血清学反应
微生物常用实验
一、形态结构和培养特性观察１、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。
２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。
不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。
，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。
因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。
１）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。
在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。
半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。
（图３－８）图３－８细菌的培养特征1.点状2.圆形3.丝状4.不规则形5.假根状6.纺锤状7.扁平8.隆起9.凸起 10.垫状11.脐状 12.边缘整齐 13.波状 14.裂片状 15.啮蚀状 16.丝状 17.卷发状 18.丝线状 19.刺毛状 20.串珠状 21.疏展状 22.树根状 23.假根状 24.丝状 25.串珠状 26.乳头状 27.绒毛状 28.树根状 29.量杯状 30.萝卜状 31.漏斗状 32.囊状 33.层状 34.絮状 35.环状36.蹼状 37.膜状２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。
液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。
霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。
霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。
血清学反应
同种异型抗体
抗人免疫球蛋白
间接Coombs试验
双功能抗体
自身红细胞凝集试验（一）
双功能抗体抗 原交联物
自身红细胞凝集试验（二）
第三节 沉淀反应
一、液相沉淀反应 二、凝胶内沉淀反应
液相沉淀反应
1、絮状试验 2、环状试验 3、免疫浊度测定
液相内沉淀反应
絮状沉淀反应
环状沉淀反应
单向扩散试验
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T1 T2 T3
Mancini曲线
T1 T2 T3
Fahey曲线
Mancini曲线：K=C/d2 适用于大分子抗原，长时间扩散
Fahey曲线：K=logC/d 适用于小分子抗原，短时间扩散
单向扩散试验的适用对象
有特异性单价抗血清 有已知含量的标准品 待检标本抗原蛋白质含量大于1.25g
抗血清 抗原
+—
抗原 抗体
+
—
微量免疫沉淀测定
1、方法：免疫透射浊度测定法 免疫速率散射浊度测定法
2、原理：
散射光
入射光
透射光
检测器 检测器
凝胶内沉淀反应
1、扩散试验 2、免疫电泳技术
免疫扩散技术 单向扩散试验 双向扩散试验
免疫电泳技术 火箭电泳 对流电泳 免疫电泳
扩散试验
单向扩散试验 双向扩散试验
（ml）1
2
3
4
CH50示意
补体结合试验
1、补体结合试验原理 2、补体结合试验应用
补体结合试验原理
待检系统
补体
指示系统
补体结合试验原理（结果阳性）
补体消耗
待检系统
指示系统（不溶血）
补体结合试验原理（结果阴性）
红细胞凝集反应要点概括
红细胞凝集反应要点概括红细胞凝集反应，简称血凝反应，是一种血清学反应，属于血型鉴定的一种方法。
主要应用于血型鉴定、免疫学检测、临床诊断、疾病预测等领域。
下面将对红细胞凝集反应的要点进行概括。
一、定义红细胞凝集反应是指在特定条件下，同种动物、人类或异种动物实验血清与红细胞混合后所引起的现象，是一种渐进性的凝集现象。
二、原理红细胞凝集反应是依据特异性抗体与血型抗原相互作用所引起的，相互作用一般分为两种类型:1. 血凝素型反应：红细胞面膜上的抗原与特异性抗体结合，该类反应是凝集现象的基础。
2. 不完全抗体型反应：通过不完全抗体与抗体相互作用所产生的凝集反应。
三、血型抗原和抗体1. 血型抗原血型抗原分为A、B、O、Rh等，抗原分布于红细胞的表面。
人类中O型血没有表面抗原。
2. 抗体抗体分为IgG、IgM、IgA、IgD、IgE。
不同种类的抗体可导致不同的凝集反应。
四、步骤1. 血清准备：准备好已知或未知的血清样品。
2. 红细胞准备：准备与血清样品相应的红细胞，一般红细胞来自于人类或动物等实验对象。
3. 混合试验：将血清和红细胞混合，在特定的温度和时间的条件下进行反应。
一般来说，反应温度为37°C，反应时间为30分钟。
4. 观察和分析：观察试管中的混合物是否出现凝集现象。
通过凝集程度、凝集规律等特征来分析反应结果。
五、操作注意事项1. 操作设备：准备好洁净无菌的试管、移液器等玻璃仪器。
2. 反应温度：温度控制应准确无误。
3. 反应时间：反应时间控制应合理，以保证反应结果的准确性。
4. 血清和红细胞的匹配：在选择血清样品和红细胞时，应注意它们之间的兼容性。
6. 结论红细胞凝集反应是一种可靠的血型鉴定方法，通过它可以了解血型抗原和抗体之间的相互作用关系，从而帮助临床医生做出正确诊断并采取针对性的治疗方法。
在操作过程中，应注意仪器设备的准备、操作流程的规范，以及反应结果的准确性，做好各项操作细节，从而保证测试的准确性和可靠性。
实验二 淋转花环 血清学反应
结果判定
溶 血——阴性 不溶血——阳性
Ag
Ag Ag
Patient’s serum
No Ag
中和反应
1、病毒中和试验:在活细胞或活体内测定病毒被特异性抗体中
和而失去致病力的试验。中和抗体与病毒结合后，使病毒失去对敏 感细胞的感染能力，从而阻止病毒的繁殖
2、毒素中和试验
抗链球菌溶血素O试验(antistreptolysin O test)—抗O试验
大多数抗原pI=3~5，在碱性溶液中带负电荷，因 此抗原在电场中从负极向正极移动；抗体pI=5~7，解 离暴露的极性基团较少，负电荷没有抗原多，且抗体 属免疫球蛋白，分子量较大，泳动的速度较慢，电渗 力大，因此抗体由正极向负极移动。
对流免疫电泳
材料
琼脂板 1块/2人，打孔器 2个/组 抗AFP血清 —— 已知Ab AFP阳性血清 —— 阳性Ag 对照阴性血清 —— 阴性Ag 待检血清：标本1 —— 未知Ag
标本2 —— 未知Ag
对流免疫电泳
方法
阴性
标1
阳性
－
>1.5cm Ag Ab
பைடு நூலகம்
阴性 标2 阳性
Ag
＋ >1.5cm Ab
打孔 加样 电泳20min
对流免疫电泳
结果判定： 在相应抗原抗体孔之间出现白色沉淀线。
（二）凝集反应（agglutination reaction）
颗粒性抗原与相应抗体结合
（一）沉淀反应（precipitation reaction）
可溶性抗原与相应抗体结合
单向琼脂扩散 火箭电泳 双向琼脂扩散 对流免疫电泳
1 单向免疫扩散（single agar diffusion）
凝集法原理
凝集反应一种血清学反应。
颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞等）与相应抗体结合，在有电介质存在的条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块。
参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。
可分为直接凝集反应和间接凝集反应两类。
（1）直接凝集反应颗粒状抗原（如细菌、红细胞等）与相应抗体直接结合所出现的凝集现象。
分为玻片法和试管法。
玻片法是一种定性试验方法。
可用已知抗体来检测未知抗原。
（若鉴定新分离的菌种时，可取已知抗体滴加在玻片上，将待检菌液一滴与其混匀。
数分种后，如出现肉眼可见的凝集现象，为阳性反应。
该法简便快速，除鉴定菌种外，尚可用于菌种分型、测定人类红细胞的ABO血型等。
）试管法是一种定量试验的经典方法。
可用已知抗原来检测受检血清中有无某抗体及抗体的含量。
用来协助临床诊断或供流行病学调查研究。
（操作时，将待检血清用生理盐水连续成倍稀释，然后加入等量抗原，最高稀释度仍有凝集现象者，为血清的效价，也称滴度，以表示血清中抗体的相对含量。
）诊断伤寒、副伤寒病的肥达氏反应、布氏病的瑞特氏反应均属定量凝集反应。
（2）间接凝集反应将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的颗粒状载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用。
在有电介质存在的适宜条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反应。
用做载体的微球可用天然的微粒性物质，如人（O型）和动物（绵羊、家兔等）的红细胞、活性炭颗粒或硅酸铝颗粒等；也可用人工合成或天然高分子材料制成，如聚苯乙烯胶乳微球等。
由于载体颗粒增大了可溶性抗原的反应面积，当颗粒上的抗原与微量抗体结合后，就足以出现肉眼可见的反应，敏感性比直接凝集反应高得多。
分为（1）乳胶凝集法：（2）固相凝集法：（3）明胶凝集法；（4）免疫凝集法；（5）胶乳凝集反应法血小板抗体检测试剂盒（固相凝集法）生产厂家：河北益生医药有限公司长春博德生物技术有限责任公司。
血清学试验
2、胶乳凝集试验
3、协同凝集反应
抗体致敏载体，载体为金黄色葡萄球 菌A蛋白（SPA） SPA具有与IgG的Fc段结合的特性。
第三节 沉淀反应 （precipitation reaction)
可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、菌体 裂解液、病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出 液等）与相应的抗体结合，在适量电介质存在 下，形成肉眼可见的细微的白色沉淀。
第一节 血清学试验概述
二、特点
特异性与交叉性 敏感性 反应的可逆性 反应的二阶段性 最适比与带现象 用已知测未知
第一节 血清学试验概述
三、影响血清学试验的因素 电解质 温度 酸碱度 震荡 杂质和异物
第一节 血清学试验概述
四、应用及发展趋向
血清学试验在医学和兽医学领域已广泛应用，可 直接或间接从传染病、寄生虫病检出相应的抗原 或抗体。 血清学试验还广泛应用于生物活性物质的超微定 量、物种及微生物鉴定和分型等方面。 血清学试验也用于基因分离，克隆筛选，表达产 物的定性、定量分析和纯化等，已经成为现代分 子生物学研究的重要手段。
酶联免疫吸附试验（简称ELISA ）
将抗原或抗体吸附于固相载体的表面，酶标 记物与相应的抗体或抗原反应后，形成酶标 记抗原抗体复合物，在遇到相应底物时，结 合物上的酶催化底物产生水解、氧化或还原 等反应，从而生成可溶性或不溶性的有色物 质，可用肉眼或酶标测定仪判定结果。颜色 的深浅与相应的抗体或抗原量成正比，因此， 可根据颜色的深浅来定量抗体或抗原。
第三节 沉淀反应 （precipitation reaction)
可溶性抗原+相应抗体 肉眼可见的沉淀
第三节 沉淀反应 沉淀反应 （precipitation reaction)
09第九章 诊断制剂(兽医生物制品学)
特异性检测：以新制菌素与标准菌素，对10匹健康马作点眼试验， 用量为2~3滴，5匹马左眼点标准菌素，右眼点新制菌素，另5匹马相反， 点眼后3、6、9、24h检查，全部试验马对两种菌素须均无反应。
阳性血清的 各种稀释度
1:10 1:25 1:50 1:75 1:100
1:10
0 0 10 20 40
抗原稀释度
1:50 1:100 1:150 1:200 1:300 1:400 1:500
补 体 结 合 反 应 结 果（溶 血，%）
0
0
0
0
10
20
40
0
0
0
0
10
30
60
0
0
0
10 20
40
60
第九章 诊断制剂
利用微生物、微生物提取物或动物血清等材料制成的，用于传染病、 寄生虫病血清学和变态反诊断应用的制品，称为诊断用生物制剂 (diagnosticum)，也称为诊断液。主要包括诊断抗原、诊断抗体(血清)和标 记抗体等三大类。
诊断生物制剂用于诊断的原理，是基于抗原和抗体能特异性结合这一 基本特性，故诊断中可以用已知抗原检测未知抗体，或用已知抗体检测未 知抗原。
(2)制造要点
将种子菌液接种肝汤琼脂培养基上37C培养2～7天,或液体通气培养36h，用 0.5%石炭酸生理盐水洗下培养物，70～80C水浴中加热灭菌lh，离心去上清， 菌体悬浮于0.5%石炭酸生理盐水，再离心沉淀洗一次。菌体悬浮于0.5%硫酸水 溶液中，121C加热30～40min，促使菌体水解。室温或冰箱放置12～24h，吸 取上清液，用NaOH液调整为pH6.8～7.0，再静置沉淀未水解部分。上清液用蔡 氏滤器过滤后75～80C加温热，凯氏法测定总氮量(用标准水解素作对照)，用灭 菌蒸馏水稀释滤液，使其最终总氮量为0.4～0.5mg/ml(或与标准的水解素相同)。
第十六章 免疫学的实际应用
（四）免疫标记技术 1.荧光标记抗体技术（免疫荧光技术）
免疫荧光技术是指用荧光素对抗体或抗原进行标记， 然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗 原或抗体的方法。
荧光素标记的 特异性抗体 荧光素标记 待测抗体 的抗抗体
Ag 组织切片
Ag 组织切片
直接法
间接法
2.酶标记抗体技术（酶免疫测定技术）
（2）琼脂扩散试验
根据其扩散的方向可分为单向单扩散、单向双 扩散、双向单扩散、双向双扩散，其中双向双扩应用 最广。
双向琼脂扩散（琼扩）系采用1%琼脂倒于平皿或 玻片上，制成凝胶板，可按需要打孔。将抗原、抗体 分别滴入孔内，放置湿盒中，在37˚C湿箱中24-72h后 观察。在抗原与抗体孔间形成沉淀带。每一种抗原成 分出现一条沉淀带。
1.对流免疫电泳
2. 火箭电泳
3. 免疫电泳
免疫电泳技术的用途
对流免疫电泳——快速、半定量测定
火箭电泳——快速、定量测定
免疫电泳——抗原分析
（二）补体有关的试验 （补体结合实验）
反应系统 已知抗原 （抗体） 指示系统 绵羊红 细胞 反应结果的判定 如溶血则 为阴性
补体
待检血清 （抗原）
溶血素
+
平板凝集试 验用抗原 阳性 血清 出现凝 集现象
B.试管凝集反应
⑵ 间接凝集反应
将可溶性抗原或抗体先吸附于一种与免疫无关的、 一定大小的载体颗粒的表面相吸附，然后与相应的 抗体或抗原作用，在有电解质存在的适宜条件下， 所出现的特异性凝集反应为间接凝集试验。
（正向）间接凝集反应原理示意图
（二）新型疫苗
1. 联苗与多价苗
联苗：是指不同种微生物或其代谢产物组成的疫苗。 多价苗：则是指同种微生物不同型或株所制成的疫苗。
血清学反应-沉淀反应
二 凝胶内沉淀实验
（一）免疫琼脂实验(Immunodiffusion test）
原理：抗原抗体在电解质存在的条件下，再合适的比例 处形成白色沉淀线，并且一种抗原抗体系统形成一种沉淀 线，另一种形成另一种沉淀线，互相不影响。 优点：能将复合的抗原成分加以区分，根据沉淀线的数 目，位置，以及相邻两条沉淀线之间的融交分支等情况即 可了解该复合抗原的组成。并且可以将沉淀线用特殊染色 法（蛋白质、多糖、之类的鉴定染色），生物活性(酶活 性)和同位素标记法鉴定抗原的成分。 实验类型：
（3） 对流免疫电泳 对流免疫电泳是双向扩散与 电泳技术相结合的一种方法。在PH8~8.6的缓冲溶 8-21火箭免疫电泳 液中，蛋白质抗原带负电，向阳极移动。抗体虽然 也是蛋白质，但等电点比抗原高，所带阴离子少且 分子质量大，移动缓慢，同电渗反而向阴极移动。 实验时，将免疫血清置琼脂板正极孔内。通电后， 在电场作用下，抗原向正极移动，抗体向负极移动， 在最适比例处相遇时即形成白色沉淀。由于电场作 用，既限制了抗原抗体向多方向扩散，有加速了泳 动速度，缩短了时间。 优点：时间短，灵敏度高。 缺点：特异性不如双扩散高。如图8-20 8-20对流免疫电泳
抗原
抗体
单向单扩散
2.单向双扩散 用内径8mm的试管，现将含有阳 性血清的琼脂加于管底，高约6mm， 中间加一层同样浓度的琼脂，先凝固 后加待测0.25ml抗原，37°或室温扩 散数日。抗原抗体在中间琼脂层相向 扩散，在平衡点上形成沉淀线。
单向双扩散
3. 双向双扩散
试验在玻璃板或平皿上进行,用1.6％~2.0％琼脂加一定 浓度的等量抗体浇成凝胶板厚度为2~3mm在其上打孔直 径为2mm，孔内滴加抗原液。抗原在孔内向四周辐射扩 散，在与凝胶中的抗体接触形成白环。此环随扩散时间 而增大。因此可用已知浓度的抗原制成标准曲线，即可 用以测定抗原的量。 此法在兽医临床已用于传染病的诊断：如马立克氏病的 诊断。将马立克氏病高免血清制成血琼脂平板，拔取病 鸡新换的有髓质的羽毛数根，将毛根剪下，插于血琼脂 平板，阳性者毛囊中病毒向四周扩散，形成白色沉淀环。
血清学反应
四、中和实验
病毒或毒素与相应Ig以一定比例混合后， 经过一定时间，病毒丧失对易感动物的致 病性，或消除毒素在试管内的溶血现象， 谓之中和反应。
该试验既可在体外进行，也可在体内进行， 可利用小动物、鸡胚、活细胞等作试验。 操作如下：
五、免疫荧光法
荧光素：如异硫氰酸荧光素（FITC）、丽 丝胺罗丹明B（RB200）等受紫外线照射 后可发荧光（FITC 为绿色，RB200为玫 瑰红色）。
补体结合反应的概念
➢ 补体结合反应（简称补反CFT）： 是指在补体参加下，以绵羊红细
胞（Ag）和抗绵羊溶血素（Ig）作为 指示系统的抗原抗体反应。
补体结合反应的原理
补反包括两个系统五种成分：
• 一是被检系统（溶菌系）中的 已知Ag、待检Ig及仅供一组 Ag-Ig系统反应的定量补体。
• 二是指示系统（溶血系）中的 红细胞和溶血素。
• 参与凝集反应的Ag称凝集原，Ig称凝集素。
• 平板法和试管法
2、间接凝集反应
• 先将可溶性Ag或Ig吸附于一种与免疫无关 的有一定大小的颗粒载体表面制成固相Ag 或Ig，再与相应的待检Ig或Ag结合产生的 反应。 分为两类： 间接血球凝集反应（HA） 间接血球凝集抑制反（HI）
• 间接血球凝集反应（HA）• 间接血球凝集抑制反（HI）
补体的特点
1、补体是酶类物质，但均以无活性的前体形 式存在于血清中
2、动物血清中尤其以豚鼠血清含量最高，故 多用豚鼠的新鲜血清作为补体的来源
3、补体性质不稳定，易失活，经56度30分 处理即灭活
4、补体本身没有特异性能与任 何一组抗原抗体复合物相结 合，一但结合后不再游离。
5、补体不与单独的抗原或单独 的抗体相结合。