微生物培养及实验基本操作技术
笔记7微生物的培养技术与应用
笔记7.微生物的培养技术及应用1.微生物的基本培养技术（1）培养基的配制①概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
②类型：A.按物理状态分类培养基种类特点用途液体培养基不含凝固剂，呈液体状态工业生产固体培养基含凝固剂(如琼脂)，呈固体状态微生物的分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏B.按化学成分分类C.按功能分类③成分成分含义作用来源碳源提供碳元素的物质构成生物体的细胞的物质和一些代谢产物，有些也是异养生物的能源物质无机碳源：CO 2、NaHCO 3等；有机碳源：糖类、牛肉膏(来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质)等氮源提供氮元素的物质合成蛋白质、核酸等物质无机氮源：N 2、NH 3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：蛋白胨等无机盐为微生物提供除碳、氮之外的各种重要元素，包括大量元素和微量元素为微生物提供无机营养，调节培养基的pH 等无机化合物：KH 2PO 4、K 2HPO 4、NaCl 等水生物体含量最高的无机化合物良好的溶剂，参与化学反应等培养基、代谢产物【特别提醒】除了上述主要营养物质外，还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。
例如，在培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素；在培养霉菌时，一般需要将培养基调至酸性；在培养细菌时，一般需要将(2)无菌技术①目的：获得纯净培养物。
②关键：防止外来杂菌的入侵。
培养基种类特点用途天然培养基含化学成分不明确的天然物质工业生产合成培养基培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成)微生物的分类、鉴定种类制备方法原理用途举例选择培养基培养基中加入某些化学物质依据微生物对某些物质的特殊需求或抗性从众多微生物中分离所需的微生物加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌鉴别培养基培养基中加入某种指示剂或化学药品产生特定的颜色或其他变化鉴别不同种类的微生物用伊红—亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌③区别：消毒与灭菌的比较比较项目条件结果常用方法应用范围消毒较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法不耐高温的液体化学药物消毒法操作空间、操作者的衣物和手等紫外线消毒法接种室、接种箱或超净工作台灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子高压蒸汽灭菌法培养基、容器等干热灭菌法玻璃器皿、金属用具等灼烧灭菌法接种工具等【特别提醒】选择无菌技术的原则：一要考虑无菌技术的效果，灭菌的效果比消毒要好；二要考虑操作对象的承受能力，活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能用灭菌。
微生物的基本操作方法
微生物的基本操作方法微生物是一类非常小型的生物体，只能在显微镜下看到。
它们在自然界中广泛存在，并且具有重要的生物活动和功能，如分解有机物质、循环物质、促进植物生长等。
为了研究微生物的特性和应用，人们需要进行基本的微生物操作。
下面将介绍几种常见的微生物操作方法。
一、培养微生物1.准备培养基：根据需要选择合适的培养基，如富含营养成分的琼脂培养基、专门用于细菌培养的LB培养基等。
2.无菌操作：在无菌条件下，将培养基装入培养皿中，然后进行高温高压灭菌，以杀灭培养皿中的微生物。
同时，需要采取一些措施，如佩戴无菌手套、使用无菌物品等，以防止外界细菌的污染。
3.接种微生物：常见的接种方法有划线法、转接法和点接法等。
在无菌条件下，用铲子或针头将微生物接种到培养基上，并在接种后进行标记。
4.培养微生物：将培养皿放入恒温培养箱或菌箱中，控制适当的温度、湿度和光线等条件，促使微生物的生长和繁殖。
二、分离微生物1.琼脂平板法：将微生物悬液均匀涂覆在琼脂培养基表面上，然后在恒温培养箱中孵育一段时间。
经过一段时间后，微生物会形成孤立的菌落，可以通过挑取单个菌落进行进一步培养和分离。
2.稀释平板法：将微生物悬液进行一系列的稀释，然后取稀释液不同浓度的样品分别接种到琼脂平板上，每个样品做3个平板。
经过孵育后，选取菌落数目适中的平板进行分离。
3.涂布法：将微生物悬液取适量涂布在琼脂培养基表面上，然后用铲子或棉签将微生物均匀分布。
经过一段时间后，可以通过挑选单个菌落进行分离。
三、培养微生物的纯种1.挑菌法：用细菌棒或鉗取器等工具挑取单个菌落，将其接种到新的培养基上。
挑菌时要注意不要将周围的细菌也一起转移过去。
2.瓢虫法：瓢虫法是一种传统的分离鉴定微生物菌落的方法。
先将一只瓢虫喂食一些菌落，然后观察虫子是否发生变化，若变化则证明该菌落能引起虫子的生理反应，即是一株有特定性质的微生物。
通过重复实验，可以筛选出具有特定性质的微生物。
3.连作法：将微生物连续传代培养，通过观察微生物的生长特性和表型变化，可以筛选出具有特定特性的纯种微生物。
微生物的基本操作方法
微生物的基本操作方法
微生物的基本操作方法包括以下几个方面：
1. 无菌操作：在进行微生物实验或培养时，需要保持操作环境的无菌。
操作者应注意洗手、穿戴实验服、戴手套，并在无菌工作台或无菌室内进行操作。
可用酒精灯或紫外线灯消毒操作区域，以杀灭空气中的微生物。
2. 培养基的制备：根据所需的微生物类型选择适当的培养基，并按照配方制备。
培养基通常包括基础培养基、食物源、pH调节剂和琼脂等成分。
制备时需要称取和溶解成分，并用高压蒸汽或高温灭菌来杀灭培养基中的微生物。
3. 培养器具的消毒：使用前要对培养器具进行消毒处理，常用的方法有高压蒸汽灭菌、高温灭菌、紫外线消毒等。
确保培养器具的表面和内部都不带有致病菌。
4. 菌种的接种：将所需的菌种接种到培养基上。
通常使用接种环、接种针或接种环针进行接种。
在接种时要注意无菌操作，以避免外来细菌的污染。
5. 培养条件：对于每一种微生物，根据其生长特性和要求，设置适当的培养条件。
例如，合适的温度、湿度、pH值和氧气浓度等都会影响微生物的生长。
6. 培养观察：在培养过程中，定期观察微生物的生长情况。
可以使用显微镜观察细菌或酵母菌的形态，或者通过目测观察细菌悬浊液的浑浊度和沉淀情况来判
断微生物是否生长良好。
7. 分离纯化：将培养基上生长的微生物单克隆分离纯化，得到纯系菌株。
通常可以使用藻糖水平板或琼脂斜面触点法进行分离，将不同的菌落孤立开来。
8. 培养维持：根据微生物的生长要求，每隔一段时间更换培养基、条件，以保持微生物的生长和繁殖。
同时，也需要妥善保存纯化的菌株，以备后续实验使用。
微生物实验技术操作手册
微生物实验技术操作手册一、实验介绍微生物实验技术操作手册旨在为研究人员提供详细的实验步骤和操作指南，以确保实验的准确性和可重复性。
本手册涵盖了微生物实验的基本原理、实验材料和设备的准备、实验步骤以及结果分析等内容。
通过遵循本手册的操作指南，研究人员可以顺利进行微生物实验，并获得可靠的实验结果。
二、实验材料和设备准备1. 实验材料：- 微生物培养基：根据实验需要选择适当的培养基，如LB培养基、TSB培养基等。
- 微生物菌种：根据实验目的选择所需的微生物菌种。
- 试剂：如抗生素、染料等。
- 培养皿、试管、移液器等实验器材。
2. 实验设备：- 培养箱：用于控制培养温度。
- 离心机：用于离心培养物。
- 恒温振荡器：用于培养物的摇床培养。
- 显微镜：用于观察微生物的形态和结构。
三、实验步骤1. 准备工作：- 消毒操作台和实验器材：使用适当的消毒剂对操作台和实验器材进行消毒处理，以确保实验环境的无菌。
- 培养基制备：按照培养基配方准备培养基，并进行高压灭菌处理。
- 微生物菌种制备：选择适当的菌种进行预培养，以获得足够的菌量。
2. 培养操作：- 接种：将预培养的菌种接种到含有适当培养基的培养皿或试管中。
- 培养条件控制：根据菌种的生长要求，设置适当的培养温度、pH值和培养时间。
- 培养物观察：使用显微镜观察培养物的生长情况，并记录相关数据。
3. 实验操作：- 抗生素敏感性实验：将不同浓度的抗生素添加到含菌培养基中，观察菌落的生长情况，以确定菌株对抗生素的敏感性。
- 染色实验：使用适当的染料对微生物进行染色，观察染色后的微生物形态和结构。
四、结果分析根据实验操作所获得的结果，进行相应的数据分析和结果解读。
通过比较不同实验组的结果，可以得出结论并提出相应的讨论。
五、注意事项- 操作前需仔细阅读实验操作手册，并按照操作指南进行实验。
- 严格遵守实验室的安全操作规程，佩戴适当的个人防护装备。
- 实验过程中保持实验环境的无菌和洁净。
微生物培养实验方法_
微生物培养实验方法_一、选材和操作环境1.选材：根据实验目的，选择适当的微生物进行培养。
可以选择广谱微生物培养基来适应多种微生物的生长，或者选用特定的微生物培养基来培养其中一种特定的微生物。
2.操作环境：为了避免实验污染和交叉感染，实验室应该严格执行无菌操作，使用无菌操作台进行培养实验。
二、无菌技术1.灭菌：使用高压蒸汽灭菌器或者乙醇灭菌器将培养器具、培养基和植物培养基灭菌，以杀灭存在的菌种。
2.无菌操作：将培养器具放在无菌操作台上，进行接种、移植以及采样等操作，确保操作过程中不受外界菌种污染。
三、液体培养实验1.静态培养：在无菌培养基中接种微生物，放入试管或培养瓶中，静置培养。
根据需求，可以在静态培养过程中添加适量的养分补充剂。
2.摇床培养：将含有微生物的培养基放在摇床上进行培养，设置合适的温度和摇动速度，可以促进微生物的生长和代谢。
3.发酵罐培养：将含有微生物的培养基放入发酵罐中进行大规模培养。
控制发酵罐内的温度、pH值、氧气供应等条件，可以实现微生物的高密度培养。
四、固体培养实验1.平板培养：将含有微生物的培养基倒入培养皿中，使其均匀分布在培养皿表面，待其凝固后，将微生物接种于其上。
培养过程中可以观察到微生物的孤悬、菌落的形成和生长情况。
2.涂布法：将含有微生物的培养基均匀涂布在玻璃片、培养皿或者培养瓶内壁上，形成薄膜状，待其凝固后，进行微生物的接种。
3.动植物体内培养：将微生物接种在动植物的体内，如动物的腹腔、皮肤或者植物的叶片、根系等，利用动植体提供的养分来满足微生物的生长需求。
五、检测微生物生长和代谢特性1.可视方法：通过观察培养基上微生物的生长情况、菌落的形态和颜色等，判断微生物的生长情况。
2.双抗法：使用特定的抗体和染料来染色微生物，使其表现出不同的颜色或者形态，以便于鉴别和分析微生物。
3.生化检测方法：通过检测微生物在培养基上产生的特定代谢产物，如酶活性、气体产生等，来评估微生物的生长情况和代谢特性。
微生物检验的基本操作技术
微生物检验的基本操作技术一、无菌操作技术1、定义是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法；无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。
2、内容无菌操作技术主要包括两方面：1）创造无菌的培养环境。
包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等；2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入的措施。
包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。
3、无菌操作原则1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区，接种时必须穿工作服、戴工作帽，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净；2）在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。
严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子等；3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或平皿边；4）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；5）接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必须时还要烧到环和针与杆的连接处；6）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。
倾倒平板应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。
二、无菌操作的环境要求1、无菌室（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间；（2）无菌室的消毒和防污染•每日（使用前）紫外线照射（0.5~1小时）；•每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒；•每季度用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时），特殊情况下可增加熏蒸频次。
（3）无菌室使用要求①无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作台面，不得存放与实验无关的物品；②无菌室使用前后应将门关紧，打开紫外线，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻拭擦，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响；③处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。
微生物技术操作规范
微生物技术操作规范1. 引言微生物技术是一种应用微生物进行实验以及工业生产的技术。
为了确保操作的准确性和安全性，制定和遵守操作规范非常重要。
本文档旨在提供微生物技术操作规范的指导，以确保操作的顺利进行。
2. 实验室环境要求在进行微生物技术操作前，确保实验室环境符合以下要求：- 实验室应具备良好的通风条件，保持适宜的温度和湿度。
- 实验室应保持整洁和清洁，定期清理工作台、设备和实验器材。
- 实验室应配备必要的安全设备，如消防器材、洗眼器、紧急照明等。
3. 个人防护措施在进行微生物技术操作时，必须采取个人防护措施以确保操作者的安全：- 操作者应佩戴实验室指定的个人防护用品，如实验服、手套、护目镜等。
- 操作者应洗手并戴上手套，避免直接接触微生物菌液。
- 当操作涉及到有毒或有害物质时，操作者应佩戴口罩或呼吸防护设备。
4. 操作流程微生物技术操作应按照以下流程进行：1. 准备工作：检查实验器材的完整性和清洁度，并准备所需的培养基和试剂。
2. 操作操作：根据实验要求进行微生物培养、转移、接种等操作。
3. 监控：定期观察培养物的生长情况，并记录相关观察数据。
4. 环境清理：操作完成后，及时清理工作台、设备和实验器材，妥善处理实验产生的废弃物。
5. 废物处理微生物技术操作产生的废弃物应按照以下要求进行处理：- 固体废弃物应正确分类，使用封闭进行收集，并交由专业机构进行处理。
- 液体废弃物应经过消毒处理后，在指定的污水排放口排放。
6. 安全意识教育为了提高操作者的安全意识和操作技能，应进行定期的安全意识培训和技术培训。
培训内容包括但不限于：- 微生物的基本知识和安全操作要求。
- 个人防护措施和实验室安全设备的正确使用方法。
- 废物处理和环境清理的规范要求。
7. 紧急情况处理在发生紧急情况时，操作者应立即采取适当的措施：- 火灾：立即使用消防器材扑灭火源，并按照应急预案进行疏散。
- 溢漏事故：快速将溢漏物清理，并采取适当防护措施，防止进一步扩散和伤害。
微生物试验基本操作
常用的基本操作技术（一）消毒和灭菌技术消毒（disinfection）与灭菌（sterilization）两者的意义有所不同。
消毒一般是指利用物理或化学方法消灭病原菌或有害微生物的营养体，而灭菌则是指利用强烈的物理或化学方法杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。
但日常生活中两者常常通用。
灭菌的方法很多，一般可分为物理灭菌和化学灭菌两大类。
1. 物理灭菌物理灭菌是最常用的灭菌方法。
主要包括热力学灭菌、过滤除菌和紫外线灭菌等。
（1）热力学灭菌又可分为干热灭菌和湿热灭菌两大类。
①干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
细胞内的蛋白质的凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快；含水量越小，凝固减慢。
因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度更高（160~170℃），时间更长（1~2h）。
进行干热灭菌时最高温度不能超过180℃，否则，包扎器皿的纸或棉塞就会被烤焦，甚至引起燃烧。
通常所说的干热灭菌是指利用干燥箱（或称烘箱）进行灭菌，主要用于玻璃器皿如培养皿、移液管和接种工具等的灭菌。
灭菌时将被灭菌的物体用双层报纸包好或装入特制的灭菌筒内，装入箱中，不要摆的太挤，以免妨碍热空气流通。
逐渐加温，使温度上升至160～170℃后保持2h。
灭菌结束后，切断电源，自然降温，待箱内温度降至70℃以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。
注意在温度降至70℃以前切勿打开箱门，以免玻璃器皿炸裂。
另外，灼烧灭菌也属于干热灭菌。
在进行无菌操作时，接种工具如接种环、接种钩、接种铲、镊子等要在酒精灯火焰上充分灼烧，试管口、菌种瓶口在火焰上作短暂灼烧灭菌等。
②湿热灭菌a.高压蒸汽灭菌此法是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾产生蒸气。
待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性达到灭菌的目的。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
微生物培养及实验基本操作技术一、培养基配制培养基是指人工配制的、适合于微生物生长繁殖或累积代谢产物所需的各种营养物的混合基质。
配制培养基是进行微生物检验工作的基础,甚至是任何与微生物有关工作的基础。
注意事項–灭菌锅的使用①加水盖过底部铁板—②放入东西—③关门—④調整溫度時間—⑤关紧泄压阀灭菌結束後，等压力降回零時才可打開門進入灭菌锅之物品，蓋子不可關太緊或太鬆拿滅菌後物品請記得帶耐熱手套培养基中的主要成分及其作用：营养物质：N源、C源、无机盐、生长因子、水常用的N源：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏常用的C源：糖、醇类物质（单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖；多糖：淀粉、纤维素、菊糖；醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油）水：用蒸馏水，不能用自来水凝固剂：琼脂、明胶、血清等抑制剂：1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率2、种类：盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素指示剂1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。
2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等。
培养基的类型：●根据培养基的物理状态来区分：1、液体培养基：主要用于增菌培养、鉴别性培养2、固体培养基：用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定3、半固体培养基：观察微生物的动力，有时用来保藏菌种4、脱水(商品)培荞基：脱水培养基也称为商品培养基、预制干燥培养基。
●将各种营养成分按比例配制完全,制成脱水的干粉状,装瓶出售;使用时只需按比例加人定量的水溶化、灭菌便可。
●根据培养基的用途来区分：➢增殖培养基选择培养基鉴别培养基1、增殖培养基：在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。
能够给微生物提供较适当的生长环境从而使微生物大量繁殖的培养基称为增菌培养基。
增菌、运送用培养基2、选择培养基：在培养基中加入抑制剂以杀死或抑制不需要的菌种,分离对象因对该抑制剂有抗性而正常生长繁殖的培养基,称之为选择培养基。
分离培养用的培养基3、鉴别培养基：在培养基中加入指示剂或化学药品,目的菌经培养后其代谢产物与化学试剂发生显色反应,因而用肉眼可快速鉴别出目的菌,这样的培养基称之为鉴别培养基。
例如:伊红美蓝培养基(EMB)就是一种常用的鉴别性培养基。
伊红美蓝培养基用于食品、乳制品、水源和病源标本中革兰氏阴性肠道菌的分离和鉴别鉴别用培养基4、活体培养基：病毒、立克次氏体等专性寄生微生物不能在一般培养基上生长,常用鸡胚、活细胞和动物进行培养。
采用鸡胚培养时,将微生物接到绒毛尿囊膜、尿囊、羊膜囊和卵黄囊中进行培养,即可得培养物。
细胞培养指将病毒接种到体外培养的活细胞上使其增殖。
（三）培养基制备的基本方法和注意事项•培养基的制备记录培养基成分的称取培养基各成份的混合和溶化•培养基pH的初步调正培养基的过滤澄清培养基的分装•培养基的灭菌培养基的质量测试培养基的保存1、培养基的制备记录•每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等。
•记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。
2、培养基成分的称取•培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。
可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上面做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。
完全称取完毕后，还应进行一次检查。
3、培养基各成份的混合和溶化•指示剂应在调节好pH值后再加入；煮溶后要补加足水份；•不能把培养基煮焦，焦化的不能使用。
4、培养基pH的校正灭菌后pH值会下降0.1～0.2，在做培养基校正pH值时，应比实际值高0.1～0.2；pH调整后，还应将培养基煮沸。
5、培养基的过滤澄清•液体培养基可用滤纸过滤法•琼脂培养基,可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤６、培养基的分装•斜面：1/５管半固体培养基：1/3管•高层斜面：1/4～1/3管平板：13~15ml7、培养基的灭菌（1）含糖类或明胶的培养基：113℃灭菌15分钟或115℃灭菌10分钟。
（2）无糖培养基：121℃灭菌15~20分钟。
（3）血液、体液和抗生素等以无菌操作技术抽取后再加入冷却至约50℃左右的培养基中。
（4）琼脂斜面培养基应在灭菌后冷至55℃-60℃时取出，再摆置成适当斜面。
8、培养基的质量测试（１）如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。
并测定其最终pH。
（２）将全部培养基放入36±1°C恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。
（３）用有关的标准菌株接种1~2管或瓶培养基，培养24～48小时，如无菌生长或生长不好。
应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。
9、培养基的保存（1）基础培养基不能超过两周（2）生化试验培养基不宜超过一周，（3）选择性或鉴别性培养最好当天使用，倾注的平板培养基不宜超过3天。
二、无菌技术指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。
消毒灭菌技术是微生物检验最基本的试验技术之灭菌：应用物理或化学的方法杀死或除去物品上或环境中的所有微生物称为灭菌。
经过灭菌以后的物品,应该不存在具有生命力的微生物营养体及其芽孢、孢子,即处于无菌状态,否则就是灭菌不彻底。
消毒应用物理或化学的方法杀死物体上或环境中绝大部分微生物(特别是病原微生物)。
物品消毒处理后,虽仍有少数微生物未被杀死,但已不致引起有害作用,故消毒实际上是不彻底的灭菌。
具有消毒作用的物质称为消毒剂。
消毒剂的杀菌作用是有限的,并不是所有的消毒剂都能将各种病原微生物杀死。
无菌：指没有具有生命力的微生物存在的意思。
只有通过彻底灭菌,才能达到无菌要求。
因此,灭菌是指对物品的作用,而无菌则是描述物品的状态。
灭菌是无菌的先决条件,无菌是灭菌后的结果灭菌方法：物理方法：加热法、过滤除菌法化学方法：化学消毒剂（一）无菌环境：无菌室无菌柜超净工作台1、无菌室：（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间（2）无菌室的消毒和防污染•每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）.•每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）.•每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。
2、超净工作台超净台的使用与保养:•（1）风速保持在0.32-0.48米/秒;•（2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上;•（3）让超净台预工作10－15分钟;•（4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净.（二）无菌器材•灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等.•消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等（三）无菌操作1、目的：（1）是保证待检物品不被环境中微生物的污染；•（2）是防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。
2、进入无菌室前的准备•（1）定期检查无菌环境的空气是否符合规定；•（2）用紫外线灭菌处理30~60分钟；•（3）检查无菌器材是否备齐；•（4）洗手消毒；•（5）手部消毒后，再穿戴无菌工作服。
3、检验操作过程的无菌操作要求•（1）在操作中不应有大幅度或快速的动作；•（2）使用玻璃器皿应轻取轻放。
•（3）在正火焰上方操作；•（4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；•（5）在接种培养物时，协作应轻、准。
•（6）不能用嘴直接吸吹吸管。
•（7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。
斜面接种时的无菌操作(1)接种环灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好棉塞无菌操作–斜面接种取菌技巧1. 接種環前端镍絲部分以酒精燈烧红灭菌，後端鐵棒部分過火2. 試管前端過火3. 打開試管蓋4. 試管傾斜，放入接種環5. 試管前端過火，蓋上試管蓋6. 接種環燒紅灭菌无菌操作–平板接种取菌技巧自Plate 上取單一菌落(方法一：蓋子微開遮住培养基，避免空氣中菌體掉入) 方法二：plate 反面拿起)无菌操作–吸球取菌技巧：1. 擠出安全吸球內空氣，插上灭過菌之玻璃吸管2. 向上為吸，向下為放无菌操作–移液器取菌技巧1. 調整Pipetman 刻度(P1000 吸取範圍200 ~ 1000μl)2. 插上灭過菌之Tip (用力插緊)3. 按鈕壓至第一段(不可壓至最底)4. 深入液面下2 ~ 4 mm5. 慢慢釋放按鈕，即可吸取液體无菌操作–接菌技巧1. 試管前端過火2. 打開試管蓋无菌操作–液体接菌技巧方法一：以接种环沾菌，放入新的培养基中接菌方法二：以安全吸球吸取菌液，放入新的培养基中，向下排出菌液方法三：以Pipetman 吸取菌液，按鈕壓至最底排出菌液三、微生物的接种与分离、纯化技术（一）接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。
1、接种工具和方法1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀2、常用的接种方法•１）划线接种２）点植接种３）穿刺接种４）倾注接种•５）涂布接种６）液体接种７）注射接种８）活体接种(二)、分离纯化1 稀释倾注平板法：1、先稀释样品，加入平板2、倒平板时注意培养基温度3、混合均匀３、平板划线法：.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法平板划线法：1、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。
2、划线方法四、微生物的培养方法（一）一般培养法（需氧培养）•培养温度:25~37℃；接种后平板、试管、三角瓶，置于恒温培养箱（二）、厌氧培养方法1、简易的厌氧培养法：•（1）庖肉培养法•（2）铁丝圈厌氧培养法•（3）焦性没食子酸法2、厌氧罐法3、厌氧手套箱法A、厌氧缸法：厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。
•接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养。
B、厌氧罐法：装入待培养的对象，然后密闭罐盖，接着可采用抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合气(N2∶CO2∶H2=80∶10∶10，V/V)。
（三）二氧化碳培养法•1、烛缸法2、二氧化碳置換法•3、化学法：每一升用重碳酸钠0.4克与浓盐酸0.35亳升加入•4、二氧化碳培养箱法五、微生物培养特性观察与记录•在固体培养基上，观察：菌落大小、形态、颜色、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。