试验一、DNA连接和转化
试验一、DNA连接和转化
质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。
一、实验目的
掌握DNA的连接方法和热激法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定原理和实验方法。
二、实验原理
1）限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA 产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA 的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。
2）TA克隆：克隆载体用限制性内切酶酶切后，再在两侧的3端添加“T”。大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3末端添加“A”的特性。二者在DNA连接酶的作用下利用粘性末端进行连接。
3）热激法：大肠杆菌在0 ℃CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA 形成抗DNase 的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，
经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。
三、仪器和材料
超净工作台、恒温培养箱、移液枪、冷冻循环水浴锅、恒温摇床。
pMD18-T Vector、DNA片段、Solution I、感受态细胞DH5α、Amp+ LB液体培养基、Amp-LB液体培养基、Amp-LB固体培养基、X-gal (20mg/ml)、IPTG(200mg/ml)。
四、实验步骤
1、连接反应步骤：
1）在离心管中配制下列混合溶液，全量为5μl。（冰上操作）
pMD18-T Vector 1μl
DNA 1μl
H2O 3μl
2）加入5μl的solution I。（冰上操作）
3）16℃反应30min。
2、转化反应步骤：
1) 将连接产物10μl加入到已制备好的感受态细胞中，冰上孵育30min。
2) 42℃水浴中热休克90s，立即冰上冷却2min。
3）加入200μl不含氨苄(amp)的LB液体培养基，37℃，150rpm，振荡培养40min。
4) 加40μl的X-Gal (20mg/ml)和8μl IPTG(200mg/ml)。
5) 约200μl转化产物涂布于培养平板上。放置于37℃培养箱，待溶液被琼
脂吸干，倒置平板，37℃，培养16h。
6）第二天上午观察蓝白斑筛选结果。
五、作业
1、实验结果。（平板图片）
2、在热激以后进行活化培养，这时的培养基中为什么不加入氨苄青霉素？
3、蓝白斑筛选的原理？
T载体与目的基因连接
一. 重组质粒的构建 T质粒载体 重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。 DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA 连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。 T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。 很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。 二. 感受态制备原理 细菌在0°C CaCl 低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易 2 吸收外源DNA的感受态。 三. β-半乳糖甘酶显色反应选择法 LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。 现在一些特定的质粒（比如pUC/pBS等），常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶N端146个氨基酸（α肽段）的编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（MCS）,它并不影响lacZ的表达。另外，常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段），的编码序列。在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。只有当携带α
载体与目的基因的连接与转化以及重组DNA的提取与酶切鉴定
实验一载体与目的基因的连接与转化以及 重组DNA的提取与酶切鉴定 一、实验目的 1.CaCl2法制备感受态细胞 2.目的基因与载体连接（c-myc+pSV2；粘端连接） 3.重组质粒转化大肠杆菌并筛选转化体（HB101；Amp r） 4.质粒DNA的小量快速制备 5.质粒DNA的限制性内切酶酶切 6.DNA的琼脂糖凝胶电泳 二、实验原理 通过粘端连接法将具有相同粘性末端的DNA分子连接在一起，通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构，利用连接酶发挥间断修复的功能，从而获得重组的DNA分子。 受体细胞经处理后（电击或CaCl2等处理），细胞膜通透性发生变化，从而使外源的载体分子通过感受态细胞，并使受体细胞获得新的稳定遗传的性状，该过程称为转化。由于本实验种pSV带有抗氨苄青霉素的基因，因而转化后的细胞在含氨苄青霉素的平板上培养可以筛选出转化成功的受体细胞。 分离质粒DNA的步骤包括：培养细菌使质粒扩增、收集和裂解细菌以及分离和纯化质粒DNA。SDS可以使细胞壁裂解，碱变性抽提质粒DNA的原理是利用染色体DNA与质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的，当pH＞12.6时，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA由于超螺旋共价闭合环状结构，两条互补链不会完全分离。当采用pH 4.8的NaAc高盐缓冲液调节pH至中性时，质粒DNA恢复原有的构型，而染色体DNA则不能复性而缠绕形成网状结构。通过离心可将染色体DNA及大分子RNA、蛋白质等去除。 三、实验器材和试剂 １.器材 恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴、台式离心机、低温离心机、涡旋振荡器、移液枪及枪头、1.5 ml离心管、制冰机、三角推棒、酒精灯、细菌培
目的基因的获取
目的基因的获取 实验报告 题目:单元一:目的基因的获取 指导老师:谭红铭张添元 日期:2013/10/17 一.实验目的: (1)掌握总RNA的提取方法和技术 (2)了解总RNA的提取要注意的问题 (3)了解用RT-PCR法获取功能基因的原理 (4)学习和掌握RT-PCR的技术方法 二.实验原理: (1)RNA提取:RNA在细胞中是与蛋白质结合在一起的。提取RNA时需先用强变性剂使蛋白质和DNA变性,同时抑制核糖核酸酶(RNase)的活性,然后通过有机溶剂如氯仿分层抽提去掉蛋白质和多糖等,最后通过RNA沉淀剂如异丙醇的帮助下沉淀分离RNA。 (2)RT-PCR:总RNA中的mRNA体外在反转录酶的作用下可合成与mRNA互补的单链DNA,称为互补DNA(cDNA),再在DNA聚合酶的作用下,以cDNA第一链为模板,以四种脱氧核苷酸(dNTP)为材料,在引物的引导下,合成大量双链DNA。 三.实验材料: 斑马鱼、Trizol Reagent(Invitrogen)、DEPC处理的超纯水、氯仿、异丙醇、无水乙醇、高速离心机、各种规格的RNase Free的枪头、EP管、RNase Free 的烧杯及量筒玻璃棒等、新开的大滤纸、碎冰及泡沫冰盒 四.实验准备: 由于实验过程中实验者手、臂上的细菌和真菌,人体自身分泌的RNase如手汗和唾液会带入试管或污染用具,使RNA降解,因而实验一开始就必须自始至终佩带口罩及乳胶手套,并经常更换。 五.实验步骤、现象、结果及分析: Ⅰ总RNA提取: ⑴取斑马鱼一条,用滤纸吸干水,至于电子秤平内称重,为,后置于研钵,用大勺子往其中加入液氮,待其冷冻后,开始研磨,使其始终保持粉末状,由于液氮挥发,需补充液氮,直至彻底研磨至面粉状细末为止。
目的基因T载体克隆实验步骤
PCR产物的T载体克隆 实验原理 一.重组质粒的构建： 重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。 DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA 连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP 复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。 很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。 二.感受态制备原理 细菌在0 C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。 三.β-半乳糖甘酶显色反应选择法（蓝白筛选）原理 LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。 现在一些特定的质粒（比如pUC/pBS等），常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶N端146个氨基酸（α肽段）的编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（MCS）,它并不影响lacZ的表达。另外，常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段），的编码序列。在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。只有当携带α肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物IPTG的诱导下，载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶N端（α肽段），这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段）互补，形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。 而当外源基因插入到此种载体质粒lacZ的多克隆位点后，会造成lacZ基因不能表达，从而不能合成β—半乳糖核苷酶；而对于空载体，lacZ基因正常表达，通过α互补合成β—半乳糖核苷酶，分解培养基里的色素底物X-gal，最终形成蓝色的化合物，出现蓝色菌斑。
试验一、DNA连接和转化
试验一、DNA连接和转化 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。 一、实验目的 掌握DNA的连接方法和热激法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定原理和实验方法。 二、实验原理 1）限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA 产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA 的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。 2）TA克隆：克隆载体用限制性内切酶酶切后，再在两侧的3端添加“T”。大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3末端添加“A”的特性。二者在DNA连接酶的作用下利用粘性末端进行连接。 3）热激法：大肠杆菌在0 ℃CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA 形成抗DNase 的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，
经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。 三、仪器和材料 超净工作台、恒温培养箱、移液枪、冷冻循环水浴锅、恒温摇床。 pMD18-T Vector、DNA片段、Solution I、感受态细胞DH5α、Amp+ LB液体培养基、Amp-LB液体培养基、Amp-LB固体培养基、X-gal (20mg/ml)、IPTG(200mg/ml)。 四、实验步骤 1、连接反应步骤： 1）在离心管中配制下列混合溶液，全量为5μl。（冰上操作） pMD18-T Vector 1μl DNA 1μl H2O 3μl 2）加入5μl的solution I。（冰上操作） 3）16℃反应30min。 2、转化反应步骤： 1) 将连接产物10μl加入到已制备好的感受态细胞中，冰上孵育30min。 2) 42℃水浴中热休克90s，立即冰上冷却2min。 3）加入200μl不含氨苄(amp)的LB液体培养基，37℃，150rpm，振荡培养40min。 4) 加40μl的X-Gal (20mg/ml)和8μl IPTG(200mg/ml)。 5) 约200μl转化产物涂布于培养平板上。放置于37℃培养箱，待溶液被琼 脂吸干，倒置平板，37℃，培养16h。 6）第二天上午观察蓝白斑筛选结果。 五、作业 1、实验结果。（平板图片） 2、在热激以后进行活化培养，这时的培养基中为什么不加入氨苄青霉素？
分生实验报告 目的基因与载体连接、 感受态制备及转化
目的基因与载体连接、感受态制备及转化 【实验原理】 1；酶促生物化学反应过程 在一定的条件下，由DNA连接酶催化目的基因与载体相邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯键的过程。相同或不同的限制性内切酶产生相同的粘性末端，在降至退火温度时，能重新互补结合，在DNA连接酶的催化下，目的基因与载体相连接。 2；DNA连接酶的分类： T4 DNA连接酶：催化dsDNA粘末端连接及平端连接 大肠杆菌DNA连接酶：不能催化平末端连接,其底物只能是带缺口的双链DNA分子和具同源互补粘末端的不同DNA分子 3；T4 DNA连接酶：来源T4噬菌体感染的大肠杆菌 最佳pH值7.2～7.8，常用的反应液为pH7.6 的Tris-HCl缓冲液 需ATP，Mg2+参加反应 二硫苏糖醇等巯基化合物可促进连接酶的连接 作用；高浓度的Na+、K+等抑制酶的活性。 4；受体分类：受体细胞也称为宿主，是重组子扩增及表达的场所，分为原核细胞和真核细胞两类。 5；应用：原核细胞：重组子复制扩增，外源基因表达系统 真核细胞：主要用于外源基因的表达 6；转化：特指以质粒DNA活以它作为载体构建的重组子导入细菌的过程。 转染：指噬菌体、病毒或以它们作为载体构建的重组子导入细胞的过程。 7；感受态细胞：受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为最适摄取和容纳外源DNA的生理状态。 常用方法：0.1mol/L CaCl2 特点：a.重组酶缺陷，限制修饰系统缺陷 b.不存在载体的筛选标记 c.接受DNA的位点暴露 d.细胞膜通透性增加 8；不同层次,不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子，以及鉴定所需的特异性重组子。 直接筛选：针对载体携带的标记和插入DNA片段 1.抗性筛选（抗生素平板，ampR , tetR , neoR） 2.标志补救（α-互补，蓝白斑筛选) 3.PCR 4.限制性内切酶消化 4.DNA测序 间接筛选：针对插入片段的蛋白产物，免疫学筛选 9；蓝白斑筛选是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都
生物人教版选修3检测：专题1 1.2 第1课时 目的基因的获取 基因表达载体的构建 含解析
1.2 基因工程的基 本操作程序 第1课时目的基因的获取基因表达载体的构建 一、选择题 题型一基因工程的基本操作步骤 1．基因工程主要操作步骤的顺序是() ①基因表达载体的构建②将目的基因导入受体细胞 ③目的基因的检测与鉴定④目的基因的获取 A．③②④①B．②④①③ C．④①②③D．③④①② [答案] C [解析]基因工程的主要操作步骤顺序：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定。 题型二目的基因的获取 2．获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是() A．从基因组文库中获取B．从cDNA文库中获取 C．直接从受体细胞中提取D．利用PCR技术获取 [答案] C
[解析]获取目的基因的方法有多种，例如可以从基因组文库中获取目的基因，可以从cDNA文库中获取目的基因，也可以利用PCR技术获取目的基因，故A、B、D不符合题意；受体细胞是接受目的基因的细胞，受体细胞自身不含目的基因，C符合题意。 3．下列关于基因文库的说法，错误的是() A．可分为基因组文库和部分基因文库 B．cDNA文库属于部分基因文库 C．基因组文库的基因在不同物种之间均可进行基因交流 D．同种生物的cDNA文库中基因数量较基因组文库少 [答案] C [解析]基因组文库中只有部分基因能够在不同物种之间进行基因交流。 4．下列有关PCR技术的说法，不正确的是() A．PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术 B．PCR技术的原理是DNA双链复制 C．利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列 D．PCR扩增中需要解旋酶解开双链DNA [答案] D [解析]利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，C正确；PCR扩增中目的基因受热变性后解链为单链，不需要解旋酶解开双链DNA，D错误。 5．某基因比较小，且核苷酸序列已知，获得该基因的最佳方法是() A．以mRNA为模板反转录合成DNA B．以4种脱氧核苷酸为原料人工合成 C．将供体DNA片段转入受体细胞中，再进一步筛选 D．先建立基因文库，再从中筛选 [答案] B [解析]目的基因的获取方法主要有三种：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、人工合成。对于比较小且核苷酸序列已知的目的基因，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。 6．下列有关获取目的基因的叙述，不正确的是()
获得目的基因的方法
获得目的基因的方法 常用的方法有PCR法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选 一、直接获取 1、从基因文库中获取 就是从现成的基因储存在受体菌上提取出来（基因组文库法就是原教材中的用限制性内切酶直接获取。利用λ噬菌体载体构建基因组文库的一般操作程序如下：①选用特定限制性内切酶，DNA进行部分酶解，得到DNA限制性片段②选用适当的限制性内切酶酶解λ噬菌体载体DNA。③经适当处理，将基因组DNA 限制性片段与λ噬菌体载体进行体外重组。④利用体外包装系统将重组体包装成完整的颗粒。⑤以重组噬菌体颗粒侵染大肠杆菌，形成大量噬菌斑，从而形成含有整个DNA的重组DNA群体，即文库。） 2、cDNA文库法 即逆转录法。cDNA文库，是指汇集以某生物成熟mRNA为模板逆转录而成的cDNA序列的重组DNA群体。虽然可用基因组文库法来获取真核生物的目的基因，但是由于高等真核生物基因组DNA文库比其cDNA文库大得多，相关工作量同样大得多。更为重要的是，在真核生物基因组中合有大量的间隔序列或内含子，但在大肠杆菌等原核生物中没有类似序列的存在，所以大肠杆菌不能从真核生物基因的初级转录本中去除间隔序列，即不能表达真核生物DNA。而在真核生物成熟mRNA中已不存在间隔序列（已在拼接过程中被去除），所以可以以真核生物
成熟mRNA为模板，逆转录而成的cDNA可被大肠杆菌表达。因此，在基因工程中，cDNA文库法是从真核生物细胞中分离目的基因的常用方法。 3.直接分离基因 最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。 这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。鸟枪法的具体做法是：用限制酶（即限制性内切酶）将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分别在受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法吧带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫，抗病毒的基因都可以用上述方法获得。 用“鸟枪法”获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。 二、人工合成 1、固相亚磷酸酰胺法 主要针对是序列已知的基因，通过DNA自动合成仪，通过固相亚磷酸酰胺法合成，可以按照已知序列将核苷酸一个一个连接上去成为核苷酸序列，一般适于分子较小而不易获得的基因。对于大的基因一般是先用化学合成法合成引物，再利用引物获得目的基因。
目的基因的直接转化法和间接转化法
植物基因工程中目的基因的转化方法 张亚欢 20102170231 目的基因的直接转化法和间接转化法 摘要: 植物基因工程中目的基因的转化方法有间接转化法和直接转化法，主要阐述各种转化方法的原理、特点，以期为植物转基因方法的选择提供帮助. 关键词:植物基因工程; 转化方法; 间接转化法; 直接转化法 植物基因工程是通过导入外源基因对植物进行遗传转化，使植物获得抗虫、抗病、抗逆境、优质高产以及生产药物等诸多能力，从而使人们最大限度地利用植物资源。在植物基因工程中最为关键的是植物基因工程技术，该技术是以纯化的外源DNA导入植物细胞以期获得转基因植物的方法，其内容包括:目的基因的分离和鉴定；植物表达载体的构建；植物细胞的遗传转化；转化值物细胞的筛选；转基因植物的鉴定；外源基因表达的检测等[1]。自20 世纪90 年代以来，人们对外源基因导入植物细胞进行了大量的研究，先后采用了多种方法对目的基因进行遗传转化，迄今为止，已经建立了10 余种基因转化方法，这些方法可以分为两大类: 即间接转化法和直接转化法. 下面就这两类转化方法从其原理、特点作一简单介绍. 1 间接转化法 间接转化法是以生物体为媒介的植物转基因方法，有农杆菌介导法和病毒介导法. 1.1 农杆菌介导法 农杆菌介导法是以农杆菌为媒介对植物进行遗传转化的方法，该方法广泛地应用于愈伤组织、悬浮细胞、叶圆盘、茎切段、子叶切片、下胚轴切段、大田植株花茎的切段和薄层细胞等离体材料的转化，是目前双子叶植物常用的基因转移方法. 它是通过根癌农杆菌(Agrobacterim tumefaciens)的Ti 质粒(Tumer inducing plasmid) 和发根农杆菌(Agrobacterim rhizogenis )的Ri质粒(Root inducing Plasmid) 上的一段T一DNA区在农杆菌侵染植物形成肿瘤的过程中，T一DNA可以被转移到植物细胞并插入到染色体基因中[2]。由于T一DNA能够进行高频率的转移，而且Ti质粒和Ri质粒上可以插入到50kb 的外源基因，因此Ti 质粒和Ri质粒就成为植物基因转化的理想载体系统. 1.1.1 Ti 质粒载体系统 Ti 质粒是Lenent 等从根癌农杆菌中分离到的一种巨大质粒，可将外源基因置换T一DNA中的非必需序列使得外源基因整合到受体染色体上而获得稳定的表达，并能使植物细胞转化为肿瘤状态，大量合成冠瘿碱。冠瘿碱是根癌农杆菌的唯一碳源，有利于根癌农杆菌的繁殖和Ti质粒的转移，并进一步扩大侵染领域。 随着根癌农杆菌介导法基因转化技术的逐渐成熟与完善，它已成为常规育种的重要辅助手段，但在植物基因工程的实际操作中使用野生型的Ti 质粒直接作为基因克隆的载体仍然还有一些困难：①Ti质粒分子量很大，很难用常规的方法操作，另外在T一DNA 区段上不可能找到单一的DNA限制内切酶位点，不能插入外源DNA片段; ②野生型Ti 质粒对感染的植物具有毒性并能诱发冠瘿病，导入植物组织使其不能再生出健康的正常植株[3]，因此野生型的Ti 质粒必须经过
DNA连接反应
DNA连接反应 （一）外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应 外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌ＤＮＡ连接酶和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶。实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。 ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。在瓜作用的底物。如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。这倦，在ＤＮＡ浓度低时，质粒ＤＮＡ重新环化将卓有成效。如果连接反应中ＤＮＡ浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也有所增大。因此在ＤＮＡ浓度高时，连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。Dugaiczyk等(1975;同时参见Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第２、３期合刊）从理论上探讨了ＤＮＡ浓度对连接产物性质的影响。简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j和i。j是ＤＮＡ分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的ＤＮＡ呈随机卷曲。这样，j与ＤＮＡ分子的长度成反比（因为ＤＮＡ越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互作用），因此j对给定长度的ＤＮＡ分子来说是一个常数，与ＤＮＡ深度无关。j＝[3/(3πlb0)]3/2其中l是ＤＮＡ长度，以cm计，b是随机卷曲的ＤＮＡ区段的长度。b的值
目的基因片段与克隆载体质粒的连接操作步骤
连接反应总体积为10μL，体系组成如下： 回收纯化的PCR扩增目的基因片段 7.0μL 10×Ligation buffer 1.0μL T载体（10ng/μL） 1.0μL T4 DNA ligase 1.0μL 共10.0ul 混均后，4℃连接18-24小时，连接所得克隆载体命名为TA-VP4-STI。 转化操作方法 1）取一管-80℃保存的感受态细胞，置冰上融化； 一次转化感受态细胞的建议用量为50-100ul,应注意所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以100ul为例： 2）加入连接物（50ul的感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和），轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min；
3）将离心管置于42℃热击60-90秒，然后迅速置冰浴2-3分钟，该过程不要摇动离心管； 4）向每个离心管中加入500ul液体LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床振荡培养45分钟（150转/分钟）；目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。 5）将离心管内容物混匀，吸取100ul已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的LB固体琼脂培养基上（含50 ug/ml氨苄青霉素），用无菌的弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16小时。至红、白斑区分明显为止。 涂布用量可根据具体试验来调整：如转化的DNA总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200-300ul 转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心 （4000rpm,2min）后析除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板）
T载体与目的基因连接
一. 重组质粒的构建T 质粒载体 重组的 DNA 分子是在 DNA 连接酶的作用下，有 Mg2 、 ATP 存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。 DNA 连接酶有两种：T4 噬菌体 DNA 连接酶和大肠杆菌 DNA 连接酶。两种 DNA 连接酶都有将两个带有相同粘性末端的 DNA 分子连在一起的功能，而且 T4 噬菌体 DNA 连接酶还有一种大肠杆菌 DNA 连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链 DNA 分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高 T4 噬菌体 DNA 连接酶浓度或增加 DNA 浓度来提高平末端的连接效率。 T4 噬菌体 DNA 连接酶催化 DNA 连接反应分为 3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子 ATP 形成酶-ATP 复合物；然后，酶-ATP 复合物再结合到具有 5'磷酸基和 3'羟基切口的DNA 上，使 DNA 腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。 很多 DNA 聚合酶在进行 PCR 扩增时会在 PCR 产物双链 DNA 每条链的 3'端加上一个突出的碱基A。pUCm-T 载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3'端带有一个突出的 T。这样，pUCm-T 载体的两端就可以和 PCR 产物的两端进行正确的 AT 配对，在连接酶的催化下，就可以把 PCR 产物连接到 pUCm-T 载体中，形成含有目的片断的重组载体。 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接 12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。 二. 感受态制备原理 细菌在0°C CaCl2 低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源 DNA 的感受态。 三. β-半乳糖甘酶显色反应选择法 LacZ 基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。β—半乳糖核苷酶是由 4 个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。 现在一些特定的质粒（比如 pUC/pBS等），常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶N 端 146个氨基酸（α肽段）的编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（MCS）,它并不影响lacZ的表达。另外，常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C 端部分序列（β肽段），的编码序列。在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。只有当携带α 肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物IPTG的诱导下，载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶 N 端（α肽段），这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶C 端部分序列（β肽段）互补，形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。 而当外源基因插入到此种载体质粒 lacZ的多克隆位点后，会造成 lacZ基因不能表达，从而不能合成β—半乳糖核苷酶；而对于空载体，lacZ基因正常表达，通过α 互补合成β—半乳糖核苷酶，分解培养基里的色素底物 X-gal，最终形成蓝色的化合物，出现蓝色菌斑。 实验准备：清洗，5 个 100ml 锥形瓶（外加 1 个小的），6 副培养皿，3 个小试剂瓶，接种环，涂布棒。准备 100ml 超纯水。溶液:LB300ml（液体 50ml+50ml，固体 100ml），
DNA连接反应的步骤及说明
快速DNA连接试剂盒 概述: 克隆中两个重要步骤包括外源DNA与载体的连接和重组DNA的转化。连接反应是通过连接酶完成的，连接反应需要ATP和镁离子催化双链DNA的3’-OH 和5’-P形成磷酸二酯键。DNA末端可以是粘末端，也可以是平末端。粘末端连接反应效率高于平末端连接效率。因此，在连接平末端分子时DNA 浓度要高于粘末端分子连接反应的DNA浓度。PEG可以使T4 DNA连接酶对平末端和粘末端连接效率得到提高[Pheiffer, B.H., Zimmerman, S.B., Nucleic Acids Res., 11, 7853-7871, 1983]。由于PEG可以辅助提高连接效率，该试剂盒对于粘末端和平末端的连接只需十分钟即可完成。试剂盒中提供独特的5×Rapid Ligation Buffe，专为提高DNA连接效率设计。高的PEG浓度可以提高连接反应效率但却会使转化效率降低，因此应该对PEG浓度进行优化。该试剂盒中优化的PEG浓度同时保证了高的连接效率和转化效率。 目录号规格价格 LINK-3030次180元 保存： 试剂盒中所有组分需-20℃保存。请不要用其它试剂替代该试剂盒中的反应缓冲液。 试剂盒包装组成： 该试剂盒中提供的试剂可以完成30×20μl DNA连接反应。 试剂盒组成规格( 30 reactions ) T4 DNA ligase 30μl 5×Rapid Ligation Buffer 200μl (5x RLB) 特点: 室温（20-25℃）连接10-30 min。 存储缓冲液： 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) 50 mM KCl 1 mM Dithiothreitol 50% Glycerol 质量控制： 试剂盒中提供的T4 DNA连接酶没有检测到外切核酸酶或内切核酸酶活性。另外每一批连接酶都通过SDS聚丙烯酰胺凝胶检测蛋白污染（低于5%）。 ·核酸外切酶污染检验 T4 DNA连接酶与1mg经超声波处理的3H标记的E.coli DNA (105cpm/mg)在50ml反应体系中，采用随酶提供的Rapid Ligation Buffer，
T载体与目的基因连接
一. 重组质粒的构建T质粒载体 重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。 DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA 连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。 T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。 很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。 二. 感受态制备原理 低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易细菌在0°C CaCl 2 吸收外源DNA的感受态。 三. β-半乳糖甘酶显色反应选择法 LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。 现在一些特定的质粒（比如pUC/pBS等），常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶N端146个氨基酸（α肽段）的编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（MCS）,它并不影响lacZ的表达。另外，常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段），的编码序列。在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。只有当携带α肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物IPTG的诱导下，载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶N端（α肽段），这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段）互补，形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。