第八章 分子克隆技术

线性DNA 线性 （LDNA） ）
开环DNA 开环 （OCDNA） ）
共价闭合环形DNA 共价闭合环形 （SCDNA型） 型
琼脂糖凝胶电泳: 琼脂糖凝胶电泳: 不同构型的DNA，其迁移率不同，最前面的是 ，其迁移率不同，最前面的是SC 不同构型的 DNA，依此为 DNA 和OC DNA。 ，依此为L 。
型限制性核酸内切酶： Ⅱ 型限制性核酸内切酶： 识别与切割DNA链上特异性核苷酸序列； 链上特异性核苷酸序列； 识别与切割 链上特异性核苷酸序列 识别序列一般具180℃旋转序列（回文序 ℃旋转序列（ 识别序列一般具 列）， 长度一般是4－8个碱基（4个以下很少）。 个碱基（ 个以下很少 个以下很少）。 长度一般是 － 个碱基
连接酶在分子克隆中的作用: 连接酶在分子克隆中的作用:
催化外源DNA和载体分子之间发生连 和载体分子之间发生连 催化外源 接作用，形成重组DNA分子。 分子。 接作用，形成重组 分子
粘性末端DNA片段的连接： 粘性末端DNA片段的连接：容易 片段的连接
平末端DNA片段的连接：比较困难 片段的连接： 平末端 片段的连接
质粒的类型: 质粒的类型: 根据质粒在细胞中拷贝数目的多少，分为： 根据质粒在细胞中拷贝数目的多少，分为： • 严谨型质粒（stringent plasmid ）：分子 严谨型质粒（ ）：分子 量较大，多是具传递能力的大质粒； 量较大，多是具传递能力的大质粒；DNA 复制与宿主染色体DNA的复制相偶联，受 的复制相偶联， 复制与宿主染色体 的复制相偶联 到某种程度的控制；每个细胞仅1－ 个拷贝 个拷贝。 到某种程度的控制；每个细胞仅 －2个拷贝。 • 松弛型质粒（relaxed plasmid ）：分子量 松弛型质粒（ ）：分子量 较小，不具传递能力。 较小，不具传递能力。其复制在松弛控制下进 每个细胞拷贝数约10－ 个 行。每个细胞拷贝数约 －200个。
2. 核酸外切酶
指从DNA链的 端或 端开始按序催化降解核 链的5’端或 指从 链的 端或3’端开始按序催化降解核 苷酸的酶。 苷酸的酶。 3’-外切核酸酶按3‘-5’方向催化单链或双链 外切核酸酶按 ‘ ’ 外切核酸酶 DNA，自3’-OH末端释放 ’-单核苷酸。 末端释放5’ 单核苷酸 单核苷酸。 ， 末端释放 应用： 应用： 通过3‘ ’活性使双链DNA分子产生出单 通过 ‘-5’活性使双链 分子产生出单 链区，可作为DNA标记的引物，制备特异的放 标记的引物， 链区，可作为 标记的引物 射性探针。 射性探针。
3. DNA连接酶 连接酶 催化两条DNA单链相邻碱基之间形成磷酸 单链相邻碱基之间形成磷酸 催化两条 二酯键。 二酯键。
作用：封闭 之间的缺口（ ），即双 作用：封闭DNA之间的缺口（nick），即双 之间的缺口 ）， 链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸间失去一 的某一条链上两个相邻核苷酸间失去一 个磷酸二酯键出现的单链断裂； 个磷酸二酯键出现的单链断裂； 不能封闭裂口（ ），即双链 不能封闭裂口（gap），即双链 ），即双链DNA的某一 的某一 链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。 链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。
分子克隆同义概念： 分子克隆同义概念： • DNA重组技术 (recombinant DNA technique) 重组技术 • 基因克隆（gene cloning） 基因克隆（ ） • 基因操作（gene manipulation） 基因操作（ ） • 基因工程（gene engineering） 基因工程（ ） • 遗传工程（genetic engineering） 遗传工程（ ）
质粒的结构： 质粒的结构： 大部分是共价闭合的环状双链DNA分子， 分子， 大部分是共价闭合的环状双链 分子 大小在1－ 之间； 大小在 －200kb之间； 之间 包含复制起点，多克隆位点； 包含复制起点，多克隆位点； 通常编码抗生素抗性基因。 通常编码抗生素抗性基因。
Lac promoter
1. 质粒（plasmid）载体： 质粒（ ）载体：
质粒： 质粒：存在于细胞质中的一类独立于染色体 的能自主复制的环状DNA分子； 分子； 的能自主复制的环状 分子
质粒DNA可以持续稳定地处于染色体外的游 可以持续稳定地处于染色体外的游 质粒 离状态， 离状态，在一定条件下又会可逆地整合到寄 主染色体上，随着染色体复制而复制， 主染色体上，随着染色体复制而复制，并通 过细胞分裂传递给后代。 过细胞分裂传递给后代。
载体多克隆位点
外源DNA 限制性内切酶酶切
5‘P 3‘OH 3‘OH 5’P 5’P 3‘OH
限制性内切酶酶切
3‘OH 5’P
T4 连接酶连接
转化E.Coli
筛选重组子，测序
载体的发展概况： 载体的发展概况： 1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利 第一阶段（ 年前）： 年前）：天然质粒和重组质粒的利 用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 和 2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立 ）， 多克隆位点区和新的遗传标记基因。 多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载 系列载 体。 3.第三阶段： 3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆 第三阶段 中的不同要求， 系列载体， 中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7， 系列载体 ， ， sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。 启动子载体， 启动子载体 表达型载体及各种探针型载体。
质粒在寄主细胞中的作用: 质粒在寄主细胞中的作用: “友好”地“借居”在宿主细胞中，既不杀 友好” 借居”在宿主细胞中， 死细胞，对宿主的代谢活动也无影响； 死细胞，对宿主的代谢活动也无影响； 借助本身带进去的基因在细胞中表达其遗传 信息， 信息，编码一些重要的非染色体控制的遗传性 为宿主执行一些适当的遗传功能。 状，为宿主执行一些适当的遗传功能。如对抗 菌素的抗性，对重金属的抗性等。 菌素的抗性，对重金属的抗性等。
Ampr
pUC18 (3 kb)
MCS (Multiple cloning sites）
lacZ’
ori
质粒的构型： 质粒的构型：
• 共价闭合环形 共价闭合环形DNA（cccDNA）:两条多核苷酸链 （ ） 两条多核苷酸链 均保持完整的环形结构；通常呈超螺旋的SC构形 构形。 均保持完整的环形结构；通常呈超螺旋的 构形。 • 开环 开环DNA（ocDNA）：两条多核苷酸链只有一 ）：两条多核苷酸链只有一 （ ）： 条保持完整的环形结构，另一条链出现有一至数 条保持完整的环形结构， 个缺口时； 构形。 个缺口时；呈OC构形。 构形 • 线性 线性DNA（LDNA）：经适当核酸内切酶切割， ）：经适当核酸内切酶切割 （ ）：经适当核酸内切酶切割， 发生双链断裂形成线性分子；成L构形。 发生双链断裂形成线性分子； 构形。 构形
用 途： 制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的 DNA 探针。 探针。
（三） 基因工程的载体
载体 (Vector )： ： 将外源DNA片段带入宿主细胞并进 片段带入宿主细胞并进 将外源 行复制或表达的运载工具。 行复制或表达的运载工具。 载体设计和应用是DNA体外重组的重要环节。 体外重组的重要环节。 载体设计和应用是 体外重组的重要环节
载体的基本特征： 载体的基本特征：
• 在宿主细胞中能够自主复制； 在宿主细胞中能够自主复制； • 具有多种限制酶的单一识别序列（多克隆位点）， 具有多种限制酶的单一识别序列（多克隆位点）， 以供外源基因插入； 以供外源基因插入； • 多克隆位点位于不影响复制的非必需区域，插在其 多克隆位点位于不影响复制的非必需区域， 的靶基因片段能被动跟着载体一起复制； 中 的靶基因片段能被动跟着载体一起复制； • 携带易于筛选的选择标记； 携带易于筛选的选择标记； • 容易从宿主细胞中分离纯化； 容易从宿主细胞中分离纯化； • 使用安全
质粒的命名： 质粒的命名：
用小写字母p代表质粒（ ），在 字 用小写字母 代表质粒（plasmid），在p字 代表质粒 ）， 母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者 或实验室名称，再加上质粒编号。 或实验室名称，再加上质粒编号。 表示一种质粒， 如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR” ： 表示一种质粒 则是分别取自该质粒的两位主要构建者F. 则是分别取自该质粒的两位主要构建者 Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。 为编号。 和 ， 为编号
第八章
分子克隆技术
本章主要内容
第一节： 第一节：工具酶和载体 第二节：重组体DNA分子的构建 第二节：重组体 分子的构建 第三节： 第三节：核酸的凝胶电泳
（一）分子克隆（molecular clone） 分子克隆（ ）
克隆的概念： 克隆的概念： 作名词用 作动词用 分子克隆的概念： 分子克隆的概念： 在分子水平上，使一个独特的 在分子水平上，使一个独特的DNA序列在细 序列在细 胞中进行复制和表达。 复制和表达 胞中进行复制和表达。 遗传相似的群体 无性繁殖
•
对双链DNA同时切割，产生不同形式的切 同时切割， 对双链 同时切割 口: 1）形成平头末端（ blunting ends） ）形成平头末端（ ） 2）形成5ˊ 粘性末端（Cohesive ends） ）形成 ˊ 粘性末端（ 3）形成3ˊ粘性末端 ）形成 ˊ
平末端
5ˊ粘性末端l II 催化合成 催化合成DNA的互补链 的互补链; 的互补链 在生长链的3‘ 在生长链的 ‘－OH末端同渗进来的 末端同渗进来的 核苷酸发生聚合反应。 核苷酸发生聚合反应。
具备条件： 具备条件： 四种脱氧核苷酸 四种脱氧核苷酸 dNTPs (dATP dGTP dCTP dTTP )； ； 带有游离3‘－OH 基团的引物链； 带有游离 ‘ 基团的引物链； DNA模板 DNA模板
分子克隆的特点： 分子克隆的特点：