血清γ-球蛋白的盐析分离
血清清蛋白、γ_球蛋白的分离、提纯和鉴定
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定一、实验目的1.掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法；2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法；3.了解柱层析技术。
二、实验原理血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成，各行使其重要的功能。
本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离，并用电泳技术观察蛋白质分离教果。
1．盐析蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。
当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白质分子沉淀析出的方法很多，根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重金属盐法以及生物碱试剂法等。
盐析法的原理是：中性盐如硫酸铵((NH４)２SO4)等对蛋白质作用破坏了蛋白质表面水化膜，并且中和了部分电荷，从而使蛋白质相互聚集而析出。
由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不同，因此调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。
血清球蛋白在半饱和状态下发生沉淀，而血清清蛋白在完全饱和状态下沉淀，利用此特性可把蛋白质分段沉淀下来，即在半饱和的中，血清蛋白不沉淀，而血球蛋白沉淀，离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀蛋白加少量蒸馏水即可溶解，由此达到分离清蛋白和白蛋白的目的。
2．脱盐盐析得到的蛋白质含有高浓度中性盐，需要有脱盐过程去除蛋白质遗留的中性盐，常用方法有：透析法脱盐和凝胶层析法脱盐。
本实验采用凝胶层析法脱盐，在葡聚糖凝胶柱中，蛋白质与盐的分子量不同，当样品通过层析柱时，分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱；反之，盐的分子量较小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，流出层析柱的时间较后。
分段收集蛋白质洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。
3.纯化（离子交换层析）离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。
最新生物化学综合实验血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定(40)-精品课件
葡聚糖凝胶（Sephadex)
应用最多的凝胶！
交联度 网状结构 网孔径 吸水量 机械强度 耐压力
大 致密 小
小
大
高
小 疏松 大
大
小
低
第十五页，编辑于星期日：十四点 三十八分。
操作步骤：
▲ Sephadex G-50的准备 ▲ 装柱（15~20cm）
1、层析柱保持垂直。 2、放蒸馏水，排沙芯下空气，关闭出口。
第二十二页，编辑于星期日：十四点 三十八分。
DEAE－纤维素离子交换层析纯化γ－球蛋白
血清α、β、γ－球蛋白、清蛋白的等电点为： 清蛋白pI=4.64， α2球蛋白 pI=5.06， β球蛋白pI=5.12， γ球蛋白pI=7.3
本 在实此验pH采条用件0下.0，2 DmEoAl/El带p正H电6.荷5 ，NH可4与Ac带缓负冲电液荷进的行α洗、脱β-。 球 蛋 白 和 清 蛋 白 结 合 ， 而 带 正 电 荷 的 γ- 球 蛋 白 不 与
第二十九页，编辑于星期日：十四点 三十八分。
醋酸纤维素薄膜电泳鉴定
点样 ：
全血清：点样一次
脱盐后的粗蛋白溶液：点样3～5次 浓缩后的纯γ－球蛋白溶液：点样3～5次
第三十页，编辑于星期日：十四点 三十八分。
醋酸纤维素薄膜电泳
电泳条件：电压：90－110 V；
时间：50分钟。
染
色：电泳毕，关电源。取出薄膜浸入盛有氨基黑10B 染色液
凝胶柱层析脱盐
第十页，编辑于星期日：十四点 三十八分。
目的与要求
1.学习了解凝胶 层析的原理
2.熟练了解凝胶 层析的用途
第十一页，编辑于星期日：十四点 三十八分。
凝胶层析原理：
凝胶层析法是按混合物各组分分子量大小不同随流 动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。
血清γ-球蛋白分离、纯度鉴定与浓度检测
生物化学实验报告班级：学号：姓名：实验室：评分━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━日期：实验一：血清γ-球蛋白分离、纯度鉴定与浓度检测实验目的：1、熟悉盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法脱盐分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法进行纯度鉴定的原理和基本方法4、掌握分光光度计检测蛋白质含量的原理和基本方法实验原理：1.盐析法:盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。
蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。
此外，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。
2.凝胶层析法脱盐：在葡聚糖凝胶柱中，蛋白质与盐的分子量不同，当样品通过层析柱时，分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱;反之，盐的分子量较小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，流出层析柱的时间较后。
分段收集蛋白质洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。
3.醋酸纤维素薄膜电泳：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。
它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。
由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。
因此可以将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
4.分光光度计是应用分光光度法（即比色法）测定物质含量的装置。
通常需要加入某种显色剂，以产生有色化合物，其颜色深浅与待测化学成分的含量成正比，据此对待测物浓度进行测定。
分光光度计的工作原理及分光光度法的计算根据Lambert-Beer定律导衍而得Abs（吸光度）=KCL K:摩尔吸收系数 C:吸光物质浓度 L-溶液厚度实验操作：1.硫酸铵分段盐析:血清2.0 ml,加入PBS2.0ml,一边摇一边缓慢加入饱和硫酸铵2.0 ml,混匀后室温下静置10分钟，3000rpm离心10分钟。
【生物化学实验】血清γ球蛋白分离纯化与鉴定PPT课件
凝胶层析法
透析
本试验采用葡聚糖凝胶——Sephadex G 25层析方 法除去球蛋白粗提液中的盐硫酸铵，以便下一步用离 子交换层析方法进一步提纯球蛋白。
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凝胶柱层析脱盐
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目的与要求
1.学习了解凝胶 层析的原理
2.熟练了解凝胶 层析的用途
/min，使凝胶均匀沉降，不断补充，直至15cm。 4、上留1—2mm的水，关闭出口。 注意：★ 床面上要保持少许水，防止胶床露出液面。
★ 胶面不平，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降， 使表面平整。
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▲ 加样与洗脱
1、加样：用滴管将盐析后样品加入柱床面，打开出口使样品 溶液渗入凝胶。
2、洗脱：加入洗脱液，打开出口，保持流速10滴/min，收 集洗脱液，用钠氏试剂检测胺。
3、保存：检测洗脱液的蛋白质量，保存含量高的进一步纯化
▲ 凝胶的再生
不断加洗脱液，使铵全部流出，为下次实验做准备。
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注意事项：
1 . 凝胶柱的制备质量决定分离效果的好坏 。 2. 加样分离时，滴速越慢，分离效果越好。
★ 以管号为横轴，蛋白 质含量为纵轴绘制洗脱 曲线，分析实验结果。
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三、DEAE－纤维素离子交换层析
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凝胶层析原理：
凝胶层析法是按混合物各组分分子量大小不同随流 动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。
凝胶是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，当吸收 一定量溶液后溶涨成柔软、富有弹性、不带电荷、不与溶 质相互作用的惰性物质，凝胶层析以其为固定相。层析时， 直径大于凝胶网孔的大分子物质不能进入凝胶内部，只能 沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，所以流程短、 流速快，首先流出层析柱；而小分子物质直径小于凝胶网 孔能自由出入，洗脱时间长，后流出层析柱，经过一定时 间层析，分子大小不同的物质彼此分开，达到分离的目的。
11.6生化实验报告血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定及电泳分析
11.6⽣化实验报告⾎清γ-球蛋⽩的分离纯化与鉴定及电泳分析⾎清γ-球蛋⽩的分离纯化与鉴定及电泳分析【实验⽬的】1、了解蛋⽩质分离提纯的总体思路。
2、掌握盐析法、凝胶层析法和离⼦交换层析的实验原理及操作技术3、掌握电泳法分离纯化蛋⽩质的⽅法。
【实验原理】1、蛋⽩质的粗提——盐析法胶体的盐析是加盐，盐中的带电粒⼦使蛋⽩质周围的⽔化膜减弱，胶粒溶解度降低，形成沉淀析出的过程，是胶体的聚沉现象的⼀种。
向蛋⽩质溶液中加⼊某些浓的⽆机盐[如(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后，可以使蛋⽩质凝聚⽽从溶液中析出，这种作⽤就叫做盐析。
盐析不能使蛋⽩质变性，可以复原。
利⽤这个性质，可以采⽤多次盐析的⽅法来分离、提纯蛋⽩质。
蛋⽩质在⽔溶液中的溶解度取决于蛋⽩质分⼦表⾯离⼦周围的⽔分⼦数⽬，亦即主要是由蛋⽩质分⼦外周亲⽔基团与⽔形成⽔化膜的程度以及蛋⽩质分⼦带有电荷的情况决定的。
蛋⽩质溶液中加⼊中性盐后，由于中性盐与⽔分⼦的亲和⼒⼤于蛋⽩质，致使蛋⽩质分⼦周围的⽔化层减弱乃⾄消失。
同时，离⼦强度发⽣改变，蛋⽩质表⾯的电荷⼤量被中和，蛋⽩质溶解度更加降低，之蛋⽩质分⼦之间聚集⽽沉淀。
由于各种蛋⽩质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋⽩质不同，从⽽使之从其他蛋⽩中分离出来。
简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加⼊蛋⽩质溶液，使蛋⽩质表⾯电荷被中和以及⽔化膜被破坏，导致蛋⽩质在⽔溶液中的稳定性因素去除⽽沉淀。
由于清蛋⽩的亲⽔性⽐球蛋⽩⼤，且清蛋⽩的分⼦⽐球蛋⽩⼩，所以清蛋⽩需要⾼浓度的盐溶液才能够发⽣盐析，低浓度的时候球蛋⽩发⽣盐析。
盐析法分离蛋⽩质：各种蛋⽩质的颗粒⼤⼩、亲⽔程度、pI不同，盐析所需的盐浓度也不⼀样。
调节盐浓度可使不同的蛋⽩质沉淀，从⽽达到分离的⽬的。
常⽤中性盐：硫酸铵、硫酸钠等。
硫酸铵：温度系数⼩，溶解度⼤，蛋⽩谱⼴，盐析效果好，不易引起变性。
可⽤硫酸/氨⽔按需要调节pH值。
本实验中清蛋⽩分⼦⼩，亲⽔性强，在饱和硫酸铵溶液中可沉淀析出，⽽球蛋⽩分⼦⼤，亲⽔性弱，在半饱和硫酸铵溶液中即可沉淀析出。
血清γ-球蛋白的分离-夏洪
+
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Pr
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Pr
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中性盐破坏了这两个稳定性因素，使蛋 白质沉淀。
中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的 亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的 水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入 蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋 白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶 解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
聚糖凝胶混匀，倾入层 析柱内，静止后分层， 凝胶高度要在柱高的 1/3~3/4之间。当液面接 近凝胶上表面时将出口 胶管夹紧待用。
注意：装柱要均匀，不要有气 泡和分层，凝胶面要平整
（2）加样：
向装有γ-球蛋白的离心管内加入PBS 10滴， 用玻璃棒搅拌使之溶解。再用乳头吸管吸 出γ-球蛋白液，加到层析柱内凝胶表面。 待γ-球蛋白液全部进入凝胶柱内时，再用 乳头吸管小心加入PBS约1cm高，待大部 分液体进入凝胶柱后，再继续加PBS直至 洗脱完毕（加液时注意不要冲击凝胶表 面）。在整个洗脱过程中不能让液面降至 凝胶面以下。
血清γ-球蛋白的分离纯化 与鉴定
指导教师：夏 洪 李 晓 梅
本次实验内容
• （一） 血清γ-球蛋白的分离与纯化 • （二） 血清γ-蛋白的鉴定 —— 醋酸纤维素薄膜电泳
实验17
（一） 血清γ-球蛋白的分离 与纯化
【实验目的】
1． 掌握蛋白质分离纯化的主要方法
和原理； 2．熟悉盐析和层析的基本操作；
浓缩（Anti-dialysis） 浓缩将凝胶过滤得到的γ－球蛋白液倒
入透析袋内，悬于盛有浓蔗糖溶液的小 烧杯内，振荡1小时以上，观察袋内液体 体积变化
07 生物化学实验--血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定
血清γ- 球蛋白的分离、纯化与鉴定【目的】1 ．掌握盐析 - 层析法提纯血清γ- 球蛋白的原理和技术。
2 ．熟悉电泳比较法定性γ- 球蛋白的方法。
3 ．了解扫描定量γ- 球蛋白的方法。
【原理】蛋白质的分离、纯化是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段。
根据不同蛋白质的分子量、溶解度以及在一定条件下带电荷性状的差异来分离、纯化各种蛋白质。
1 ．γ- 球蛋白的分离、纯化（ 1 ）盐析：清蛋白与球蛋白的稳定性不同，故可用盐析法对血清蛋白质初步分离。
在半饱和硫酸铵溶液中，清蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心所得的沉淀即是球蛋白混合物。
（ 2 ）脱盐：球蛋白混合物中的硫酸铵会妨碍进一步分离纯化，应除去。
脱盐的方法有多种，本试验采用凝胶过滤。
在凝胶过滤中，柱中的填充料是高度水化的惰性多聚物，最常用的有葡聚糖凝胶（ Sephadex Gel ）和琼脂糖凝胶 (Agarose Gel) 等颗粒。
葡聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物，它的“ 网眼” 大小可以通过交联剂与葡聚糖的配比来达到。
不同型号的葡聚糖凝胶可用来分离和纯化不同分子大小的物质。
把葡聚糖凝胶装在层析柱中，不同分子大小的蛋白质混合液借助重力通过层析柱时，比“ 网眼” 大的蛋白质分子不能进入网格中，而被排阻在凝胶颗粒之外，随着洗脱剂在凝胶颗粒的外围而流出。
比‘ 网眼 ' 小的分子则进入凝胶颗粒内部。
这样，由于不同大小的分子所经路程距离不同而得到分离。
大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。
所以含硫酸铵的蛋白值溶液通过层析柱时，先被洗脱出层析柱的是球蛋白，小分子硫酸铵由此法分离除去（参见第 2 篇第 2 章图 2-3 ）。
（ 3 ）纯化：γ- 球蛋白与α 、β- 球蛋白（以及微量的清蛋白），等电点不同，所以采用离子交换层析，从球蛋白混合物中分离、提纯出γ- 球蛋白。
用于蛋白质分离的层析材料多是离子交换纤维素，它们的优点是对蛋白质的交换容量较一般的离子交换树脂大，而且品种较多，可以适用于各种分离目的。
血清γ-球蛋白的分离纯化实验报告
血清γ-球蛋白的分离纯化实验报告血清γ-球蛋白的分离纯化一、目的与要求1、掌握分离纯化蛋白质的基本原理和基本过程。
2、熟悉盐析、离心、层析、电泳等生化基本技术在蛋白质分离纯化中的综合应用。
3、学会设计和制定分离纯化蛋白质的实验方案，技术路线，质量监控和保证措施。
二、实验原理血清蛋白有300多种，可粗略的分为清、球蛋白两大类，γ球蛋白只是球蛋白中的一个亚类。
欲用常规方法获得，可先用半饱和硫酸铵从血清中盐析出球蛋白，接着用葡萄糖凝胶G-25脱去球蛋白中的盐分最后用DEAE纤维素阴离子交换柱便可直接从脱盐的球蛋白溶液中分离纯化出γ球蛋白,其反应机理如下：C2H5H纤维素-O-(CH2)2-N(C2H5)2纤维素-O-(CH2)2-N+……H2PO4H++H2PO4DEAE纤维素离子交换柱COOHC2H5α、β、γ球蛋白NH2COOH经过盐析和脱盐的球蛋白液纤维素-O-(CH2)2-N+…α和βGPH6.3NH2交换到柱上的α和β-球蛋白H2PO4COOHγ-球蛋白NH3+被DEAE柱分离纯化的γ-球蛋白被柱层析交换结合的α球蛋白和β球蛋白，可通过增加洗脱液的离子强度或降低洗脱的pH值（也可两者同时改变），使其分部洗脱下来而被纯化。
纯化前后的γ球蛋白可用电泳方法进行比较鉴定。
三、仪器和材料仪器：离心机，1.5×40cm层析柱，层析架或滴定台，核酸-蛋白检测仪，部分收集器，紫外分光光度计，色谱柱，电泳槽，电泳仪。
材料：马血清，SephadexG-25×200g，DEAE-32×200g。
四、实验步骤（一）分离纯化步骤1、取3mL,4℃预冷血清，加入3mL4℃预冷的饱和硫酸铵。
边滴边摇。
2、静置大于10min后，3500rpm离心15min，弃去上清液，将沉淀溶于少量的生理盐水。
从中取0.5mL用于测定蛋白质含量。
3、将剩余的样品上SephadexG-25柱，用0.02mol/LpH6.5的NH4AC缓冲液洗脱，每管收集3mL，用于绘制洗脱曲线，选择颜色最深（即浓度最高管）的取0.5mL留待电泳用。
血清γ-球蛋白的分离纯化(纯化部分)课件
二.凝胶层析纯化γ-球蛋白
凝胶层析的定义
又称凝胶过滤、分子筛层析、排阻 层析、凝胶渗透层析等
凝胶是一种具有多孔、网状结构的 分子筛。利用这种凝胶分子筛对大 小、形状不同的分子进行层析分离， 称凝胶层析 。
葡聚糖凝胶颗粒
1. 33%硫酸铵盐析分离γ-球蛋白
血清 1ml (20d)
离心 5min
饱和硫酸铵0.5ml (10d)
4000rpm
G
充分混匀
γ- G
2. γ-球蛋白溶液的制备
PBS 0.5ml (10d)
离心机的使用方法及注意事项：
（1）离心管要平衡对称； （2）离心机的启动、停止都要慢； （3）开始前，盖子盖紧；
4.上样
将柱中多余的液体从底部流出后关闭止 水螺丝，取前面制备好的γ-球蛋白样品小 心加到凝胶柱上，打开止水螺丝，使样品 溶液流入柱内，当样品流至略高于柱床表 面时，关闭止水螺丝。
5.洗脱
用缓冲液进行洗脱，控制缓冲液 在约每5秒一滴的流速。
6.收集与检测
收集洗脱液，每管收集12d，共收集 12管，同时对收集液体进行检测。
（2）装柱：把溶胀好的糊状凝胶边搅拌边 倒入柱中，同时开启止水螺丝，控制一定 的流速，使柱中的凝胶一直处在溶液中。 最好一次连续装完，待凝胶装至10-15cm 即可。注意防止气泡与分层,可用玻棒搅拌 使 表面平整。
3.平衡
通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱 床稳定，并始终保护凝胶上端有一段 液体。
蛋白质检测
在各收集管中各取出1滴收集液 滴于比色板孔中(按编号顺序)，加入 1滴双缩脲试剂，观察并记录实验现 象。
实验4层析技术血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定
实验思路
分段盐析去除杂蛋白
先 粗 后 细
凝胶层析脱盐
交联葡聚糖吸水浓缩
醋酸纤维素薄膜电泳鉴定
上 午 完 成 下午 完成
实验流程及操作注意事项
①分段盐析： 常用中性盐：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、 磷酸钠等。 硫酸铵：温度系数小，溶解度大，蛋白谱广，分段 盐析效果好，不易引起变性。溶液pH约4.5～5.5， 可用硫酸/氨水按需要调节pH值。 分段盐析：各种蛋白大小、亲水程度、pI不同，所 需的盐浓度、pH也不一样。如清蛋白分子小，亲水 性强，需高盐浓度才沉淀，球蛋白分子大，亲水性 弱，较低盐浓度即可沉淀。因此调节盐浓度及pH可 使各种蛋白质分段沉淀。
4．分类： ①流动相的物理状态：气相和液相 → 气液/固，液固/液 ②方式：纸、薄层、柱
③原理：吸附、分配、凝胶、离子交换、亲 和、金属螯合、疏水、反相
5．凝胶层析 (凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层 析) ①定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱
时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离
实验四
血清γ球蛋白的分 离纯化与鉴定
层析技术 实验原理 实验思路 实验流程及操作注意事项
层 析 技 术
1. 定义：层析法，又称色谱法，是一种广泛运用 的物质分离纯化、分析鉴定技术.
2. 分离依据：混合物中各组分的理化性质差 异—吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子 极性、分子亲和力以及分配系数。
蛋白质为两性电解质，有一定的等电点，在大于其等电点的溶液中带负电， 在电场中向阳极移动，由于各种蛋白质的分子大小与结构不同，所带表面电 荷的多少不同，因而在电场中向阳极移动的速度不同。经过一定的电泳时间 后可形成许多蛋白质区带，每一个区带代表一组迁移率相近似的蛋白质。
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实验名称：血清γ-球蛋白的盐析分离
实验目的
（1）了解蛋白质分离纯化的一般方法。
（2）掌握硫酸铵盐析法从动物血清中分离γ-球蛋白。
原理
中性盐类能破坏溶液中蛋白分子表面的双电层和水膜，从而使蛋白质从溶液中凝聚沉淀析出。
但沉淀不同的蛋白质所需盐类的浓度不同。
例如，50％饱和的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而33％饱和的硫酸铵则使γ-球蛋白沉淀。
因此，可根据所要分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进行盐析。
操作方法
1．取家畜血清5ml，加磷酸缓冲溶液(0.01mol／L pH7.0)5ml，混匀，滴加(边加边搅拌)饱和硫酸铵4ml(此时溶液硫酸铵饱和度约为20％)。
静置20min以3 000r／min离心15min，沉淀为纤维蛋白(弃去)；上清液中含清蛋白、球蛋白。
2．取上清液，再加饱和硫酸铵溶液6ml(方法同前)，此时溶液硫酸饱和度为50％，静置20min，以3 000r ／min离心15min，上清液中含清蛋白，沉淀为球蛋白。
3．倾去上清液，将沉淀溶于5ml磷酸缓冲液(0．01mol/L，pH7．0)，再加饱和硫酸铵3．2ml，此时溶液硫酸铵的饱和度约为33％，静置20min，以3 000r／min离心15rain除去上清液，沉淀即为γ-球蛋白。
4．将所得γ-球蛋白沉淀溶解于1ml磷酸盐缓冲液（0.0175mol/l，pH6.7）中备用。
试剂和器材
一、试剂
(1)饱和硫酸铵溶液pH7.0：称取(NH4)2SO4 760g，加蒸馏水至1000ml，加热至50℃，使绝大部分硫酸铵溶解，置室温过夜，取上清液，用氢氧化铵调pH至7.0。
(2)磷酸盐缓冲溶液(0.01mol/L pH7.0，内含0.15mol／L NaCl，简称PBS)：取 0.2mol／L Na2HP04溶液30.5ml，0.2mol／L NaH2P04溶液19.4ml，加NaCl 8.58，加蒸馏水至1000ml。
(3)磷酸盐缓冲液(0.0175mol／L，pH6.7，不含NaCl，简称PB)：取0.2mol／L Na2HP04溶液43.5ml，取0，2mol/L NaH2P04溶液56.6ml混合。
用蒸馏水稀释至1000ml。
二、器材
离心机、离心管、玻棒、吸管等。
注意事项
（1）在进行盐析时，为了防止硫酸铵一次性加入或搅拌不均匀造成的局部过饱和影响盐析的效果，一定要边滴加边搅拌。
也不能过于剧烈，以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性。
（2）所添加的硫酸铵应为化学纯或更高纯度，否则夹带的杂质会使硫酸铵的浓度不准确，甚至引起蛋白质和酶的变性。
添加硫酸铵后，要使其充分溶解，至少放置30min以上，待蛋白质沉淀完全，然后将沉淀分离。
(3)由于高浓度的盐溶液对蛋白质有一定的保护作用，所以盐析操作一般可在室温下进行。
而某些对热特别敏感的酶，则应在低温条件下进行。
(4)在盐析条件相同的情况下，蛋白质浓度越高越容易沉淀。
但浓度过高容易引起其他杂蛋白的共沉作用。
因此必须选择适当的蛋白质浓度。
思考题
（1）什么叫做分级盐析？
（2）本实验中是如何采用分级盐析获得粗品γ-球蛋白。