肉桂地链霉菌接合转移体系的构建及nsdA基因中断对其次级代谢的影响
金色链霉菌接合转移体系的构建
之间添加抗性筛选标记 ｎｏ 因 ， 在该基因上游加入组成 型强启动 子 ｅ ｉ ， 化筛选标记 ． ｅ基 并 ｌｅ’ 以强 ｓ 将该 外源 Ｄ Ａ序列插入 Ｎ 到质粒 ｐＥ １２ 构建 重组 质粒 ｐＤ ０． ＳＴ ５ ， Ｆ １６ 转化大肠杆菌 Ｅ １５７ ， 接合 转移导入金 色链 霉菌 Ｊ３中， Ｓ Ｔ ２６ 后 经 １ Ｍ 平板 上筛选 阳
ｐｓ ｏ ｆ ｈｏｔｒｃｅ ｎ ， ｅ ｐｉｅ ｙＰ Ｒ ｆ ｍ Ｓｒ ｔ ｙｅ ａ ｒｆ ｃ ｎ Ｊ３ｇｎｍ ｅＤ Ａ．Ｔ ｅｍａ ｅ ｅｅＲｏａ ｄ ｏｉ ｎｏ ｌｒ ｔ ｙｌ ｅ ｗ ｒ ａ ｌ ｄ ｂ Ｃ ｏ ｔｐｏ ｃｓ ｕｅ ａｉ ｓ １ ｅｏ ｉ Ｎ ｉ ｔ ｅ ｅａ ｉ ｅｍ ｆ ｉ ｒ ｅ ｍ ｏ ｅ ｈ ｒ ｒ ｎ ｅ ｎ ｋ ｇ
ｃ ｎ ｔ ｕ ｖ ｒ ｍｏｅ ｍ ‘ｗ ｒ ｈ ｎ ｉ ｓ ｒ ｅ ｗ ｅ ｅ ｓｉ ｓ Ｗｉ ｈ ｓ ｒ ｇ ｎｓ ｏ ｓ ｔ ｔ ｅ ｐ ｏ ｔｒｅ ｉ ｉ ｅ ｔ ｅ ｎ ｅ ｔ ｂ ｔ ｅ ｎ ｔ ｔ ｌ ． ｅ ｄ ｅ ｈ ｌ ｔ ｔ ｅ ｅ ｆａ ｍｅ ｔ ．ｗ ｏ ｓｒ ｃｅ Ｓ ＴＩ ２ ｄ ｒ ｅ ｅ ｔｒ ｈ ｅ ｃ ｎ ｔｕ ｔ ｐ Ｅ ５ ． ｅ ｖ ｄ ｖ ｃ ｏ ｄ ｉ
去 甲基金霉素属四环类抗生素， 具广谱抗菌 活性 ， 是合成米诺环素和替加霉素 的重要中间体¨２ 该 ．． ］
抗生素与金霉素结构相似， 仅在 Ｃ 上少一 甲基． 因此 ， 若能阻断金色链霉菌中金霉素生物合成基因簇上的 Ｃ 甲基化酶基因， 就有望获得去甲基金霉素工程菌． 传统上多利用物理和化学因子对金色链霉菌进行诱变 ， 因效果不佳 、 但 无法定 向改造而受到很 大限 制 ． 随着分子生物学的发展 ， 目前可利用基因工程方法对不 同微生物 的相关基因和代谢途径进行操作 ， 获得特定代谢产物． 国内外对金色链霉菌进行分子操作的报道 ， 多建立在制备原生质体 的基础上 ， 步骤繁 琐、 操作复杂Ｈ ． ］而接合转移可在一定程度上绕过宿主 的限制性障碍 ， 且操作简单、 宿主范 围广 ， 前 已成 目 功应用于多种链霉菌 ．． ６ 】 本研究 以整合型质粒载体 ｐＥ １２ 为基础 ， Ｓ Ｔ ５ 构建了重组质粒 ｐ Ｄ ０ ， Ｆ １６ 并通过接合转移整合到染色 体 中， 为金色链霉菌的基因操作创造 了条件 ， 为最终获得去甲基金霉素工程菌奠定基础．
第12组激活沉默基因以获取新型微生物次级代谢产物的策略素材
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异源表达使得沉默基因在新的表达系统中无需按照原来的起始位点进行有效转 录，对培养条件也无特殊要求，克服了天然生产菌表达 水平低、遗传操作困难、 不容易规模培养等缺点，为工业化生产扫清障碍。另外，它还适用于生长缓慢 的微生物，如蓝细菌、真菌等。由该法已发现多种新的生物活性物质。
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实现天然产物异源表 达生物合成必须要解 决以下几个问题。
激活沉默基因以获取新型微生物次 级代谢产物的策略研究
组员： 季宗德 郭秋香 张羡媛
赵琪
1
一直以来，天然产物在人类疾病的治疗过程中发挥着重 要作用。
根据2007 年的统计，1981～2006 年间国际上所有批 准的药物中，超过 50%来源于天然产物、天然产物的衍生物 或模拟天然产物药效基团的合成化合物。 尤其是，目前临 床上使用的 60%的抗癌药物和 70%的抗生素是天然产物或 者基于天然产物研发的药物。
18
6 单菌多次级代谢产物策略
单菌多次级代谢产物（one strain-many compounds，OSMAC）策略，是通过 改变培养培养基成分、通气量及添加重金属和酶抑制剂等发酵条件来获取更多新型 的次级代谢产物的方法
缺点：OSMAC 策略虽然有效， 但是其工作量 大，且最终能 否获得新的有 活性的次级代 谢产物并不确 定
中国科学家更是于 2009 年 发起了“万种微生物基因组” 计划，预计在3年内完成1万 种微生物物种全基因组序列 图谱的构建。
4
在常规培养条件下，大 多数生物合成基因簇不表 达或以极低水平表达并在 沉默生物合成基因簇包含了 特定条件下被激活而表达 多种结构类型的微生物次级代谢 活性产物，这些 DNA序列称 产物编码信息, 提供了丰富的合 为沉默生物合成基因簇。 因此，如何利用现有 成生物学天然元件或模块 , 并为 未来设计和构建新型微生物次级 的研究成果和技术手段 代谢产物生物合成途径提供丰富 进行激活沉默基因以获 的物质基础。
sco1135基因对天蓝色链霉菌M145孢子形成及次级代谢产物合成的调控研究
sco1135基因对天蓝色链霉菌M145孢子形成及次级代谢产物合成的调控研究马军霞;张佩佩;王世立;曹广祥【摘要】This work aims to study the effects of deletion and mutation of gene sco1135 on the morphogenesis and secondary metabolism in Streptomyces coelicolor strain M145. Recombinant plasmid pSJ1135 was obtained by PCR-targeting. Gene deletion mutant of sco1135 (△sco1135)was acquired by introducing the recombinant plasmid into the Streptomyces coelicolor M145 via conjugation and transformation, and the complemented strain △ sco1135com was constructed usi ng the vector pMS82. Using pMS82 as a control,the phenotypes of the parental wild strain(M145),mutant strain(△ sco1135)and complemented strain(△sco1135com)were analyzed and observed with quantitative antibiotics. The results of phenotypic analysis and observation with quantitative antibiotics revealed that the sporulation in △ sco1135 obviously delayed than that of the wild type M145 on YBP medium ;while theactinorhodin(ACT)production in △ sco1135 increased to 2-3 folds of that in M145. The transcriptions of some sporulation-related genes decreased by 50%-75% in △ sco1135 at 48 h,while the transcriptional expressions of genes related to ACT in △ sco1135 increased to 13-20 folds at 72h,compared to the M145. Conclusively,sco1135 is involved in regulating the sporulation in M145 and also the production of secondary metabolite ACT.%旨在研究 sco1135基因缺失突变对天蓝色链霉菌 M145菌株形态及次级代谢的影响。
冰城链霉菌属间接合转移体系的构建
冰城链霉菌属间接合转移体系的构建科技创新实验论⽂冰城链霉菌属间接合转移体系的构建学⽣：邢⽉超、姚萌、⽩晶芝、丁秀云单位：⽣命科学学院指导教师：向⽂胜2012年9⽉23⽇冰城链霉菌属间接合转移体系的构建摘要：本次试验采⽤的冰城链霉菌是从⼟壤中分离筛选得到的⼀株新的吸⽔链霉菌菌株，它能代谢产⽣⽶尔贝霉素，本次试验对于冰城链霉菌-⼤肠杆菌属间接合转移体系的构建⽅法条件进⾏了初步的摸索和优化，对于后续基因的转移等相关实验内容奠定了基础，便于后续相关操作的进⾏。
关键词：冰城链霉菌;⼤肠杆菌;属间接合;异源表达1.前⾔1.1冰城链霉菌简介冰城链霉菌（Streptomyces bingchenggensis）是由向⽂胜实验室从中国哈尔滨⼟壤中分离筛选得到的⼀株新的吸⽔链霉菌菌株，并对该菌株进⾏了形态特征、培养特征、⽣理⽣化特征、细胞壁化学成分及16S rDNA序列（DQ449953）等鉴定（Wang等，2009a；Xiang 等，2007a），通过与其它菌株进⾏⽐较，鉴定其是⼀新种链霉菌。
在⾼⽒培养基表⾯冰城链霉菌⽣长紧密，随着时间的推移菌落颜⾊逐渐变深，有⽩⾊最终变成灰⾊。
油镜下观察基丝分枝，⽆横隔，不断裂；⽓丝分枝较多，较基丝粗?；成熟的菌丝直径为0.8-1.2 um，孢⼦丝为3-8圈紧密螺旋。
通过电镜观察孢⼦呈卵圆形，表⾯有明显的疣。
冰城链霉菌的线性染⾊体长度11936683 bp，菌内没有质粒存在，G+C含量为70.8%，这是迄今为⽌公布的较⼤的细菌基因组之⼀。
染⾊体上分为三个区域：7.2 Mb的核⼼区域，1.5 Mb的左臂和3.2 Mb的右臂。
通过分析，其上有10023个预测的蛋⽩编码序列，其中6 419个具有可知的或者潜在的功能。
83%的基因分布在核⼼区域，许多与次级代谢有关的基因则分布在两臂上。
初步数据分析，冰城链霉菌基因组上⾄少含有23个与聚酮化合物、⾮核糖体多肽和萜⽣物合成有关的基因簇。
其中的14个基因簇定位在染⾊体右臂，包括⽶尔贝霉素和冰城霉素；南昌霉素和其他5中?隐藏的基因簇位于染⾊体核⼼区域（Wang 等，2010a）。
微生物遗传与分子生物学
微生物遗传与分子生物学（5*15+1*25=100分）本课程主要涉及到微生物中主要的模式菌株:原核微生物: 放线菌(链霉菌),大肠杆菌,芽孢杆菌,乳酸菌，古菌等。
真核微生物：汉逊酵母，酿酒酵母，白念珠菌等。
第一章概论基因的符号：每个基因：如色氨酸基因trp；同一表型的不同基因：如trpA或trpB等。
当染色体上发生缺失时可用Δ表示（如ΔtrpA或ΔtrpA）；基因突变：如亮氨酸缺陷型leu-；抗药性基因：r表示抗性，加s表示敏感如链霉素抗性基因表示为strr，敏感基因表示为strs。
1、微生物基因突变一般分几种类型,突变有什么生物学意义?（谭老师）基因突变可从突变发生方式和突变引起的表型改变和遗传物质改变等方面进行分类。
按突变体表型特征的不同，可把突变分为以下4个类型:1). 形态突变型2). 生化突变型3). 致死突变型:按突变所引起的遗传信息的改变，又可把突变分为：1). 错义突变2). 同义突变3). 无义突变根据遗传物质的结构改变，可分为碱基置换、移码、DNA片段插入和缺失。
根据突变发生的方式，可分为自发突变和诱发突变。
突变的生物学意义：基因突变导致了基因表达出来的性状发生了改变，对突变个体本身来讲，绝大多数是有害的，因为现有的生物基本上都适应了现在的环境。
但是环境是可变的，如果生物不变，那就很可能被淘汰。
所以，对整个生物群体来说，突变使群体不会灭亡。
环境不断改变，生物通过不断突变而适应, 也就使其被保存下来。
最终，物种的面貌特征与祖先不同，所以说，突变是生物进化的内因，是进化的主要动力。
无数事实说明了一个真理，即宇宙间的所有物种变是绝对的，不变则是相对的。
2、应用于链霉菌基因组编辑与大片段DNA克隆的技术都有哪些？能否用在你们今后的实验中？（刘钢老师）基因组编辑是指在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。
原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到改造基因组的目的。
肉桂地链霉菌接合转移体系的构建及nsdA基因中断对其次级代谢的影响
肉桂地链霉菌接合转移体系的构建及nsdA基因中断对其次级代谢的影响陈芬;熊伟;闵勇;范与庆;梁运祥;吕和平;邢仁昌;郑应华【期刊名称】《农业生物技术学报》【年(卷),期】2007(15)6【摘要】以pSETl52和pHL212为出发质粒,通过供体大肠杆菌(Escherichia coli)ET12567(pUZ8002)和S17-1属间接合转移肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis),构建并优化了肉桂地链霉菌的接合转移系统.利用PCR介导的基因置换技术快速构建了肉桂地链霉菌nsdA(negative regulator of Streptomyces differentiation)基因中断载体,通过接合转移导入肉桂地链霉菌工业菌株BIB2005,筛选得到1株遗传稳定表型为AprRKanS的接合子BIB309.PCR分析结果显示,该接合子即为nsdA中断突变株.与出发工业菌株相比,在摇瓶水平上nsdA中断突变株BIB309莫能菌素产能提高了2.7倍.【总页数】6页(P1042-1047)【作者】陈芬;熊伟;闵勇;范与庆;梁运祥;吕和平;邢仁昌;郑应华【作者单位】华中农业大学农业微生物国家重点实验室,武汉,430070;清华大学生物科学与技术系,北京,100084;华中农业大学农业微生物国家重点实验室,武汉,430070;华中农业大学农业微生物国家重点实验室,武汉,430070;华中农业大学农业微生物国家重点实验室,武汉,430070;北京生物医药研究所,北京,100091;北京生物医药研究所,北京,100091;华中农业大学农业微生物国家重点实验室,武汉,430070;北京生物医药研究所,北京,100091【正文语种】中文【中图分类】S188【相关文献】1.金色链霉菌接合转移体系的构建 [J], 方志锴;洪文荣;严凌斌;潘成奇;朱宝泉2.玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63负调控基因nsdA_(mgh)的克隆及序列分析[J], 沈凤英;刘力强;吴伟刚;李亚宁;刘大群3.负调节基因nsdA在链霉菌中同源性及激活沉默抗生素合成基因簇的研究 [J], 余贞;王茜;邓子新;陶美凤4.斑贝链霉菌接合转移系统的构建及透明颤菌血红蛋白基因的表达对其次级代谢的影响 [J], 凌华云;闵勇;熊伟;吕和平;喻子牛;郑应华5.大肠杆菌乙酰-CoA羧化酶基因异源表达对变铅青链霉菌次级代谢的影响 [J], 郑华亮;白亭丽;陶美凤因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
CRISPR技术在链霉菌细胞工厂中的应用和优化
CRISPR技术在链霉菌细胞工厂中的应用和优化目录一、内容概述 (2)1.1 CRISPR技术简介 (2)1.2 链霉菌细胞工厂的重要性 (3)1.3 CRISPR技术在链霉菌细胞工厂中的潜力 (4)二、CRISPR技术的基本原理与操作 (5)2.1 CRISPR-Cas9系统概述 (6)2.2 基因编辑的基本步骤 (8)2.3 CRISPR技术在链霉菌中的应用策略 (9)三、CRISPR技术在链霉菌基因组编辑中的应用 (10)3.1 基因敲除与插入 (11)3.2 基因表达调控 (12)3.3 蛋白质工程与代谢途径优化 (14)四、CRISPR技术在链霉菌细胞工厂中的优化策略 (15)4.1 代谢途径的强化 (16)4.2 抗性筛选与性状鉴定 (17)4.3 细胞工厂的稳定性和可重复性 (18)五、CRISPR技术在链霉菌中的实际应用案例 (20)5.1 抗生素生产优化 (21)5.2 生物燃料生产 (22)5.3 代谢产物的合成 (24)六、挑战与展望 (25)6.1 技术挑战与解决方案 (26)6.2 行业发展趋势 (27)6.3 未来研究方向与应用前景 (28)七、结论 (29)7.1 CRISPR技术在链霉菌细胞工厂中的重要成果 (30)7.2 对工业生物技术的贡献与影响 (31)一、内容概述CRISPR技术，作为一种革命性的基因编辑工具，近年来在生物医学领域引起了广泛关注。
其高效、精确的特性使得科学家能够以前所未有的精度对生物体的基因进行操作，为生物工程和合成生物学的发展提供了强大的支持。
特别是将CRISPR技术应用于链霉菌细胞工厂，不仅为抗生素生产、生物燃料合成等工业应用开辟了新途径，还极大地推动了微生物细胞工厂的优化和升级。
链霉菌作为一类重要的革兰氏阳性菌，具有独特的代谢途径和生物学特性，使其成为生物工程领域理想的宿主。
传统的链霉菌基因编辑方法存在效率低下、操作复杂等问题，限制了其在工业生产中的广泛应用。
链霉菌聚酮类次生代谢产物及其生物合成基因簇
( aromatase) 和环化酶 ( cyclase) 等修饰基因。与
型
PKS 相比 , ! 型 PKS 的功能基因以游离蛋白的方式 [ 6] 在化合物形成的过程中在相应的步骤上发挥功能 ( 图 1) 。 ∀ 型 PKS 有 别于 上述两 种, 它通 常以 80 kDa 蛋白二聚体的形式存在 , 在结构与功能上与植 物体内的查耳酮合酶 ( CHS) 相似 , 主 要存在于一 些真核生物中 , 本文不作详细的介绍。 聚酮类化合物具有较强的生物活性, 目前, 市场 上的药用或农用抗生素中, 聚酮类化合物位居六大 类天然产物 之首 。然而 , 随着 SARS 等新型 疾病 的发生以及多重耐药性、 高耐药性病原菌的出现 , 如
[ 2 3] [ 1] [1 3]
类型 :
型、 ! 型和 ∀型 3 种类型 。
[ 4]
型 PKS 亦称
复合 PKS, 主要有酮基合 成酶 ( ketosynthase, KS) 、 酰 基 转 移 酶 ( acyltransferase, AT ) 、酰 基 载 体 蛋 白 ( acylcarrier protein, ACP) 、 酮基还原酶 ( ketoreductase, KR) 等功能域组成, 这些功能域组成一个庞大的基 因, 并组合成多肽链参与聚酮类化合物合成的每一 个循环 。 ! 型 PKS 亦称芳香类 PKS, 除了 KS、 KR 和 ACP 以 成 簇 基 因 而 存 在 外, 还 有 芳 香 化 酶
( Steffimycin) 和角蒽环类的殴菲杜霉素( Oviedomycin) 等( 图 2) 。这种化学结构的多样性为其生物活性的 多样化提供了重要前提 , 包括了抗细菌、 抗真菌、 抗 病毒、 抗肿瘤、 抗结核、 免疫抑制等独特的功能。为 此, 部分聚酮类化合物已经成为重要的临床药物 , 如 抗菌药物土霉素 ( Oxytetracycline) 、 抗癌药物埃 博霉 素( Epothilone) 、 免疫 抑制剂依维 莫司 ( Everolimus) 、 调脂 药 洛 伐 他 汀 ( lovastatin ) 及 抗 结 核 药 利 福 平 ( Rifampin) 等
肉桂地链霉菌的发酵工艺优化精品文档
• 将ST021原始菌株，进行单交换菌株 RⅠ分别涂 在Kan浓度为100ug/ml 、120ug/ml、150ug/ml、 180ug/ml、300ug/ml、500ug/ml的斜面培养基上, 分别看其所对应的抗性浓度。
• 继续对 RⅠ、 RⅡ、 H进行液体传代，每两天 传代一次，然后吸取5ml菌丝体，用无菌水洗3次 ，涂在Apr的斜面培养基上。7天后在Apr板子上挑 单菌落继续涂在含Apr的培养基上。
肉桂地链霉菌的发酵工艺优化
张洁
底盘细胞
ST021菌株 培 养
形成单菌落
构建转化体系
选取高产菌株
作为底盘细 胞
对底盘细胞
的目标产物 进行验证
• ST021发酵工艺的优化
种子培养基:糊精 2%，豆粕粉1.5%，葡萄糖0.5%，酵母提取 物0.25%，用NaoH调PH6.7-6.8. 再加入CaCO3 0.1%
效价
8.63
___
8. ? 135.71mg/25mL）
N4单菌落发酵
编号
PH
1
8.83
2
6.65
3
8.81
4
8.95
效价 ____ 5.71g/L 0.571g/L 0.556g/L
N6单菌落发酵
编号
PH
1
8.73
2
8.81
3
8.83
4 8.79
效价 2.43g/L —— —— ——
② 调控基因RⅠ（正调控基因）进入到松弛培养 第四代，挑单菌落30个于高氏培养基上。
③ 调控基因MonH （正调控基因）挑了20个转 化子在Apr、Nali的高氏培养上验证。
④ MonBⅡ进入到松弛培养第三代，挑单菌落20 个于高氏培养基上生长。
光调控对药用植物次生代谢成分合成的影响
光调控对药用植物次生代谢成分合成的影响
张伟;孟祥庆;苏晓荟;汪晋伊;李丽华;贾敏
【期刊名称】《药学实践与服务》
【年(卷),期】2024(42)2
【摘要】药用植物次生代谢成分,因具有特殊的药理活性或功效对人类的健康极为重要,是药品、保健品、化妆品的主要来源。
随着人类对于健康和长寿的不断追求,医药市场的需求规模持续增长,提高药用植物次生代谢成分的产量和质量变得特别重要。
植物次生代谢成分是植物对环境的一种适应,是在长期进化过程中植物与生物和非生物因素相互作用的结果。
药用植物次生代谢成分的产生和积累主要受植物遗传因素和环境因素的影响,其中光环境对其合成影响尤为重要,因而,长期以来光调控一直是国内外众多学者研究的热点。
本文综述近年来有关光调控对药用植物次生代谢成分影响的研究进展,主要从光质、光强、光周期的影响分别阐述,以期为高效生产具有重要药理活性的次生代谢成分提供理论依据和实践指导。
【总页数】10页(P50-59)
【作者】张伟;孟祥庆;苏晓荟;汪晋伊;李丽华;贾敏
【作者单位】解放军总医院京南医疗区丰北桥门诊部药房;海军军医大学药学系中药鉴定学教研室;中国人民解放军66481部队
【正文语种】中文
【中图分类】R28
【相关文献】
1.UV-B辐射胁迫对药用植物次生代谢产物的影响研究进展
2.诱导子对药用植物毛状根活性次生代谢物生成的影响
3.多组学策略在药用植物表皮毛次生代谢调控中的应用与展望
4.药用植物细胞次生代谢产物合成信号转导机制研究进展
5.功能基因组学和代谢组学技术在植物次生代谢物合成及调控研究中的应用
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农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(6):1042~1047*通讯作者。
Author for correspondence.研究员， 主要从事微生物发酵工程研究。
Email:<zhengyh98@>.收稿日期：20070403 接受日期： 20070507 ·研究论文· 肉桂地链霉菌接合转移体系的构建及 基因中断对其次级代谢的影响陈 芬 1 ，熊 伟 2 ，闵 勇 1 ，范与庆 1 ，梁运祥 1， 吕和平 3 ，邢仁昌 3 ，郑应华 1,3 *（1. 华中农业大学农业微生物国家重点实验室，武汉 430070； 2.清华大学生物科学与技术系，北京100084；3. 北京生物医药研究所，北京 100091）摘要： 以 pSET152 和 pHL212 为出发质粒， 通过供体大肠杆菌 （ ） ET12567 （pUZ8002） 和 S171 属间接合转移肉桂地链霉菌（ ）， 构建并优化了肉桂地链霉菌的接合转移系统。
利用 PCR 介导的基因置换技术快速构建了肉桂地链霉菌(negative regulator ofdifferentiation)基因 中断载体， 通过接合转移导入肉桂地链霉菌工业菌株 BIB2005， 筛选得到 1 株遗传稳定表型为 的接合子 BIB309。
PCR 分析结果显示，该接合子即为 中断突变株。
与出发工业菌株相比， 在摇瓶水平上中断突变株BIB309莫能菌素产能提高了 2.7倍。
关键词： 肉桂地链霉菌； 接合转移； 基因； 基因中断中图分类号：S188 文献标识码：A 文章编号：10061304(2007)06104206 Construction of the Conjugal Transfer System of and Effect of PCRmediated Gene Disruption on Its Secondary MetabolismCHEN Fen 1 , XIONG Wei 2 , MIN Yong 1 , FAN Yuqing 1 , LIANG Yunxiang 1 , LV Heping 3,XING Renchang 3 , ZHENG Yinghua 1,3*Intergeneric transfer of plasmid vectors pSET152and pHL212from donorET12567(pUZ8002)andS171to were demonstrated and optimized.Thegene disruption structure was constructed byPCRtargeting system and then introduced intoBIB2005through intergeneric conjugal transfer.After PCR analysis,the screened conjugant BIB309was confirmed to be thepared with the start strain,the yield of monensin of themutant BIB309increased 270percent in the level offlask.;conjugal transfer;gene;PCRmediated gene disruption肉桂地链霉菌 （ ） 是 一种具有复杂形态分化的革兰氏阳性土壤细菌， 在 不同培养基与培养条件下表现不同产孢和生长特 性。
其次级代谢产物是莫能菌素 （monensin ）， 是一类 五环单羧酸多醚结构的脂溶性抗生素，其体外抗球 虫活性极强，在农业和畜牧业生产中具有广泛的应用(Day ,1973)。
目前莫能菌素生物合成基因簇的克隆及序列分析工作已基本完成 (Leadlay., 2001)， 序列分析结果显示莫能菌素生物合成基因簇与大环内酯类抗生素生物合成基因簇十分相似，大 小约为 97kb ， 其基因簇以 mon 命名，G+C %含量高 达 72%(Andrew,2006)。
整个生物合成基因簇 含有 34 个完整的 ORFs ， 其中的 20 个 ORFs 与莫能菌素的生物合成密切相关(Markiyan,2003)。
近年来，接合转移作为一种基因转移工具已在 多种链霉菌中成功应用(TrieuCuot,1987)。
介 导大肠杆菌与链霉菌接合转移的载体一般都含有一段 760bp 来源于 IncP 群质粒 RK2 上的 序列，第6期 陈 芬等:肉桂地链霉菌接合转移体系的构建及 基因中断对其次级代谢的影响同时还需要供体大肠杆菌提供反式作用的转移功 能。
接合转移可以避开胞外核酸酶,使 DNA免遭核 酸酶的降解,在某种程度上可以克服宿主对外源 DNA的限制性修饰提高了转化效率， 而且操作程序 简单， 因此应用较为广泛。
目前， 有关肉桂地链霉菌 的体内遗传操作主要是通过原生质体转化来完成， 接合转移技术的应用尚未见报道。
基因是一个首先在天蓝色链霉菌中发现 的全局性负调控基因，对天蓝色链霉菌的产孢形态 分化与抗生素的合成均有负调控作用(Takano ., 2006)。
SC7A1是天蓝色链霉菌 A3(2)的一个文库质 粒， 陶美凤发现(Li ,2006)在天蓝色链霉菌 A3 (2)的质粒消除衍生菌株 M145或 J1501中引入 SC7A1后， 宿主的产素和产孢发生延迟， 菌落表面 的褶皱程度加深， 据此推测 SC7A1中可能含有与分 化有关的负调控基因， 导致了这些表型的产生。
根据 SC7A1的序列推断，它所含有的 46kb的染色体片 段内包含 40个 ORFs， 通过一系列的亚克隆把这个 基因定位于 ORF26， 把它命名为 （negative reg ulator of Streptomyces differentiation）。
余贞等 （2006） 的研究发现 是普遍存在于大多数链霉菌中的 全局性负调控基因，对链霉菌抗生素的合成和产孢 形态分化具有负调节作用。
天蓝色链霉菌 A3(2)中 基因的中断提高了钙依赖抗生素与次甲基霉 素的产量； 变铅青链霉菌 ZX64中 基因的中断 会激活沉默的放线紫红素生物合成基因簇的表达 (Li .,2006)。
生物信息学分析结果显示， 已经发现 的 基因序列存在高度的相似性， 并且 两 侧也存在高度保守的区域， 通过设计保守引物 PCR 和测序可以分析其它链霉菌中 基因的存在。
肉桂地链霉菌中尚未有 基因的相关报道， 因 此确证其基因组中 基因的存在，利用 PCR介 导的基因置换技术对其进行中断，可能是莫能菌素 分子育种的一条新途径。
本研究探索了肉桂地链霉菌 大肠杆菌属间接 合转移系统， 并成功地进行了优化， 同时还试图通过 保守引物 PCR的方法确证肉桂地链霉菌中 基 因的存在， 然后利用 PCR介导的基因置换技术构建 肉桂地链霉菌 nsdA中断载体，运用接合转移导入 肉桂地链霉菌， 中断其基因组中的 基因， 为莫 能菌素的生物合成的调控研究提供基础资料，同时 也为进一步研究 基因的功能做了有益探索。
1材料和方法1.1 菌株莫能菌素产生菌肉桂地链霉菌()BIB2005、 大肠杆菌( ) JM109、 S171、 ET12567(pUZ8002)(Tobias ., 2000)均由本实验室保存。
S171为接合转移 甲基化供体，整合有接合转移需要的 基因。
ET12567(pUZ8002)为接合转移去甲基化供体， 整合 有 基因。
BW25113()为大肠杆菌高 效重组菌株。
由于阿拉伯糖合成基因缺陷， 处于阿拉 伯糖启动子控制之下的基因，能在阿拉伯糖的诱导 下表达。
该菌株由英国 John Innes研究所的 Gust博 士构建，并由英国植物生物科学有限公司 （Plant Bioscience Limited,Norwich,England） 惠赠。
1.2 质粒SuperCos1(Tobias .,2000)来自 Stratagene， 含有的 抗性基因用于双交换筛选，整合型穿梭 载体 pSET152和自主复制型穿梭载体 pHL212由 华中农业大学陶美凤副教授馈赠； pIJ790具有温度 敏感型复制子， 姿 Red重组系统位于其阿拉伯糖操纵 子下游， pIJ773含安普霉素抗性基因 （ ） 和接 合转移位点 （oriT） 由英国植物生物科学有限公司惠 赠。
1.3 限制性内切酶和试剂酶类均购于 TaKaRa公司 （北京）； DNA分子量 标准物购于 MBI公司（北京）； DNA回收试剂盒购 于北京赛百胜公司， 其它常规试剂参见文献 （Tobias .,2000;Sambrook .,1989)。
莫能菌素标准品 由本室保藏。
1.4 培养基和抗生素大肠杆菌培养基为 LA、 LB和 SOB(Sambrook .,1989);肉桂地链霉菌与大肠杆菌的接合转移 选用了 TSB琼脂、 R2YE、高氏一号和 MS培养基 (Tobias .,2000)、 R6(Illing ,1989)、 肉桂地链 霉菌的种子培养基和发酵培养基(Stark .,1967)； 肉桂地链霉菌固体产孢培养基为高氏一号，液体培 养基为YEME(Tobias ,2000)。
LB中氨苄青霉素 使用量为 100滋 g/mL， 安普霉素为 50滋 g/mL， 氯霉 素为 25滋 g/mL；卡那霉素在链霉菌中的使用浓度 是 25滋 g/mL， 在大肠杆菌中是 50滋 g/mL； 接合转 移培养基中安普霉素使用量为每平板 1000滋 g。
1.5 大肠杆菌与肉桂地链霉菌属间接合转移体系 的构建1.5.1孢子和菌丝体对接合转移 效率的影响 分别以孢子和菌丝体作受体，具体接 合转移参见文献 （Tobias .,2000)。
1043农 业 生 物 技 术 学 报 2007年 1.5.2供体:受体对接合转移效率的影响 研究中供体大肠杆菌细胞量保持 10 8不变，菌丝体量（按稀释平板后长出的单菌落量换算）从 10 3 ~10 8以 10倍递增。
实验以形成肉眼可分辨的转化子为准。
接合效率用转化子数除以菌丝体量表示。