FDA_PI细胞活力的测定
3.1.2.3细胞活力测定（FDA-PI双染色）
参照Dong等(2010) 的方法，水培试验镉处理第10d，取水稻幼苗根尖用去离子水冲洗3 次，利用二乙酰荧光素（Flurescein diacetate, FDA）- 碘化丙啶（Propidium iodide, PI ）双染色剂(5mg FDA 溶解在l mL 丙酮中，避光贮藏在4℃的冰箱中，使用时取0.4 mL FDA 贮藏液加入到5mL 0.65mol/L 甘露醇中，按此比例获FDA染色溶液。将2mg PI溶解在5mL 0.65mol/L 甘露醇中，按此比例配成PI 染色溶液。将FDA 和PI 染液混匀) 在室温黑暗染色40min 。随后使用PBS缓冲液或蒸馏水洗涤3 次，每次5 min，去除多余的染料。利用激光共聚焦扫描显微镜(LSM 510；Zeiss，德国) 进行观察并拍照，激发光和检测光波长分别为485 nm和530 nm。
细胞计数
每代细胞的生长过程： ①游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。持续 10分钟一4小时 ②贴壁期：细胞附着于底物上，细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。 ③潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。 ④对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 ⑤停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度抑制 细胞是否处于对数生长期并不是以数量来定的，一般接种数量多，潜伏期相对会缩短一些，反之，潜伏期会稍长。并且不同细胞潜伏期是不一样的，故建议最好在实验以前做一下生 长曲线 细胞生长状况的观察 1.细胞计数 （1）［概述］ 细胞计数法是细胞培养研究中的一项基本技术，它是了解培养细胞生长状态。测定培 养基、血清、药物等物质生物学作用的重要手段。常用的细胞计数有血球计数板计数 法和电子细胞计数仪计数法。 （2）［用品］ a）血球计数板，巴氏吸管。 b）0. 25%胰蛋白酶溶液，无血清培养液。 c）显微镜。 （3）［步骤］ a）准备计数板：用无水酒精或95%酒精清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻 拭干。 b) 制备细胞悬液：用消化液分散单层培养细胞或直接收集悬浮培养细胞，制成单个细 胞悬液。本法要求细胞密度不低于104/ml，若细胞数很少，应将悬液离心(1000rpm， 5 min)，重悬浮于少量培养液中。 c) 加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微 量细胞悬液，加样时不要溢出盖玻片也不能溢入两侧的玻璃槽内，如果产生上述情况 需对计数板冲洗和拭干后重新加样，加样量也不要过少或带气泡。 d) 计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。 e) 计算：将计算结果代入下式，得出细胞密度。
细胞增殖及细胞活力检测方法
细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA 的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，
所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA 的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU 后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。 图1：EdU及BrdU原理示意图（摘至invitrogen说明书） 在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，Alamar Blue，MTT及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。 Calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一
实验：计数法测定细胞生长曲线
实验内容：计数法测定细胞生长曲线 作者：王卫东实验日期：2001.10.24-2001.10.31 实验目的：学习细胞计数的方法；熟悉测定生长曲线的基本原理、方法，了解其应用。 实验原理：一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮后贴壁，随后度过长短不一的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期，在达到饱和密度后，细胞停止 生长，进入平顶期，然后退化衰老。典型的生长曲线即可分为潜伏期、 指数生长期、平顶期及退化衰老四个部分，其中的三个不同生长时相 （潜伏期、指数生长期和平顶期）是每个细胞系所共有的特征。通过 测定生长曲线，不仅可以了解培养细胞生物学特性的基本参数、测定 细胞绝对生长数、判断细胞活力，而且也可用于测定药物等外来因素 对细胞生长的影响。本实验采用计数法测定细胞生长曲线，通过连续 对细胞计数（通常为7d，一般应每次计数3瓶细胞取平均值），然后 以存活细胞数对培养时间作图，即得该种细胞的生长曲线。 仪器、材料和试剂： 培养箱、超净工作台、倒置显微镜、血球计数板 1、仪器：CO 2 2、材料：培养瓶、试管、吸管、移液管、废液缸、HeLa细胞、盖玻片、酒精灯 3、试剂：培养基（含小牛血清）、0.25%胰蛋白酶 实验步骤： 1、细胞悬液制备：取生长良好接近汇合的HeLa细胞，胰酶消化，再加新鲜培 养基制成细胞悬液后计数。 2、接种：根据细胞计数结果，按每瓶5×104个接种细胞（加3mL培养基，实际 接种每瓶5.9×104个）作传代培养（理论上应该每人接种21瓶细胞，每天取3瓶计数，但实际每人只接种7瓶）。 3、计数：24h后开始作细胞计数，以后每隔24h计数一次，连续计数7天。 4、绘图：根据计数结果，绘制HeLa细胞生长曲线。 结果与讨论： 1、细胞计数结果如下：
细胞增殖及细胞活力检测方法
细胞增殖及细胞活力检 测方法 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT
细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA 链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。 Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。 采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。
细胞活性测定
细胞活性测定方法 细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。核酸染料有多种，如EB带有单个自由正电荷，能通过完整细胞膜。而PI，TO—PRO—1，TO-PRO-3等等带一个有四铵基团和两个或两个以上正电荷的染料是不能通过完整细胞膜进入细胞内的。因而吸收了这些多电荷染料的细胞被认为是非活性的。另外，一些酸性染料，如上面提到的台盼兰，曙红等都是膜非通透性。 代谢活性是另一重要指标，它通过细胞内的酶的活性来判定。使用细胞某种酶的底物，它能通过（或是不能通过）完整细胞膜，在细胞内被酶切而产生荧光性，膜不通透性产物，能在细胞膜完好的细胞内存留，在细胞膜不完整的细胞内散失很快。通过检测荧光强度就可知细胞代谢活性。FDA(fluorescein diacetate)和CTC（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride）是常用的两种底物。前者虽然透过细胞膜的速度较慢，但它的产物基本不往外通透。后者经细胞内脱氢酶催化而具有荧光性，能提供细胞呼吸代谢系统活性和细胞膜完整性信息。 正常细胞的细胞膜两侧维持着一个胞内为负的膜电位为梯度，带正电的亲脂性染料，如Cyanines类能因电梯度而通过细胞的脂双层膜聚积在活细胞内，带负电的亲脂性染料如oxonols会被排除在外。不再维持着膜电位梯度的细胞里，则会吸收更多Oxonols类染料。 用流式细胞仪测量的方法优点是，灵敏，荧光强度精确定量，快速高通量的检测逐个细胞，可同时检测细胞的多个活性指标，提高可信度，结果具有统计意义。缺点是，实验较MTT等复杂，费用较高。 常用的细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。 1．MTT法 MTT：化学名：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 缺点：由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲臜的有机溶剂对实验者也有损害。
细胞计数方法 细胞计数板法
细胞计数方法------细胞计数板法 实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。 具体操作： 1. 将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。 2. 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。 3. 计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算： 细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104个/ml (注：当细胞很多时，可在四个大格中选一定数目较平均的小格，由于每大格中有16个小格，然后对选定的小格计左侧和上方的细胞数，求出每小格的细胞数，取平均值m，m×16即每个大格的平均值。所以，细胞密度=m×16×104个/ml) 说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数。 公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为： 1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm3而1ml=1000ul=1000mm3 （注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。） ================================================ 细胞计数板的使用 一、血球计数板-基本构造 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
全自动细胞计数和活力分析系统
全自动细胞计数和活力分析系统： 中标产品必须逐条响应以下技术参数： 1.细胞直径范围：2μm -70μm 2.细胞浓度：5x104-1x107个/毫升 3.细胞存活率：0-100% 4.操作系统：Windows XP 5.具有自动取样装置 6.样品量：≤0.5 ml 7.有精确进样系统 8.分析时间周期（包括自动进样，作样，清洗全过程）：≤2.5 分钟 9.自动聚焦FIREWIRE CCD：≥1394 X 1040 10.可实时采集细胞图像 11.图形具有缩放功能 12.样品抽取及台盼蓝染料混合可变量 13.浓度高低可自动报警，废液过多可自动报警 14.符合21CFR PART 11 准则 15.有生物处理3D，旋转绘图 16.可将多重结果输出至EXCEL 文件 17.用户可自行定义非存活细胞分团选项 18.有提高圆度检测功能，可分离细胞碎片 19.可提供的数据：细胞存活率；总细胞数；存活细胞数；总细胞浓度；存活细胞 浓度；细胞的直径及分布；细胞的平均直径；细胞圆度及分布；细胞平均圆度； 细胞的生长速度；细胞倍增时间；细胞生长曲线
连续波长微孔板分光光度计 中标产品必须逐条响应以下参数： 常规参数 孔板类型：6-,12-,24,48,96和384-孔标准微孔板，大小128mm×86mm，最高0.8英寸。 可选配件：Take3TM微孔板适配器，可进行微量检测、BioCell TM、标准比色杯检测 软件：Gen5软件控制，兼容各种版本，包括中文软件 检测模式：终点法，动力学法，波长扫描发和孔域扫描法 检测性能 波长范围：200-999nm，可选1nm步进 波长准确性：＋/-2nm 波长重复性：＋/-0.2nm 吸收光检测范围：0-4 OD 吸收光分辨率：0.0001 带宽：5nm OD准确性：0-2 OD：+/-1% +/-0.010 OD 2-2.5OD：+/-3% +/-0.010 OD 重复性：0-2 OD：+/-1% +/-0.005 OD 0-2 OD：+/-3% +/-0.005 OD 线性：0-2 OD：+/-1% +/-0.010 OD 2-2.5 OD: +/-3% +/-0.010 OD 读板速度：96孔≤50秒（标准）；≤40秒（快速）；≤15秒（扫描） 384孔≤170秒（标准）；≤135秒（快速）；≤35秒（扫描） 物理参数 连接：USB串口连接电脑控制 化学兼容性：所有暴露表面均耐受0.5%次氯酸钠、70%乙醇或异丙醇进行消毒
死活细胞鉴定及细胞活力测定
死活细胞测定及细胞活力测定 【实验原理】 （一）染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。实验是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异来进行的。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要体现在： （1）死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。 （2）死活细胞在代谢上的差异：由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原 能力，而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱。 常见的细胞染料有：中性红（细胞器的专有染料）、台盼蓝、甲基蓝、美蓝、荧光素双醋酸 酯（FDA等。 ①中性红染色：常用染料之一，是细胞器的专有染料。利用细胞膜的通透性差异，用来染 原生动物和显示动植物组织中活细胞的内含物等。中性红无毒，常做活体染色的染料。 ②台盼蓝染色：当细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合， 使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数器进行计数。 ③美蓝染色法：美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对活细 胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞. ④甲基蓝染色法：甲基蓝染色与台盼蓝类似的染色机理。 （二）植物细胞质壁分离法及活体染色测定细胞死活 （1 ）质壁分离法：成长的植物细胞一般具有中央液泡，在中央液泡和细胞壁之间为细胞质的薄层及其内外膜——液泡膜和质膜。液泡中的胞液具有一定的溶质势（或称渗透势），而活的原生质特别是液泡膜和质膜则具有半透性。所以，当细胞与外界溶液接触时，便与外液构成渗透系统，并可能发生水分的移动。若外液的水势低于胞液的溶质势，则水分外渗的结果可使原生质随着液泡一起收缩而脱离细胞壁，发生质壁分离，质壁分离的细胞与水或水势较高的溶液接触时，可重新吸水而是质壁分离复原。 （2 ）活体染色法：活体染色是利用某种对植物无害的染料稀溶液对活细胞进行染色技术。
活性氧检测试验方案
活性氧检测试验方案 一：实验原理 活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。 本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物(compound mixture),浓度为50mg/ml。二：实验步骤 ⑴取20 ul DCFH-DA（试剂盒有100ul)按照1:1000用无血清培养液即20ml稀释DCFH-DA，使 终浓度为10微摩尔/ 升。 ⑵吸取12ml细胞培养液（细胞浓度为一百万至二千万/毫升）加入24孔板中（设3个阳性对照， 3个浓度梯度分别做3个重复，每孔加入1ml细胞培养液），放入细胞培养箱中培养。 ⑶培养24小时后去除细胞培养液，每孔加入稀释好的DCFH-DA 1ml （加入的体积以能充分 盖住细胞为宜）。 ⑷ 37℃细胞培养箱内孵育20分钟。
⑸去除孵育后的DCFH-DA稀释液，每孔加入1ml无血清细胞培养液洗涤细胞（重复洗涤三次， 以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA）。洗涤完后每孔加入1ml细胞培养液。 ⑹在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前荧光的强 弱即OD值。 ⑺实验组中每孔加入已配制好的松茸多糖20ul(浓度分别为5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml), 对照组中加入阳性对照物Rosup 20ul，放入细胞培养箱内继续培养。 ⑻4小时后，在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激后 荧光的强弱即OD值。 三：数据处理 实验组：癌细胞活性氧降低率=（刺激前OD值－刺激后OD值)/刺激前OD值×100% 阳性对照组：癌细胞活性氧升高率=（刺激后OD值－刺激前OD值)/刺激前OD值×100% 四：注意事项 ⑴探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
细胞计数及活力测定
细胞计数及活力测定 一、原理 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。 用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。 二、仪器、用品与试剂 1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计） 2、试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇 3、材料：细胞悬液 三、操作步骤 （一）细胞计数 1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算： 细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。 （二）细胞活力 1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。 2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。 3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。 4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。 活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。 （三）MTT法测细胞相对数和相对活力 活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。 l、细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。 2、沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成悬液。 3、37℃下保温2小时。 4、加入4—5 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。 5、1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。 注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。 附：1、0.4%台盼兰染液配制： 台盼兰0.4克加双蒸水至100 ml。
细胞培养之细胞计数
细胞培养之细胞计数 实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。 具体操作： 一.准备工作： 取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用. 二.细胞悬液制备： 用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS 等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。 三.细胞计数： 1.取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上. 2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑。活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。 3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。 4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。 5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度： 细胞悬液的细胞数/ml＝（四个大格子细胞数/4)×2×104 说明：/4因为计数了4个大格的细胞数；×2因细胞悬液：染液=1：1稀释；×104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm×1.0mm×0.1mm＝0.1mm3而 1ml＝1000mm3 四.细胞计数要点： 1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中； 2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。 3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确； 4.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。 5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。 五.初学者易犯的错误： 1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。 2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。 3. 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。 六.本实验特殊试剂的配制：
实验六细胞计数及活力测定
实验6 细胞计数及活力测定 【实验原理】 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。 用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。 【实验目的】 1．练习进行细胞计数，并用细胞计数法绘制生长曲线，以了解培养细胞的生长发育特性。 2．掌握测定细胞活力的方法。 【仪器、材料与试剂】 1．仪器：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计）。 2．材料：细胞悬液。 3．试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇 【操作步骤】 1．细胞计数 ①将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。 ②将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 ③静置3分钟。 ④镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算： 细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
2．细胞活力 ①将细胞悬液以0.5ml加入试管中。 ②加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。 ③吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。 ④镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。另外，活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。 3．MTT法测细胞相对数和相对活力 活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。 ①细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。 ②沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成悬液。 ③37℃下保温2小时。 ④加入4—5 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。 ⑤1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。 注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。 附： 1．0.4%台盼兰染液配制：台盼兰0.4克加双蒸水至100 ml。 2．MTT配制：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。4℃下保存。 3、酸化异丙醇配制：异丙醇中加入HCl使最终达0.04mol/L。 【注意事项】 1．细胞计数时的注意事项 ①消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单个细胞悬液。否则会影响细胞计数结果。 ②取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时尤应注意这一点。否则，前后计数结果会有很大误差。 ③镜下计数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计数。如细胞团占10%以上，说明消化不充分。 ④细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。
细胞计数和存活率的测定
细胞计数和存活率的测定 目的学会细胞计数和鉴别细胞死活的方法。 实验前的思考体外培养细胞常常需要测定细胞的培养密度，即单位体积内的细胞数，同时还需要鉴别细胞的死活，从而了解细胞的存活情况。细胞密度测定最常用的工具是血球计数板，细胞死活测定的最简单方法是染料排斥法，常用鉴别染料为台酚蓝。 材料器具蟾蜍或小白鼠的骨髓细胞；显微镜，血球计数板，吸管，培养皿，试管，软布或擦镜纸；%台酚蓝染液，两栖动物生理盐水（%氯化钠溶液）或哺乳动物生理盐水（%氯化钠溶液）。 步骤 1.制备骨髓细胞悬液具体方法参见第660页实验“赡蜍骨髓细胞染色体的制备”。 2.细胞计数准备取一副血球计数板，用软布或擦镜纸擦净，把盖玻片盖在血球计数板中央的计数室上。把上述制得骨髓细胞悬液摇匀，用吸管吸取少量细胞悬液轻轻地滴在计数室边缘的斜面上，让它自然地流入盖玻片下的空隙，均匀地充满在计数室内。悬液不能过多或过少，过多会使盖玻片浮起，过少会出现空隙或气泡。如果有上述现象必须洗去，擦干重做，否则会影响计数准确性。 3.细胞计数方法静置2～3分钟，待细胞在计数室下沉后，在低倍镜下计数（详见本书第777页实验《血细胞的计数》。 4.细胞存活力鉴别取毫升骨髓细胞悬液放入小试管里，再加%台酚蓝染液毫升，用吸管轻轻吹打混匀，染色2～3分钟。然后把悬液摇匀，吸取悬液滴一滴在干净载玻片上，加盖玻片，在低倍镜下，随机计数上、下、左、中、右五个视野内的细胞总数和被染成蓝色的细胞数，蓝色细胞为死细胞，按以下公式计算细胞存活率：
上述细胞计数和细胞存活力测定也可以合并在一起做。 分析和讨论 1.细胞计数时，应该先调焦，看清计数板上的格线。细胞密度太高时，计数不便，应该先把原液稀释若干倍后再计数，随后把测得结果乘以稀释倍数即为原液细胞密度。计数时，以每大格点数在几十到一百多为宜。 2.台酚蓝染液一般不能渗透到活细胞里，所以活细胞不会着色。但是如果延长染色时间或提高染液的浓度，造成活细胞膜损伤时，活细胞也可着色。所以，使用中应该掌握好有关条件。
细胞活力快速检测试剂盒(
细胞活力快速检测试剂盒细胞活力快速检测试剂盒（（Luminescent ） 说明书修订日期说明书修订日期：：2015.07.13 Cat number ：KGA369 Store at -20 for ℃ 6 months, protected from light For Research Use Only （科研专用） 一、试剂盒说明 本试剂盒是通过对ATP 进行定量测定来检测培养物中活细胞数目的一种均质检测方法。ATP 是活细胞新陈代谢的一个指标。细胞活力快速检测试剂盒为多孔板而设计，是进行自动化高通量筛选(HTS)、细胞增殖和毒性分析的理想选择。均质检测步骤就是将单一试剂直接加入含有血清的培养细胞中，无需洗涤细胞、去除培养基或进行多步加样操作。在384孔板上，加入试剂并混合后，10 分钟内，该系统可检测到的每个孔内的细胞数最低为15个。 均质检测的" 加样-混合-检测" 的操作方案使得细胞裂解和产生的发光信号与存在ATP 量成正比，而ATP 量直接与培养物中的细胞数量成正比。细胞活力快速检测试剂盒产生一种"辉光型" 的发光信号，半衰期一般大于5小时，因细胞类型和培养基而异。由于信号半衰期长，不需要使用试剂自动进样器，就可灵活地进行连续的或批量的多孔板处理。独特的均质检测方案避免了那些需要多个步骤的ATP 检测方法可能会引入的误差。 二、试剂盒组份 组 份 Cat: KGA369 500 assays 储存储存条件条件 细胞活力快速检测液 13ml/瓶 避光，-20℃，半年有效 本试剂盒可以提供384孔板至少500T 的量的量。。 三、试剂盒以外自备仪器和试剂 低速离心机 、荧光闪烁计数仪、平板摇床、微量移液器、不透明壁多孔板，用于细胞培养物。 四、注意事项 1. 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，如果待检测体系中存在较多的还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。 3. 用酶标仪检测前请确保孔内没有气泡，否则会干扰测定。 4. 为保证您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 五、操作方法 A. 细胞活性检测的操作步骤 1. 在一块壁不透明的多孔板上准备好带培养基的哺乳动物细胞，96孔板100μl/孔，384孔板25μl/孔。多孔板应与将使用的萤光发光计匹配。
细胞活力检测celltiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay system protocol
Revised 12/12 TB245 T E C H N I C A L B U L L E T I N CellTiter 96? AQ ueous One Solution Cell Proliferation Assay Instruc? ons for Use of Products G3580, G3581 and G3582
Promega Corpora ? on · 2800 Woods Hollow Road · Madison, WI 53711-5399 USA · Toll Free in USA 800-356-9526 · 608-274-4330 · Fax 608-277-2516 1 https://www.360docs.net/doc/5b5869622.html, TB245 · Revised 12/12 All technical literature is available at: https://www.360docs.net/doc/5b5869622.html,/protocols/ Visit the web site to verify that you are using the most current version of this Technical Bulletin. E-mail Promega Technical Services if you have questions on use of this system: techserv@https://www.360docs.net/doc/5b5869622.html, CellTiter 96? AQ ueous One Solution Cell Proliferation Assay 1. Description .........................................................................................................................................1 2. Product Components and Storage Conditions ........................................................................................4 3. Protocols .. (5) 3.A. General Protocol ........................................................................................................................53.B. Example of a Protocol for Bioassay of IL-6 Using B9 Cells ..............................................................5 4. General Considerations .. (6) 4.A. Background Absorbance ..............................................................................................................64.B. Optional Wavelengths to Record Data ..........................................................................................74.C. Lymphocyte Assays .....................................................................................................................74.D. Reagent Optimization .................................................................................................................84.E. Cell Number Optimization ...........................................................................................................8 5. References ..........................................................................................................................................9 6. Related Products . (10) 1. Description The CellTiter 96? AQ ueous One Solution Cell Proliferation Assay (a) is a colorimetric method for determining the number of viable cells in proliferation or cytotoxicity assays. The CellTiter 96? AQ ueous One Solution Reagent contains a novel tetrazolium compound [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS (a)] and an electron coupling reagent (phenazine ethosulfate; PES). PES has enhanced chemical stability, which allows it to be combined with MTS to form a stable solution. This convenient “One Solution” format is an improvement over the ? rst version of the CellTiter 96? AQ ueous Assay, where phenazine methosulfate (PMS) is used as the electron coupling reagent, and the PMS Solution and MTS Solution are supplied separately. The MTS tetrazolium compound (Owen’s reagent) is bioreduced by cells into a colored formazan product that is soluble in tissue culture medium (Figure 1, 1). This conversion is presumably accomplished by NADPH or NADH produced by dehydrogenase enzymes in metabolically active cells (2). Assays are performed by adding a small amount of the CellTiter 96? AQ ueous One Solution Reagent directly to culture wells, incubating for 1–4 hours and then recording the absorbance at 490nm with a 96-well plate reader (3,4).