Ｌ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ ＳＥＰＴ９＿ｖ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７，６７（１８）：８５５４－８５６４．［１８］ Ｔóｔｈ Ｋ，Ｇａｌａｍｂ Ｏ，Ｓｐｉｓáｋ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｓｅｐｔｉｎ ９ｇｅｎｅ ｏｎ ＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．［Ｊ］．Ｐａ－ｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，１７（３）：５０３－９５０．［１９］ Ｓｔａｎｂｅｒｙ Ｌ，Ｄ＇ｓｉｌｖａ Ｎ Ｊ，Ｌｅｅ Ｊ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ ＳＥＰＴ９＿ｖ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１０，３（４）：２３９－２４５．［２０］ Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｋ Ｌ，Ｒｏｍｉｇｈ Ｔ，Ｅｎｇ Ｃ．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｆｉｖｅ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｈｅａｄａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９，６９（２４）：９３０１－９３０６．［２１］ Ｈａｎｎｉｂａｌ Ｍ Ｃ，Ｒｕｚｚｏ Ｅ Ｋ，Ｍｉｌｌｅｒ Ｌ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｐｔ９ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｎｅｕｒａｌｇｉｃ ａｍｙｏｔ－ｒｏｐｈｙ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００９，７２（２０）：１７５５－１７５９．［２２］ 郭 佳．酿酒酵母轴向出芽地标蛋白Ｂｕｄ３ｐ与ｓｅｐｔｉｎ细胞骨架相互作用的研究［Ｄ］．武汉：武汉大学，２０１１．［２３］ Ｉｔｏ Ｍ，Ｏｋｕｉ Ｈ，Ｎａｋａｇａｗａ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｒｏｌｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｗｉｔｈ ｎ－ｓｕｌｆａｎｙｌ，ｓｕｌｆｉｎｙｌ，ａｎｄｓｕｌｆｏｎｙｌ ｍｏｉｅｔｉｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，１１（４）：４８９－４９４．［２４］ Ｓｈａｎｋａｒ Ｊ，Ｍｅｓｓｅｎｂｅｒｇ Ａ，Ｃｈａｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｐｓｅｕｄｏｐｏｄｉａｌ ａｃｔｉｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，７０（９）：３７８０－３７９０．［２５］ Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ Ｒ Ｌ，Ｆｅｉｎｇｏｌｄ Ｅ Ａ，Ｇｒｏｕｓｅ Ｌ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ １５，０００ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｃＤ－ＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，２００２，９９（２６）：１６８９９－１６９０３．［２６］ Ｌａｕｒｉｅ Ａ Ｔ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｒ Ｍ．Ｑ－ｓｉｔｅｆｉｎｄｅｒ：ａｎ ｅｎｅｒｇｙ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００５，９（２１）：１９０８－１９１６．［２７］ Ｎｉｓｓｉｎｋ Ｊ Ｗ，Ｍｕｒｒａｙ Ｃ，Ｈａｒｔｓｈｏｒｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｅｗ ｔｅｓｔ ｓｅｔ ｆｏｒ ｖａｌｉｄａｔｉｎｇ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２００２，４９（４）：４５７－４７１．［２８］ Ｄｕｎｄａｓ Ｊ，Ｏｕｙａｎｇ Ｚ，Ｔｓｅｎｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．ＣＡＳＴｐ：ｃｏｍｐｕｔｅｄ ａｔ ａｓ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｍａｐ－ｐｉｎｇ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ａｎｎｏｔａｔｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，３４：１１６－１１８．Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＳＥＰＴ９ Ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｉｔｓ Ａｃｔｉｖｅ ＳｉｔｅＷＡＮＧ Ｊｕｎｓｈｅｎｇ，ＲＵＡＮ Ｘｉａｎｌｅ，ＦＡＮ Ｘｉａｏｆａｎｇ，ＷＡＮＧ Ｙｏｎｇｌｉ，ＣＨＥＮ Ｌｏｎｇ（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｚｈｏｕｋｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｏｕｋｏｕ ４６６００１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＳＥＰＴ ９ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅ－ｑｕｅｎｃｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｉｔｓ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｏｔｉｆ ｗｅｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂｙ ｏｎｌｉｎｅｗｅｂｓｉｔｅ．Ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ａｔｏｍｉｃ ｍｏｄｅｌ（３Ｄ）ｗｅｒｅ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ｇｒａｐｈ ａｎｄ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ ３Ｄｖｓ１Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｔｈｅｎ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＳＥＰＴ ９ｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｑｕａｌｉｔｙ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ，ｉｔ ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｓｅｖｅｎα－ｈｅｌｉｘ ａｎｄ ｔｗｏ ｔｙｐｅｓ ｏｆβ－ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｔｒａｎｄ，ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏα／βｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｈｅｓｕｒｆａｃｅ ｉｎ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｐｐｅａｒｅｄ ｗｅａｋ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅ．Ｅｉｇｈｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｏｔｉｆ ｐａｔｔｅｒｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｗｈｉｃｈ ｍｅａｎｓ ｔｈａｔ ｉｔ ｍａｙ ｂｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｒ ｐｅｒｆｏｒｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ａｔ ｌａｓｔ，１０ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｉｇ－ａｎｄ－ｂｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｉｔｓ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｏｎｅ ｍａｙ ｂｅ ｉｔｓ ｒｅａｌ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｖｅｒｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ＳＥＰＴ ９ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｎｄ ａｌｓｏ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａｂａｓｉｃ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｏｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｄｅ ｎｏｖｏ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｈｕｍａｎ ｂｅｉｎｇ；ＳＥＰＴ ９ｐｒｏｔｅｉｎ；ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ；ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ３１１第２期 王俊生，等：人ＳＥＰＴ ９蛋白同源建模和活性位点分析。
人GPC3基因的原核表达及多克隆抗体的制备
人GPC3基因的原核表达及多克隆抗体的制备腾桥;夏丽洁;张富春【摘要】This work aims to construct the prokaryotic protein of glypican3 (GPC3) and to prepare its anti-serum to mouse.The complete open reading frame (ORF) of human GPC3's cDNA was amplified by PCR,and then cloned into prokaryotic expression vector of pET28a.Further,the GPC3 fusion protein was expressed in Escherichia coli BL21,the fusion his-protein was purified by affinity chromatography and the fusion protein of purity was measured by SDS-PAGE electrophoresis.Finally,the protein content was also measured.The Balb/c mice were immunized by the purified protein for preparing the anti-serum,and the anti-serum was identified with ELISA analysis.Results showed that the polyclonal antibody against GPC3 protein was successfully prepared and the titer of antisera was1:51200;moreover,the specificity was validated to be fine by Western blot.Conclusively,recombinant human GPC3 protein expressed in the prokaryotic system has strong immunogenicity.%旨在构建人磷酯酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican3,GPC3)原核蛋白,制备小鼠GPC3抗血清.扩增人GPC3基因cDNA的完整的开放阅读框,克隆至pET28a原核表达载体,在大肠杆菌BL21表达菌株中诱导表达磷酯酰肌醇蛋白聚糖融合蛋白,利用亲和层析的方法纯化his-融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯度,并测定蛋白含量;免疫Balb/c小鼠,制备抗血清.结果显示,成功制备了小鼠抗GPC3多克隆抗体,抗体滴度为1:51200,经Westem blot检查特异性良好.原核表达的重组人GPC3蛋白具有较好的免疫原性.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2017(033)011【总页数】6页(P188-193)【关键词】磷酯酰肌醇蛋白聚糖3;融合蛋白;多克隆抗体【作者】腾桥;夏丽洁;张富春【作者单位】新疆大学生命科学与技术学院生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐830046;新疆大学生命科学与技术学院生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐830046;新疆大学生命科学与技术学院生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐830046【正文语种】中文肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，严重威胁着人类的健康［1］。
9-取代-2-氨基-6-胍基嘌呤类精子顶体酶抑制剂的设计、合成及活性评价
（ 第二军 医大学药 学院药物化学教研室 ，上海 ２ ０ ３ ） ０ ４ ３ 摘要 顶体酶是存在于精子顶体 内的一种 胰蛋 白酶样 的丝 氨酸水解 酶 ， 目前男 性抗生 育药物 设计 的潜在 是
基金项 目：上海市计划生育委员会科研基金 （ 批准号 ： ０ ７Ｇ ２ 及上海市重点学科建设项 目基金 （ ２０ Ｊ０ ） 批准号 ：Ｂ ０ ） ９ ６ 资助 联系人简介 ：吕加 国，男 ，副教授 ，主要从事抗生育药物设计与合成研究 ．Ｅ ｍ ｉ ｊ２ ＯＯ Ｏ ＠ｙｈ ｏｃｍ．ｎ － ａｌ ｇＯ ６ ５８ ａｏ ．ｏ ｅ ：ｌ 周有骏 ，男 ， 教授 ，主要从事药物合成与设计研究 ．Ｅ ｍ ｉ Ｚ ｏｙｕｕ２ ０ ＠ｙｈ ｏｃｍ．ａ － ａｌ ｈｕｏｊｎ０ ５ ａｏ．ｏ ｃ ：
行了表征 ， 中中间体 ５ 其 ｍ的结构经 ｘ射线单 晶衍射分 析确证 ．以 Ⅳ 甲苯磺 酰．． 一 赖氨酸 一 甲基 酮 （ Ｌ Ｋ） 氯 ＴＣ 为阳性对照 ， 分别测定 了 目标 化合 物对精子顶体酶 的体外 抑制 活性．结果 表明 ，化合物 ６ ６ ａ～ ｚ的酶抑 制活 性均 强于 Ｔ Ｃ 其 中化合 物 ６ 抑制活性 与 Ｋ ９ ０相 当． Ｌ Ｋ， ｚ Ｆ５
明带 和卵 黄膜 的穿 透 ， 而达 到避 孕 目的．顶 体 酶在 受 精 过 程 中 的关 键作 用 及 其 所 在 的位 置 和不 从
寻 常的高 细胞 特异 性 ， 使其 成 为研 发新 型男性 抗 生育 药物 的理 想靶 点 ¨ ． Ｊ 鉴 于 顶 体 酶 在 男 性 抗 生 育 药 物 研究 中的 重 要 性 ， 国科 学 家均 致力 于 寻找 可行 的人 精 子顶 体 酶 各 抑制剂 ．其 中 以 Ｋ ｍｎｋ 等 合成 的取 代胍 基苯 甲 ａ ｉｓｉ 酸酯类化 合 物活性 最 强 Ｊ ．本课 题组 在 其基 础 上 合 成 了化合 物 Ｋ ９ ０ 结 构见 图 １ ，体外 抑 酶 活 性 实 Ｆ５ （ ） 验及 体 内抗 生 育实 验 均 显 示 出 了较 高 的活 性 棚］ ． 当 Ｋ ９０与精 子顶 体酶 活性 腔对 接后 （ 图 ２ ， Ｆ５ 见 ） 其 体现 出很 高抑 酶活 性 ， 因在 于 Ｋ ９０母 核苯 环位 原 Ｆ５
2004年度国家科学技术奖(介绍及目录)
2004年度国家科学技术奖（介绍及目录）
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在2004年度国家科技奖励中，以权威性和五百万元人民币巨额奖金而备受关注的国家最高科学技术奖出现空缺。
据知，这是该奖项自2000设立并颁发以来的首次空缺。
与此同时，国家自然科学奖一等奖继2002度和2003年度分别评出一项后，此次再度空缺。
但“东边不亮西边亮”，国家技术发明奖一等奖已连续六年空缺的尴尬局面终于被打破，材料领域的两项成果“耐高温长寿命抗氧化陶瓷基复合材料应用技术”和“高性能炭/炭航空制
动材料的制备技术”，分获国家技术发明奖一等奖。
其他国家科技奖项则各有所属：28项成果获国家自然科学奖二等奖；26项成果获国家技术发明奖二等奖；16项成果获国家科学技术进步奖一等奖；228项成果获国家科学技术进步奖二等奖。
瑞士医药专家丹尼尔·魏思乐、美国物理学专家肯·金特、意大利环保专家科拉多·科利尼、美国信息管理专家张汝京、日本工业设计专家荣久庵宪司等五人，则被授予2004年度中华人民共和国国际科学技术合作奖。
2004年度国家自然科学奖目录
二等奖
2004年度国家技术发明奖目录
一等奖
二等奖
2004年度国家科学技术进步奖
2004年度中华人民共和国国际科学技术合作奖人选及其情况:。
hTFF3基因真核表达载体构建及表达鉴定_郑倩倩
hTFF3基因真核表达载体构建及表达鉴定郑倩倩，郭文东，朱亚勤（中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，教育部医学细胞生物学重点实验室，沈阳１１０００１）摘要目的克隆人肠三叶因子基因hTFF3，构建重组真核表达载体pEGFP -C1-TFF3，并在真核细胞中表达。
方法应用逆转录聚合酶链式反应（RT -PCR ）技术，从真核细胞中扩增得到人TFF3的全长序列，克隆至表达增强型绿色荧光蛋白载体中，经酶切、PCR 鉴定后测序证实克隆成功。
将重组载体转至真核细胞，荧光显微镜观察下转染效率，同时采用RT -PCR 、Western blot 技术检测外源基因TFF3的表达。
结果成功将hTFF3基因克隆到真核表达载体中，酶切片段与预期大小一致（200bp ）。
在荧光显微镜下观察转染后的细胞可见明显的绿色荧光，RT -PCR 及Western blot 结果表明：转染后的细胞中TFF3在转录和翻译水平的表达均有明显提高。
结论成功构建了真核表达载体pEGFP -C1-TFF3，并在真核细胞中显著表达，为进一步研究TFF3因子的生物学功能奠定了基础。
关键词肠三叶因子；克隆；表达载体中图分类号Q291文献标志码A文章编号0258-4646（2011）10-0877-04doiCNKI:21-1227/R.20111019.1725.024网络出版地址/kcms/detail/21.1227.R.20111019.1725.024.htmlConstruction of EGFP -hTFF3Vector and Identification of Its Eukaryotic Expression 三叶因子家族肽（trefoil factor ，TFF ）的成员之一是肠三叶因子TFF3，主要表达在胃肠道上皮。
TFF3是包含59个氨基酸的分泌型短肽，通过分子内的6个半胱氨酸残基结合成3对二硫键而形成有活性的二聚体［1，2］。
纳米复合软骨组织工程三维支架的的制备及其评价
华中科技大学硕士学位论文纳米复合软骨组织工程三维支架的的制备及其评价姓名：***申请学位级别：硕士专业：生物医学工程指导教师：***20061102华中科技大学硕士学位论文ABSTRACTIntroduction: Comparing with hydroxyapatite (HA), nano-hydroxyapatite has received much more attention due to its excellent biocompatibility. Recent research suggested that the composition, size and morphology of nano-HA resembled natural apatite crystals in bone minerals. There is much increase in protein adsorption and osteoblast adhesion and osteoconductivity on the nano-ceramic materials compared to micro-ceramic materials. In this study, Porous scaffolds which were made of high molecular poly (D, L-lactide) (PDLLA) / hydroxyapatite nanocrystals (nano-HA) were fabricated through solvent-casting and particulate-leaching technique. The morphologies, mechanical properties, biodegradability and biocompatibility of the scaffolds were investigated. Then, 3D dummy human data, CAD and RP technique were combined to construct 3D tissue engineering scaffold. New method to fabricate 3D tissue engineering scaffold was searched. Materials and Methods: Six groups of scaffold were fabricated by using a solvent casting / particulate leaching technique, with PDLLA, micro-HA/PDLLA, and nano-HA/ PDLLA (nano-HA: PDLLA weight ratio 1:9, 1:4, 2:3, 1:1). The phase and morphology of the scaffolds were investigated by using SEM. Cells proliferation was evaluated quantitatively by MTT assay. The interaction between scaffolds and cells were observed by HR-SEM. Results and Discussion: The results showed that nano-HA nanocrystals formed homogeneous dispersion in the PDLLA matrix. The porosity of scaffolds was up to 90%, and macropores and micropores coexisted and interconnected throughout the scaffolds. The tensile modulus for nanocomposites increases with nano-HA loading. The good mechanical properties for nano-HA composites may be due to the homogeneous dispersion of HA nanocrystals in the PDLLA matrix as well as the good interfacial adhesion. Cells grew well after cultured in the scaffold for five days. The morphology of the cells in the last group (nano-HA: PDLLA (w/w) =1:1) was better than others. 3D human data was used to reconstruct 3D cartilage tissue model, 3D scaffold was fabricated with two methods: silica rubber mould were prepared by using SLS RP technique frist, then the scaffold was fabricated by traditional method; after designed reasonable structure, 3D scaffold was constructed by SLS technique.Conclusion: In the study, we fabricated a nanocomposite porous scaffold, and this kind of scaffold showed outstanding biocompatibility and other biological properties. Tissue engineering scaffold could be constructed exactly, rapidly and conveniently by using RP technique. In conclusion, nano-HA/PDLLA porous scaffold and RP technique have a promising application in cartilage tissue engineering.Keywords: Cartilage Tissue Engineering Composite scaffold, Biocompatibility,3D scaffold construction, RP technique独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
人源蛋白酶体底物降解动力学的高分辨三维冷冻电子成像
人源蛋白酶体底物降解动力学的高分辨三维冷冻电子成像刘鸣华【期刊名称】《《物理化学学报》》【年(卷),期】2019(035)008【总页数】2页(P798-799)【作者】刘鸣华【作者单位】国家纳米科学中心北京 100190【正文语种】中文利用冷冻电镜解析的七个底物结合的人源26S蛋白酶体精细原子结构,揭示了从泛素识别、去泛素化反应、转运启动和持续降解的核心功能动态过程。
泛素-蛋白酶体体系(Ubiquitin-Proteasome System，简称UPS)是细胞内最重要的蛋白质降解通路，对维持生物体内蛋白质的浓度平衡，以及对调控蛋白、错误折叠或受到损伤的蛋白的快速降解起着至关重要的作用，参与了细胞周期、基因表达调控等多种细胞进程，由UPS失常引发的蛋白质新陈代谢异常与众多人类重大疾病直接相关1-5。
人源蛋白酶体全酶包含至少33种不同的亚基，总分子量约为2.5 MDa。
尽管很多工作揭示了蛋白酶体的基本架构和运动行为6-8，但蛋白酶体与底物之间的相互作用从未得到直接的观测，因此蛋白酶体如何作用于底物的复杂动力学过程仍然是理解蛋白酶体生化功能的核心问题。
近日，北京大学物理学院人工微结构和介观物理国家重点实验室、前沿交叉学院定量生物学中心毛有东课题组通过冷冻电子显微镜技术，解析了人源蛋白酶体26S在降解底物过程中的七种化学反应中间态构象的高分辨(2.8-3.6 Å) (1 Å =0.1 nm)精细原子结构。
该课题组利用ATPγS降低AAA-ATPase酶水解活性的特点，在底物降解的中间过程，通过将ATP快速置换成ATPγS，捕捉到蛋白酶体在底物降解过程的反应中间态。
同时，他们将机器学习的方法应用到了冷冻电镜图像聚类中，并针对蛋白酶体的动力学特征，整合了多种算法，设计了一套有效的多构象分类流程。
通过这两套技术方案的整合，课题组成功解析了人源蛋白酶体在降解底物过程中的蛋白酶体-底物复合体的七种天然中间态构象，在全原子水平展示了蛋白酶体从泛素结合到去泛素化，再到底物转运的动态过程。
人体骨肌系统的整体生物力学建模与仿真分析研究中国力学虚拟人系统集成方法与实现
人体骨肌系统的整体生物力学建模与仿真分析研究中国力学虚拟人系统集成方法与实现一、本文概述Overview of this article随着生物医学工程、计算机仿真技术及力学研究的不断深入，人体骨肌系统的生物力学建模与仿真分析在医疗、康复、体育训练及人体工程学等领域的应用越来越广泛。
其中，中国力学虚拟人系统作为一种集成多源数据、高精度人体模型与仿真技术的创新平台，为深入研究和理解人体骨肌系统的生物力学特性提供了强大的工具。
本文旨在探讨中国力学虚拟人系统集成方法与实现，通过对人体骨肌系统的整体生物力学建模与仿真分析，为相关领域的研究与实践提供理论支持和技术指导。
With the continuous deepening of biomedical engineering, computer simulation technology, and mechanical research, the biomechanical modeling and simulation analysis of the human skeletal muscle system are increasingly widely used in fields such as medicine, rehabilitation, sports training, and ergonomics. Among them, the Chinese Mechanical Virtual HumanSystem, as an innovative platform that integrates multi-source data, high-precision human models and simulation technology, provides a powerful tool for in-depth research and understanding of the biomechanical characteristics of the human skeletal muscle system. This article aims to explore the integration method and implementation of Chinese mechanical virtual human system, and provide theoretical support and technical guidance for research and practice in related fields through the overall biomechanical modeling and simulation analysis of the human skeletal muscle system.本文首先介绍了人体骨肌系统生物力学建模的基本原理和方法，包括骨骼结构、肌肉力学特性及关节运动学等方面的建模技术。
人基质金属蛋白酶3基因RNA慢病毒载体构建及在人退变髓核细胞中的鉴定
人基质金属蛋白酶3基因RNA慢病毒载体构建及在人退变髓核细胞中的鉴定曹进;傅培荣;房晶;杨建坤;位华卫;李思源;高峰;西永明【摘要】BACKGROUND: Inhibiting the degradation of extracellular matrix in the intervertebral disc can delay the degenerative process of intervertebral disc. Matrix metalloproteinases-3 (MMP3) is considered as a key enzyme for degradation of extracelular matrix components such as type II collagen and aggrecan. <br> OBJECTIVE:To construct the short hairpin RNA lentiviral vector targeting human MMP3 gene and to detect its efficiency of gene silence by infecting human degenerative nucleus pulposus cells. <br> METHODS:According to the human MMP3 mRNA (NM_002422.4) sequence, four groups of the short hairpin RNA gene sequences targeting MMP3 were designed, synthesized and annealed to form double stranded DNA fragments, which were connected with the LV3 vectors digested by BamHI andEcoRI enzymes, and then transfected into the competent cels. The positive clones were identified by PCR, and analyzed by sequencing. The packaging and titer of lentivirus were determined after transfecting 293T cells. Human degenerative nucleus pulposus cels were infected with lentivirus vector, and the transfection efficiency of each group was observed under inverted fluorescence microscope. The interfering efficiency was detected by real time-PCR and western blot at 72 and 96 hours. <br> RESULTS AND CONCLUSION:The ds-oligo DNA was successfully inserted into the lentiviral vector asconfirmed by electrophoresis and sequence analysis. The recombinant lentivirus was harvested from 293T cels with a viral titer of 1-5 ×108 TU/mL. RNA interference targeting the GCC AGG CTT TCC CAA GCA AAT sequences with the highest interfering efficiency in MMP3 gene at 72 and 96 hours resulted in suppression of MMP3 mRNA expression by 98% and 72%, respectively; and at 96 hours, the interfering efficiency of protein expression was 57.2%. The recombinant lentivirus vector containing RNA interference targeting MMP3 gene is successfuly constructed, which lays a foundation for further studies on the MMP3 function and gene therapy.%背景：抑制椎间盘细胞外基质的降解可以延缓椎间盘退变的进程，基质金属蛋白酶3是降解Ⅱ型胶原和蛋白多糖细胞外基质成分的关键酶。
顶体蛋白酶抑制剂KF—950对人精子功能的影响
顶体蛋白酶抑制剂KF—950对人精子功能的影响
赵亚南;蒋雪涛
【期刊名称】《中国计划生育学杂志》
【年(卷),期】2000(008)010
【摘要】本文研究了顶体蛋白酶抑制剂ＫＦ－９５０对人精子功能的影响。
结果表明：ＫＦ－９５０对人精子的作用与其浓度和作用时间有关。
经≥０．２１ｍｌＫＦ－９５０处理，随着时间的延长，精子活率和活力明显下降；精子膜功能有不同程度的损害，且对精子头部的损害较其对尾部膜的损害严重，顶体脱落率及已发生顶体反应的精子死亡率明显上升。
ＫＦ－９５０可通过破坏精子膜而影响精子的功能。
【总页数】3页(P449-451)
【作者】赵亚南;蒋雪涛
【作者单位】上海长海医院全军生殖技术中心;第二军医大学药学院
【正文语种】中文
【中图分类】R979.21
【相关文献】
1.人精子顶体内顶体蛋白酶和透明质酸酶对男性生育力的影响 [J], 马晓萍;高晓勤;杨燕平;杨喆
2.顶体蛋白酶抑制剂KF950急性毒性和致突变作用 [J], 赵亚南;盛毅;纪亚忠;沙金燕;刘玉环;吕加国;蒋学涛
3.顶体蛋白酶抑制剂KF-950对大鼠精子的影响 [J], 仲伟国;赵亚南;纪亚忠;盛毅;
沙金燕;曹霖;游根娣;吕加国
4.对—羟基苯甲酸丁酯对人精子顶体蛋白酶抑制作用及其对精子膜功能... [J], 宋宝良;张静
5.顶体蛋白酶抑制剂4-胍基苯甲酸盐对人精子功能的影响 [J], 赵亚南;纪亚忠;吕加国;易冰;盛毅;蒋丹
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Ｆｉｇｕｒｅ １
图１人、雄羊和雄猪顶体酶的序列联配 Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｕｍａｎ ａｃｒｏｓｉｎ，ｒａｍ ａｃｒｏｓｉｎ ａｎｄ ｂｏｒｅ ａｃｒｏｓｉｎ
万方数据
Ｎｏ】０吕加国等：人顶体酶三维结构的同源模建成其与ＫＦ９５０的分子对接研究
１０７５
１．２人顶体酶的分子结构模建
ＪＩＡＮＧ，Ｊｕｎ—Ｈａｎｇ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＳｅｃｏｎｄＭｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００４３３）
Ａｋｓｔｒａｃｔ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ３Ｄ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｃｒｏｓｉｎ ｗａｓ ｂｕｉｌｔ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｒｙｓｔａｌ ＣＯＯｒｄｉｎａｔｅｓ ｏｆ ｒｆｌｕｌ ａｎｄ ｂｏａｒ ａｃｒｅｓｉｎ．ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ｐｌｏｔ ａｎｄ Ｐｒｏｆｉｌｅ－３Ｄ ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｃｒｏｓｉｎ ｗａｓ ｓｅａｒｃｈｅｄ ｂｙ Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ／ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｕｎｃｆｉｏｎａｌ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｗｅｒｅ ｌｏｃａｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ．Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅ ｏｆ ｔｈｅ ４．ｇｕａｎｉｄｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｃｒｏｓｉｎ．ＫＦ９５０ ｗａｓ ｄｏｃｋｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｄｒｏｇｅｎ－ｂｏｎｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｐｌａｙ ａｌｌ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｐｒｏ— ｖｉｄｅｄ ａ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｔｏ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｃｏｎ订ａｃｅｐｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｏｔｅｎｃｙ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ｈｕｍａｎ ａｃｒｏｓｉｎ；ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ；ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ；４－ｇｕａｎｉｄｉｎｏｚｏｉｃ ａｃｉｄ“－ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）一
次连续蛋白内切分解，共除去７６个残基，其中包括特征
模式．上述研究为基于人顶体酶开展合理药物设计，寻
聚脯氨酸序列，最终产生高活性的伊顶体酶
找男性口服的避孕药提供思路．
（ｆｌ－ａｃｒｏｓｉｎ）ｆ１】． 顶体酶属丝氨酸蛋白水解酶家族中胰蛋白酶族［ｚ，３Ｉ，
１材料与方法
具有丝氨酸水解酶家族特征的Ｈｉｓ，Ａｓｐ，Ｓｅｒ催化三联 体，并具有潜在的糖基化位点Ｎ（２）和Ｎ（１６９）．有研究表 明顶体酶上活性位点为两个，彼此分开，其中一个是用 于分解蛋白质的催化活性位点；另一个是与卵细胞透明 带糖蛋白受体结合的结合位点【４，５１．
摘要采用同源模建方法首次构建了人顶体酶的三维结构模型，模型的可靠性经Ｒａｒａａｃｈａｎｄｒａｎ图和Ｐｒｏｆｉｌｅ＿３Ｄ图验证． 采用Ｉｎｓ培ｈｔｌＩ／Ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ方法准确定位了人顶体酶的活性位点，并研究了顶体酶重要功能残基在活性位点的立体分布 在此基础上，通过柔性分子对接方法首次阐明了顶体酶高效抑制剂ＫＦ９５０与靶酶活性位点的相互作用模式，发现特异 性的氢键相互作用是ＫＦ９５０产生高抑制活性的重要分子基础．其研究结果将为合理设计新型顶体酶抑制剂，寻找男性 口服避孕药奠定坚实基础． 关键词人顶体酶；同源模建；活性位点；４－胍基苯甲酸（４一甲氧甲酰基）苯酯甲烷磺酸盐；分子对接
１．１序列联配
要的意义．目前人顶体酶的晶体结构仍未测得，但是已
采用ＩｎｓｉｇｈｔｌＩ／Ｈｏｍｏｌｏｇｙ中的Ａｌｉｇｎｌ２３程序对以上
经测得雄羊和雄猪顶体酶的晶体结构．由于雄羊和雄猪
３条序列进行匹配，参数设置：Ｂｌｏｓｕｍ．６２矩阵，Ｇａｐ
顶体酶与人顶体酶的氨基酸序列具有较高的同源性，因
ｐｅｎａｌｔｙ为１０，Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ为１．然后基于晶体
化学学报
、，ｏＩ．６４．２００６
个氨基酸的“轻链”和一条３９４个氨基酸的“重链”，它
我们以雄羊和雄猪顶体酶的晶体结构模建了人顶
们通过２对二硫键交联形成口．顶体酶似一ａｃｒｏｓｉｎ）．此时
体酶的三维结构，并搜寻了可能的药物结合空腔，同时
反．顶体酶就已具有了蛋白水解酶的活性．通过Ｃ末端三
阐明了人顶体酶高效抑制剂ＫＦ９５０与蛋白的相互作用
１．３模建蛋白溶剂化模型的构建和能量优化
以上得到的模建蛋白在ｐＨ为７条件下加氢，得到 韧始模型．将整个体系加入０．５ Ｄ皿】Ｔ／Ｐ３Ｐ水分子，采用 ＩｎｓｉｇｈｆｌＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ ９５．０模块进行能量优化，力场选用 ＣＶＦＦ力场．首先采用最陡下降法（Ｓｔｅｅｐｅｓｔ ｄｅｓｃｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ），当能量梯度低于４２ ｋＪ．ｍｏｌ－１．ｎｍ＿１时，采用共 轭梯度法（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ）再优化至能量梯度 小于４．２ ｋＪ＊ｍｏｌｌｔｎｍ一．能量优化时采用分级方法，首 先对溶剂水和蛋白的氢原子进行能量优化，进而优化环 区侧链、环区主链、结构保守区侧链和结构保守区主链， 直至全部放开优化．优化过程中采用Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ图 和Ｐｒｏｆｉｌｅｓ＿３Ｄ图随时检验优化所得蛋白质的结构合理 性，得到最终的溶剂化模型． １．４人顶体酶上活性位点的搜寻
ＩＦＩＷ： ＲＳＴ敞ＣＡＧＹＰＥＧＫｌ９墨ｅＱＧＤＳ∞ＰＬ劫ｅＫＤＳＡＥＮＳＹＶＶＶＧＩＴＳＷＧＶＧ｛：ＡＲＡＫＲｌ）ＧＶＹＴｓＴＷＳＹＬ》ｉＷＩＡ １ＦＩＺ： Ｒｓ墨璺秘嘎翟目＆糟ＲＧＫＩＤＴＣ蛳ＤＳＧ舀Ｐｌ渤ｃＲＤＲＡＥＮＴＦＶＶＶＧｌＴｓＷＧＶＧＧＡＲＡＫＲＰＧＶＹＴＳＴＷＰＹＬＮ｜＿；ｊ｝ＩＡ ＡＣＲＯＳＩ： ＱＰＴＮＶＣＡＧＹＰＶＧＫＩＤＴＣ德ＤＳＧＧＰＬＲＣＫＤＳＫＥＳＡＹＶＶ粥ＩＴＳ幂ＧＶＧＣＡＲＡＫＲｐＧＶＹＴＡＴＷＰＹＬＮ弹ＩＡ
１ＦＩＷ： Ｔ∞ｌｆＦＩ：Ｇ秘ＣＬＰＱＦＲＡＧＰｅＲＶＰＯＴＣ鞠铲ＡＧＷＧＦＬＱＥＮＡＲＲＴＳＰＭＬＱＥＡＲＹＤＬＩＤＬＧＬＣＮＳＴＲＷＹＮＧＲＩ １ＦＩＺ： ＰＧＧＰ黟ＩＧｐＧＣＬＰＱＦＫＡＧＰＰＲＡＰＱ晖聊ＴＧＷＧＹＬＫＥＫＧＰＲＴＳＰＴＬＱＥＡＲＶＡＬＩ跣ＥＬＣＮＳＴＲ豹ｆＮＧＲＩ ＡＣＲＯＳＩ： ＳＣＧＲＦ！ＧＰ∞ＬＰＨＬＫＡＧＬＰＲＧＳＱＳＣＷｑＡＧＷＧＹＩＥＥＫＡＰＲＰＳＳＩＬＭＥＡＲＶＤＬＩＤＬＤＬＣ蕊ＴＱＷ硼ＧＲＶ
采用ＩｎｓｉｇｈｔｌＩ ２０００软件包的Ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ模 块来搜寻和分析人顶体酶上空腔的大小和分布情况．参 数设置如下：探针分子（ｇｒｉｄ）大小定义为Ｏ．１ ｎｍ×０．１ ｎｍ ×０．１ ｎｍ，Ｓｉｔｅ＿Ｏｐｅｎｓｉｚｅ为７．００，Ｓｉｔｅ＿Ｃｕｔｏｆｆｓｉｚｅ为５０．
采用ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ ２０００软件包Ｈｏｍｏｌｏｇｙ模块中的 Ｍｏｄｅｌｅｒ程序模建蛋白分子参数设置：每次Ｍｏｄｅｌｅｒ计 算构建５个模型，每个模型产生２个不同的ｌｏｏｐ区，优 化水平为中度，模型构建不考虑氢原子，共计算５个循 环．对各模型以Ｐｒｏｆｉｌｅｓ＿３Ｄ图检验其得分值，选取得分 晟高的模型，进一步确定模建蛋白结构变化区即ｌｏｏｐ区 的三维结构．采用Ｍｏｄｅｌｅｒ／Ｒｅｆｉｎｅ＿Ｌｏｏｐ程序，对每一个 ｌｏｏｐ区计算其５种构象，优化水平为中度，选取 Ｐｒｏｆｉｌｅｓ＿３Ｄ图检验得分最高的构象．最终所得的模型进 行进一步能量优化．
尽管在受精过程中项体酶的精确作用仍不十分清 楚，但体内或体外实验表明，天然或合成的胰蛋白酶抑 制剂可以抑制顶体酶的活性，从而阻止受精过程的发 生．由于顶体酶的重要功能和显著的高细胞特异性，因 此寻找其专属性抑制剂对于研究新型避孕药有非常重
雄羊顶体酶（分辨率０．２１ ｎｍ，Ｒｃｒｙｓｔ＝０．２００）齐［Ｉ雄猪 顶体酶（分辨率０．２９ ｎｍ，Ｒｃｒｙｓｔ＝Ｏ．２１２）的晶体结构坐标 来源于Ｂｒｏｏｋｈｅａｖｅｎ蛋白质晶体结构数据库，记录号分 别为１ＦＩＷ和１ＦＩＺ．人顶体酶的蛋白序列来源于ＮＣＢＩ 数据库．所有分子模建、能量优化和柔性对接计算均在 Ｏｒｉｇｉｎ ３００服务器上，采用ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ ２０００和ＳＹＢＹＬ ６．９ 商用软件包完成．计算中选用的各项参数除特别指明均 采用缺省值．
ｐｈｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ ｍｏｎｏｍｅｓｙｌａｔｅ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｏｃｋｉｎｇ
受精是精子与卵子相互结合启动新生命发育的过 程．当精于接近或进入卵丘细胞与卵透明带结合时，其 头部发生顶体反应．项体反应使精子顶体内所含的项体 酶（ａｃｒｏｓｉｎ）释放出来，顶体酶水解透明带糖蛋白，支持 精子穿过卵透明带，从而实现精卵融合．顶体酶位于精 子头项体内膜上，在顶体反应中起着关键性作用，是受
１ＦＩＷ： ＳＫＩＧＳＴＡＶ嘣ＩＱＬＰＴ『－一一ＴＴＣＤＧＰＣＧＶＲＦＲＱＮ．．．一一～一一～ ～一一一＿－＿ １ＦＩＺ： ＳＫｔＧＳＮＡＬＱＭＶＱＬＧＴＰＰＲ ＡＴＣＤＧＰＣＧＩ。ＲＦＲＱ＿ｌ＿