微生物学设计性实验--细菌耐受噬菌体突变率测定(精)
噬菌体的快速检测与防治
噬菌体快速检测方法一、目的要求1.定期检测生产车间空气中和二级种子罐培养液中的噬菌体污染度，观察噬菌斑的形态和大小。
2.学会快速检查发酵液中是否被噬菌体污染的方法。
二、基本原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物细胞的病毒，某种噬菌体往往只能感染一种或与它相近的某种细菌。
按其感染细菌的过程分两类：大多数烈性噬菌体侵染细菌后迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，因而可在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的噬菌斑如图1。
温和噬菌体侵染细菌后呈原噬菌体（或称前噬菌体）状态，一般不引起细菌裂解，使宿主成为溶源性细菌。
在肉膏蛋白胨双层琼脂平板上产生透明噬菌斑中心的菌落，即为溶源性细菌。
了解噬菌体的特性，快速检查噬菌体，在生产和科研工作中防止噬菌体污染具有重要作用。
图1 敏感细菌的平板上出现肉眼可见的噬菌斑空气中和二级种子罐培养液中的噬菌体污染度是预防噬菌体的一个措施。
在连续使用特定菌株进行赖氨酸发酵时，首先是空气中的噬菌体浓度增加，数月后种子罐的噬菌体浓度也急剧增加，随之主发酵罐发酵液中的噬菌体检出浓度也就增加；当空气中的噬菌体浓度上升到每个平板达10～20PFU/ml（噬菌斑生成单位）时，二级种子罐的噬菌体浓度为40～50 PFU/ml；之后迅速增加，达到102 PFU/ml的程度，终于在主发酵罐发生溶菌。
经常检测赖氨酸分厂环境中，特别是空气中与种子罐二级种子液中的噬菌体数，就能知道环境的噬菌体污染程度，也就能预知主发酵罐中会不会发生噬菌体的污染。
噬菌体是病毒的一种，是一种极其微小的生物，体积是细菌的1/1000左右，它可以通过细菌过滤器，只有在电子显微镜下才能看到。
噬菌体具有非常专一的寄生性，只能在特异性寄主细胞中增殖。
由于噬菌体缺乏独立代谢的酶体系，不能脱离寄生而自行生长繁殖，因而噬菌体的繁殖必须依存于寄生菌的繁殖，只能在活的正在繁殖阶段的细胞中进行增殖。
在死的、衰老的、处于休眠状态的细胞中以及在代谢产物或培养基上都无法繁殖。
噬菌体试验实验报告
噬菌体试验实验报告实验目的：本实验旨在通过噬菌体感染细菌的实验，了解噬菌体的生命周期、感染机制以及噬菌体与宿主细胞之间的相互作用。
同时，通过实验操作，加深对病毒学和微生物学基本概念的理解。
实验原理：噬菌体是一种寄生在细菌细胞内的病毒，它们通过吸附、注入、复制和释放四个阶段完成生命周期。
在实验中，我们利用特定的噬菌体和宿主细菌来模拟这一过程，并观察噬菌体对细菌的影响。
实验材料：1. 噬菌体悬液：含有特定噬菌体的溶液。
2. 宿主细菌培养液：含有适合噬菌体感染的细菌。
3. 琼脂平板：用于培养细菌和观察噬菌体感染效果。
4. 微量移液器和吸头：用于精确取样。
5. 无菌操作台：保证实验操作的无菌条件。
实验方法：1. 将宿主细菌培养液均匀涂布在琼脂平板上，待其凝固。
2. 使用微量移液器取适量的噬菌体悬液，滴加在涂布好的琼脂平板上。
3. 轻轻摇动平板，使噬菌体悬液均匀分布在平板上。
4. 将平板置于恒温培养箱中，培养一定时间，观察噬菌体感染宿主细菌后形成的噬菌斑。
5. 记录噬菌斑的数量和大小，分析噬菌体的感染效率。
实验结果：在培养一定时间后，观察到琼脂平板上出现了多个清晰的噬菌斑。
噬菌斑的数量和大小因噬菌体的浓度和宿主细菌的敏感性而有所不同。
通过计数噬菌斑的数量，可以估算噬菌体的感染效率。
实验讨论：噬菌体感染宿主细菌后，会迅速繁殖并导致宿主细胞破裂，释放出新的噬菌体颗粒。
噬菌斑的形成是由于噬菌体感染后，宿主细胞无法正常分裂，形成局部的透明区域。
噬菌斑的大小和数量可以反映噬菌体的感染力和宿主细胞的抵抗力。
实验结论：通过本次噬菌体试验，我们成功观察到了噬菌体的感染过程，并对其生命周期有了更深入的理解。
实验结果表明，噬菌体能够有效地感染宿主细菌，并在短时间内繁殖。
此外，噬菌体的感染效率和宿主细胞的敏感性密切相关，这为噬菌体在生物技术领域的应用提供了理论基础。
实验反思：在实验过程中，我们注意到了无菌操作的重要性，以及精确取样的必要性。
微生物对抑菌物质的耐受实验原理
微生物对抑菌物质的耐受实验原理下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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新高考生物第十一单元 实验探究与设计精编(B卷能力提升练)(考试版)
第十一单元实验探究与设计精编B卷能力提升练一、单选题：本题共15个小题，每小题2分，共30分。
在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。
1．原生质体（细胞除细胞壁以外的部分）表面积大小的变化可作为质壁分离实验的检测指标。
用葡萄糖基本培养基和NaCl溶液交替处理某假单孢菌，其原生质体表面积的测定结果如图所示。
下列叙述错误的是（）A．甲组NaCl处理不能引起细胞发生质壁分离，表明细胞中NaCl浓度≥0.3 mol/LB．乙、丙组NaCl处理皆使细胞质壁分离，处理解除后细胞即可发生质壁分离复原C．该菌的正常生长和吸水都可导致原生质体表面积增加D．若将该菌先65℃水浴灭活后，再用NaCl溶液处理，原生质体表面积无变化2．下列关于研究淀粉酶的催化作用及特性实验的叙述，正确的是（）A．低温主要通过改变淀粉酶的氨基酸组成，导致酶变性失活B．稀释100万倍的淀粉酶仍有催化能力，是因为酶的作用具高效性C．淀粉酶在一定pH范围内起作用，酶活性随pH升高而不断升高D．若在淀粉和淀粉酶混合液中加入蛋白酶，会加快淀粉的水解速率3．用洋葱根尖制作临时装片以观察细胞有丝分裂，如图为光学显微镜下观察到的视野。
下列实验操作正确的是（）A．根尖解离后立即用龙胆紫溶液染色，以防解离过度B．根尖染色后置于载玻片上捣碎，加上盖玻片后镜检C．找到分生区细胞后换高倍镜并使用细准焦螺旋调焦D．向右下方移动装片可将分裂中期细胞移至视野中央4．某同学将一株生长正常的小麦置于密闭容器中，在适宜且恒定的温度和光照条件下培养，发现容器内CO2含量初期逐渐降低，之后保持相对稳定。
关于这一实验现象，下列解释合理的是（）A．初期光合速率逐渐升高，之后光合速率等于呼吸速率B．初期光合速率和呼吸速率均降低，之后呼吸速率保持稳定C．初期呼吸速率大于光合速率，之后呼吸速率等于光合速率D．初期光合速率大于呼吸速率，之后光合速率等于呼吸速率5．稻蝗属的三个近缘物种①日本稻蝗、②中华稻蝗台湾亚种和③小翅稻蝗中，①与②、①与③的分布区域有重叠，②与③的分布区域不重叠。
噬菌体滴度测定方法
噬菌体滴度测定方法
噬菌体滴度测定是一种用于测定噬菌体（一种寄生于细菌的病毒）浓度的方法。
这种方法通常用于实验室中对噬菌体的研究和生产中的质量控制。
噬菌体滴度测定可以通过以下步骤来进行：
1. 制备宿主细菌，首先，需要培养并生长宿主细菌，通常是大肠杆菌等细菌。
这些细菌将被用作噬菌体的寄主。
2. 制备稀释系列，将噬菌体样品进行一系列的稀释，通常是1:10的稀释系列，以便在测定时得到合适的滴度范围。
3. 混合噬菌体和宿主细菌，将每种稀释倍数的噬菌体样品与宿主细菌混合，并在琼脂平板上均匀涂布。
4. 孵育，将含有噬菌体和宿主细菌的琼脂平板在适当的温度下孵育一段时间，通常是在37摄氏度下孵育。
5. 计数形成的克隆，在孵育后，观察并计数每个琼脂平板上形成的克隆（也就是细菌克隆）。
根据稀释倍数和克隆的数量，可以计算出噬菌体的滴度。
噬菌体滴度测定的结果通常以噬菌体的孔径形成单位（PFU）表示，这是一种衡量噬菌体浓度的常用单位。
这种方法对于确定噬菌体溶液的浓度以及在实验室中进行噬菌体相关实验和研究中都具有重要的意义。
除了上述步骤外，还有一些改进的噬菌体滴度测定方法，如双层琼脂平板法和流式细胞术等，可以根据具体实验需求选择合适的方法进行测定。
总的来说，噬菌体滴度测定方法是一种重要的实验技术，对于噬菌体研究和应用具有重要意义。
微生物实验(七)噬菌体效价测定及转导HJ
微生物实验（七）实验名称：噬菌体效价测定、转导姓名：韩俊学号：201011202902班级：10级2班实验日期：2012-4-26试验时间：周四13:00-16：00同组同学：李扬陈奉桂黄立波、【实验目的】1.了解温和噬菌体与宿主菌之间的溶原关系。
2.学习利用溶原性细菌制备噬菌体裂解液的方法。
3.学习噬菌体效价测定的方法4.了解转导原理、学习转导实验方法5.学习凝集反应和沉淀反应的实验方法【实验原理】溶原性细菌经紫外线照射诱导后，使得原噬菌体从细菌染色体上脱离而进入裂解周期，在宿主细菌细胞内进行复制和组装，形成大量完整的噬菌体粒子。
细菌被裂解，释放出游离的噬菌体粒子，通过离心获得噬菌体裂解液。
噬菌体的效价是指1ml噬菌体裂解液中所含噬菌体的数目。
在含有敏感宿主菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑，根据噬菌斑形成单位，进行噬菌体效价测定。
转导分为两种类型，即为普遍性转导和局限性转导。
本实验为局限性转导，以双重溶源性细菌E.coli K12F(λ)gal+为供体，经紫外线（UV）诱导，在噬菌体裂解液中，将含有两种类型的噬菌体，（λ和λdg），λdg是缺陷噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因（gal），当缺陷性噬菌体λdg再次侵染敏感菌大肠杆菌K12S时，会将发酵半乳糖的基因转移到S菌，使S菌获得gal 基因，从而使得S菌获得发酵半乳糖的能力，利用转导子在EMB培养基上发酵半乳糖的特征进行转导频率的计算和分析。
【实验仪器、材料】菌种：E. coli K12 F，E. coli K12S，各种方式保藏的微生物菌种，噬菌体裂解液培养基：牛肉膏蛋白胨固体及液体培养基，素琼脂，EMB培养基试剂：氯仿、磷酸缓冲液，无菌水，1%琼脂糖仪器：离心机、UV灯、磁力搅拌器，培养箱，打孔器等【实验内容】1、噬菌体裂解液的制备从E. coli K12 F菌种斜面上取一环菌种，接种于2mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，离心10min，弃去上清夜，用等体积磷酸缓冲液悬浮细胞，制成菌悬液。
新教材2020-2021学年高中生物人教版必修2课时作业-噬菌体侵染细菌的实验-含解析
第2课时噬菌体侵染细菌的实验必备知识基础练进阶训练第一层知识点一噬菌体侵染细菌的实验1.A．噬菌体的核苷酸和氨基酸B．噬菌体的核苷酸和细菌的氨基酸C．细菌的核苷酸和氨基酸D．噬菌体的氨基酸和细菌的核苷酸2．在证明DNA是遗传物质的T2噬菌体侵染大肠杆菌的实验中，正确的技术手段是() A．用化学方法把DNA和蛋白质分开B．用32P和35S分别标记T2噬菌体和大肠杆菌C．用32P和35S同时标记T2噬菌体D．用标记过的大肠杆菌去培养T2噬菌体3．为了验证T2噬菌体的遗传物质，用放射性同位素标记的T2噬菌体侵染未被标记的大肠杆菌，经保温培养、搅拌离心，检测放射性，预计上清液中应没有放射性，但结果出现了放射性。
则标记的元素及误差原因可能是()A．S；培养时间过长B．P；培养时间过长C．P；搅拌不够充分D．S；搅拌不够充分4．赫尔希和蔡斯通过“噬菌体侵染细菌的实验”，证明了DNA是遗传物质，下列相关叙述错误的是()A．若用放射性同位素32P标记的噬菌体侵染细菌，子代噬菌体中含32P的占少数B．若用放射性同位素35S标记的细菌培养噬菌体，子代噬菌体全部含有35SC．子代噬菌体的蛋白质和DNA分别是在细菌的核糖体和细胞核中合成D．实验中充分搅拌的目的是使吸附在细菌上的噬菌体颗粒和细菌分离知识点二DNA是主要的遗传物质5.①真核生物的遗传物质是DNA②原核生物的遗传物质是RNA③细胞核的遗传物质是DNA④细胞质的遗传物质是RNA⑤甲型H1N1流感病毒的遗传物质是DNA或RNA A．①②③B．②③④C．②④⑤D．③④⑤6．关于遗传物质的叙述，正确的是()①噬菌体侵染细菌实验，证明DNA是主要的遗传物质②大肠杆菌的遗传物质是RNA③DNA是具有细胞结构的所有生物的遗传物质④病毒的遗传物质是DNA和RNA⑤烟草花叶病毒的遗传物质是RNAA．①②④B．③⑤C关键能力综合练进阶训练第二层一、单项选择题7．1952年，赫尔希和蔡斯用32P或35S标记T2噬菌体，并分别与无标记的细菌混合培养，经过一定时间保温后再搅拌、离心得到了上清液和沉淀物，并检测放射性。
细菌噬菌体应该如何检测
将11支灭菌空试管分别标记10 -4、10 -5、10 -6和对照。分别从10 -4、10 -5和10 -6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管 中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1mL无菌水，并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀，置37℃水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。
观察结果：如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑噬菌斑。
单层琼脂平板法
省略下层培养基，将上层培养基的琼脂量增加至2%，融化后冷却至45℃左右，如同上法加入指示菌和检样，混合后迅速倒平板。30℃恒温培养6～16h后观察结果。
⑤离心分离加热法(快速检查)
取大肠杆菌正常培养液和侵染有噬菌体的异常大肠杆菌培养液，4000rpm离心20min，分别取两组发酵液的上清液(A1)，一部分于721分光光度计上测定OD650光密度值，另外各取5mL上清液于试管中，置水浴中煮沸2min(A2)，检测A2溶液OD650光密度值，记录结果。
噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等(至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品)。为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。
采用微生物测定法进行噬菌体检测，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。通过快速检测可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。根 据正常发酵(培养)液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮;而侵染有噬菌体的发酵(培养)液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。
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LB是什么？
• LB：Luria-Bertani培养基，即溶菌肉汤。
8
实验步骤
• 1.准备好铜绿假单胞菌的过夜培养物和相应 的噬菌体原液（噬菌体效价10^10）
铜绿假单胞菌的 倒置过夜培养物
噬 菌 体 原 液
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实验步骤
• 2.将菌液10倍连续稀释，至少稀释7管，取 0.1ml涂布接种LB琼脂平板，37度培养过夜。 次日取菌落适宜于菌落计数的平板进行 CFU计数，计算出每毫升菌液中的CHU数：
绿脓杆菌
革兰染色 培养
4
研究背景
• 本菌为条件致病菌，是医院内感染的主要病原 菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的 患者，及术后或某些治疗后的患者易感本菌。
• 筛选出优良菌种，以便更好地利用其资源进行 研究并造福人类。同时又对其外界环境有更大 的适应性，更好应用于发展、生产的需要。为 获得其菌群，我们采用利用噬菌体将其敏感细 菌杀死，从而选择耐受细菌。
CFU数=每个平皿中的CFU数×10×血清稀释倍数
10
• 2.
10倍连续稀释，至少7管
11
CFU是什么？
• CFU (Colony-Forming Units)：菌落形成单 位,菌落形成单位。
• 将稀释后的一定量的菌液通过浇注或涂布的方法，让其内 的微生物单细胞一一分散在琼脂平板上，待培养后，每一 活细胞就形成一个菌落。与常规利用显微镜对微生物数量 进行测量不同，主要是对可见（即多数情况下形成菌落） 的细菌数量进行测量的单位。Βιβλιοθήκη 222320
思考题
(1)为什么溶化后的培养基要冷却至45℃左右 才能倒平板？ (2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个 关键？为什么？ (3)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计 数法的优缺点。
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参考文献
《 微生物学通报 》MICROBIOLOGY
国际标准刊号：ISSN 0253-2654 国内统一刊号：CN 11-1996/Q 铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及耐噬菌体突变频率测定 张克斌 陈志瑾 等 第三军医大学基础部微生物学教研室
• 单位：CFU/mL。指的是每毫升样品中含有 的细菌群落总数，也有用CFU/g即对应固体 培养基。
12
通俗的解释
是指每毫升菌液中含有多少单细胞 。传统上 就叫“个”。但是，我们知道，一个菌落不一定 是一个细菌所生成，也可能是由一簇细菌（一个 细菌团）所生成，这时候再叫“个”就不太准确 啦，准确的叫法就是“菌落形成单位”，英文缩 写“CFU”。就像“公斤”和“千克”，只是叫法 不同，数量上没有变化。
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实验可行性分析
1. 标本采集方便 • 本菌在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见 的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼 吸道和肠道等都有本菌存在。本菌存在的重要条 件是潮湿的环境。 • 采自不同感染部位的标本，包括血液、尿液、痰 标本、脓汁、穿刺液等。还包括来自医院环境中 的各种标本如水、空气、物体表面采样等。
细菌耐受噬菌体突变率的测定
——微生物创新性试验
第五组：
1
细菌耐受噬菌体的突变是一种自发突
变，它的发生与环境因子无关，是随机的
非定向突变。
2
本组设计性实验题目：
测定铜绿假单胞菌耐受噬菌体的突变频率
3
实验选材依据和背景
• 铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa） 原称绿脓杆菌。在自然界分布广泛，为土 壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、 空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都 有本菌存在。本菌存在的重要条件是潮湿 的环境。
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研究方案：为获得其菌群，我们采用噬菌体将敏 感细菌杀死，将发生了耐受突变的细菌选择出来， 并繁殖成为优势菌群。
研究 概述
研究意义：培养出优势菌群，为以后临床治疗 及临床用药起辅助性作用。 研究目的：测定细菌自然情况下耐受噬菌体的 自发突变频率。 研究问题：突变率测定
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实验材料
• 1.毒性噬菌体及其相应的敏感宿主菌。 （建议使用人体正常菌群中的细菌及其噬菌体， 如大肠埃希菌或铜绿假单胞菌及其相应噬菌 体。） • 2.LB液体培养基及LB固体培养基。 • 3.试管、培养皿、刻度定量吸管。 • 4.酒精灯、接种环、显微镜、普通培养箱等。
CFU数/ 平板 每毫升 的CFU 数
…
18
预期结果
• 经相关文献预测： 铜绿假单胞菌耐噬菌体的突变机率在 1.4×10^-7～7.9×10^-7之间。
19
讨论
• 上述操作3，通常在4h内菌液会完全变清。 此时细菌尚处于生长曲线的“迟缓期” （即适应期），亦即尚未进入分裂状态。 如果少数事先存在的耐受菌已进入分裂期， 这是测定结果会被放大，因而失其准确性。
16
2.分离培养容易 本菌生长对营养要求不高。 3. 生长特点明显 该菌在4℃不生长而在42℃ 可以生长。（可用以鉴别） 4.采用CFU计数的科学性。 5.实验现象明显，便于观察。
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预期结果
10-1 稀释度 10-2 … 10-7
平 平 平 1 2 3 1 2 3 … 1 2 3 均 均 均 …
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实验步骤
3.进入对数生长后期的大肠埃希菌或铜绿假 单胞菌，菌数约为10^9CFU/ml左右。 2~3h后，可见菌液逐步变清，待完全变清 （月4h之内），将全部菌液均匀涂布到一 个LB琼脂平板上，置37℃下培养过夜。次 日计数CFU。
14
4.耐受噬菌体突变频率的计算 第3步中获得的CFU数为1ml菌液中的耐受 菌数量，第2步中获得的CFU数为1ml菌液 中的总菌数。故： 第3步中获得的CFU数 耐受噬菌体突变频率 = 第2步中获得的CFU数