大鼠急性脑缺血及缺血再灌注中ERK5的表达情况

大鼠急性脑缺血及缺血再灌注中ERK5的表达情况摘要】目的：观察大鼠脑皮质中细胞外信号调节激酶5(ERK5)在缺血及缺血再灌的不同表达，探讨其在脑缺血再灌注损伤中的意义。

方法：采用线栓法建立大脑中动脉闭塞( MCAO) 模型，所有大鼠随机分为假手术组、缺血梗死组和缺血再灌组。

对各组大鼠行神经功能评分，TTC染色测定脑梗死体积，免疫组织化学法测定ERK5表达。

结果：缺血再灌注组大鼠的神经功能缺损和脑梗死体积均比缺血梗死组大鼠严重。

ERK5在缺血梗死组和缺血再灌组都表达，后者明显多于前者。

结论：ERK5可能参与脑缺血再灌注损伤过程并起着重要作用。

【关键词】脑缺血；缺血再灌注损伤;细胞外信号调节激酶5(ERK5);表达【中图分类号】R742 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）10-0172-02Expression of ERK5 in rats cortex afer cerebral ischemia and reperfusion TAN Zhongxu1,SONG Yuqiang2,LV Jinglei3,YU Liqun1,SHI Shenggui11Qingdao University Medical College,Qingdao 266021,China.2Department of Neurology,the Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003,China .3 The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China 【Abstract】Objective To observe the different expression of ERK5 in rats cortex in response to cerebral ischemia and ischemia/reperfusion, and investigate the significance in ischemia/reperfusion injury.Methods Blocking middle cerebral artery with intraluminal thread was used to build cerebral middle artery infarction model ( MCAO).All rats were randomly divided into sham operation group,ischemia groupand ischemia/reperfusion (I/R)group.The Longa score was used to evaluate revived rats and TTC staining was used to determine the infarct volumes.we investigated the activation and expression of ERK5 by immunohistochemistry.Results 24 hours after MCAO, neurological function scores were significant increased in I/R group compared with ISCH group. the infarct volume was in I / R group was larger.The activation of ERK5 was rapidly induced by ischemia, and I/R group were significantly higher than Ischemia group.Conclusion We hypothesize that ERK5 might participate in the pathogenesis of isehemic/reperfusion and play an important effect duringischemia/reperfusion injury.【Key words】 Cerebral ischemia ;Ischemia/reperfusion injury; Extracellular signal regulated protein kinase(ERK5); Expression1.前言治疗急性脑缺血患者的最佳办法是能及时恢复脑组织血液供应, 然而恢复血流灌注给脑组织带来新的损伤, 即缺血再灌注损伤。

目前研究证明，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）参与脑缺血再灌注损伤的过程[1]。

其中，细胞外信号调节激酶5（ERK5）是新发现的成员[2]。

本实验通过采用线栓法构建大脑中动脉闭塞(MCAO) 模型，观察大鼠脑皮质ERK5在缺血及缺血再灌24h的不同表达情况，探究其在缺血再灌损伤中的可能作用。

2.材料与方法2.1 动物选择8周龄成年健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠50只，体重220～260g, 由青岛市药物检验所实验动物中心提供。

实验前将动物置于实验室1周适应环境,均自由饮水、进食,实验室室温(25±2)℃,相对湿度65%,自然光照。

2.2 方法2.2.1动物模型的建立和分组大鼠制备局灶性脑缺血再灌注模型，采用Zea-Longa等的大脑中动脉线栓法[3]。

具体步骤如下：采用2.0鱼线为栓线，以10％水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧固定，分离并暴露右侧颈总动脉（common carotid artery,CCA）、颈内动脉（internal carotid artery,ICA）和颈外动脉（external carotid artery,ECA），结扎并切断ECA及其分支，沿根部结扎ICA颅外分支翼腭动脉。

由ECA残端插入一根鱼线，沿ECA、CCA分叉部和ICA轻轻推进，至ICA颅内分叉处时可阻断流入大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA）的血流，进线长度为18～20mm。

假手术组大鼠只暴露动脉，不进行插线操作。

所有麻醉大鼠苏醒时间要求在术后2小时之内，未苏醒者剔除。

待神经功能评分后，将符合实验要求的大鼠（即建模成功）随机分为缺血再灌组（I/R组）和缺血梗死组（ISCHE组）。

缺血再灌组：大脑中动脉阻闭2h后，抽出约10mm鱼线，恢复血流灌注24h；缺血梗死方法：大脑中动脉阻闭2h后不拔鱼线，继续阻塞24h。

最后心脏灌注取脑，用4％的多聚甲醛灌注固定，制备石蜡切片。

2.2.2神经功能评分和脑梗死体积的测定参照Zea-Longa[3]、谢惠芳等[4]TTC染色法分别进行神经功能评分和测定脑梗死体积。

2.2.3免疫组织化学法（SABC法）检测ERK5蛋白表达石蜡切片脱蜡至水，0.01M PBS溶液洗2min×3次；3%H202室温lOmin灭活内源性酶；微波修复抗原；滴加5%BSA封闭液,室温孵育20min；滴加羊抗大鼠ERK5单克隆抗体（1: 200）,4℃过夜；滴加生物素化二抗,37℃反应30min；用SABC免疫组化试剂盒染色，DAB显色。

所有切片均在同一放大倍数下进行观察，每张切片先在低倍镜下随机选择梗死灶周围区4个象限视野，然后在高倍镜下(400倍)选择缺血灶周围5不连续的视野观察，计数阳性细胞，取其平均值。

2.3 统计学处理采用SPSS 18.0软件包进行统计处理,数据均采用均值±标准差(x-±s)表示,各组间差异比较用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3.结果3.1 神经功能评分和梗死体积测定模型组老鼠均出现严重的神经功能缺失,且两组间评分差异具有统计学意义(P＜0.05，t=3.623)。

假手术组大鼠脑组织未见梗死灶,脑组织呈粉红色；模型组均见不同程度的梗死灶,梗死灶呈白色；梗死组体积小于再灌组，两者间差异具有统计学意义(P<0.05，F=1.433)。

3.2 ERK5的表达假手术组大鼠皮质区神经细胞内ERK5蛋白几乎不激活表达。

然而，模型组大鼠缺血侧皮质区均可见ERK5阳性细胞分布，在细胞浆和细胞核内呈棕黄色着色。

其中，再灌组的阳性细胞数明显高于梗死组 (P<0.05，t=8.876)。

注：与假手术组比，*P＜0.01;与缺血梗死组比，#P＜0.054.讨论丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated proteink inases, MAPKs)家族在哺乳动物细胞内广泛表达，是一个介导细胞反应的重要信号系统，参与介导各种细胞过程。

ERK5 是新发现的一个成员，在许多组织细胞中都有表达,最高表达水平被发现在大脑[2]，参与不同病理生理过程：缺血性损伤、肿瘤细胞的增殖、分化、动脉粥样硬化以及细胞凋亡等，可被低氧、缺血、高渗溶液、层流剪切应力等多种细胞外刺激激活；神经营养因子（BDNF）、生长因子(VEDF、EGF)和特定的炎症因子也可激活ERK5表达[5-6]。

在脑缺血和缺血再灌时,ERK5在堵塞的大脑中动脉供应区域大量激活表达，再灌注触发的级联炎症反应会不断破坏血脑屏障，导致脑水肿加重损伤；同时大量炎症因子使ERK5的表达增多。

本实验结果与之相符：与缺血梗死组相比，虽然灌注组梗死灶中心区范围较少,但周围区范围却大,组织水肿程度明显加重，以神经元的凋亡为主，而且ERK5阳性细胞数更多。

现阶段，ERK5在脑缺血再灌注损伤中作用的研究极少，其具体的作用机制并不十分明确。

Wang[12]通过使用抑制剂N-乙酰半胱氨酸（缺血后ERK5活性的剂量依赖性抑制剂）使ERK5的蛋白表达降低以及CA3/DG区的神经元大量死亡，提出了脑缺血时海马区ERK5的激活可减少脑缺血损伤时神经元的凋亡,起到神经保护作用。

然而，皮质区ERK5的激活表达是否也是如此，还需要进一步的实验验证。

本实验证实了脑缺血及缺血再灌时ERK5在大鼠皮质区的表达，表明其参与脑缺血再灌注损伤过程，推测也可减少神经元的凋亡，起着神经保护作用，为临床治疗再灌损伤提供一种新的诊疗方法和思路。

【参考文献】[1] Melissa R, etal. Phosphatase-mediated cross talk between MAPK signaling pathways in regulation of cell survival [J] . FASE BJ.2008, 22, 954-965.[2] L. Liu, J.E. Cavanaugh, Y. Wang, H. Sakagami, Z. Mao, Z. Xia, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100 (14) (2003)8532-8537.[3] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]. Stroke, 1989, 20(1):84-91.[4]谢惠芳,徐如祥,陈中灿.线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型的改进[J].中华神经医学杂志,2007, 6: 340-342.[5] Kato Y,Chao TH,Hayashi M,et al. Role of BMK1 in regulation of growth factor-induced cellular responses. Immunol Res. 2000,21(2-3):233-7.[6] Yoshizumi M,Kyotani Y,Zhao J,et al.The role of big mitogen-activated protein kinase1 (BMK1) / extracellular signal-regulated kinase 5 (ERK5) in the pathogenesis and progression of atherosclerosis.J Pharmacol Sci. 2012,120(4):259-63.[7] Wang RM,Zhang QG,Li CH，et al．Activition of extracellular singal-regulated Kinase 5 may play an neuroprotective role in hippocampal CA3/DG region after cerebral ischemia.J Neurosci Res,2005,80(3):391-399.。