0704 HPLC实验讲义
实验5 对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱分析
一. 目的要求
(1) 了解高效液相色谱仪构造。
(2) 了解高效液相色谱分析操作。
(3) 学习高效液相色谱保留值定性方法和归一化法定量方法
二. 基本原理
在对羟基苯甲酸酯类混合物中含有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，它们都是强极性化合物，可采用反相液相色谱进行分析，选用非极性的C-18烷基键合相作固定相，甲醇的水溶液作流动相。
由于在一定的实验条件下，酯类各组分的保留值保持恒定，因此在同样条件下，将测得的未知物的各组分保留时间，与已知纯酯类备组分的保留时间进行对照，即可确定未知物中各组分存在与否。
这种利用纯物质对照进行定性的方法，适用于来源已知，且组分简单的混合物。
本实验采用归一化法定量，归一化法使用条件及计算公式，与气相色谱分析相同：
1
%100n i i i i
A c A ==⨯∑ 对羟基苯甲酸酸类混合物属同系物，具有相同的生色团和助色团，因此它们在紫外光度检测器上具有相同的校正因子，故上式可简化为：
1
%100n i i i i i i
f A c f A ==⨯∑
三. 仪器与试剂
仪器： LC-4A 型高效液相色谱仪；紫外光度检测器；记录仪；微量进样器 10 μL ；超声波发生器。
试剂： 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯等，均为分析纯；甲醇，分析纯；二次蒸馏水。
洗脱剂须经二次蒸馏并经微滤膜过滤。
标准溶液的配制：
(1)标准贮备液：分别于四只100 mL 容量瓶中，配制浓度均为1000 μg ·mL -1的上述四种酯类化合物的甲醇溶液。
(2)标准使用液：用上述四种标准贮备液分别于四只10 mL 容量瓶中，配制浓度均为10 μg ·mL -1 的四种酯类化合物的甲醇溶液，混匀备用。
四. 实验条件
1．色谱往长25 cm、内径3 mm，装填C-18烷基键合相,颗粒度为10 μm的固定相。
2．流动相甲醇:水(70:30)，流量1 mL·min-1。
3．检测器紫外光度检测器，254 nm。
4．记录仪量程5 mV，走纸速度480 mm/h。
5．进样量 3 μL。
五实验步骤
1．将配制好的流动相甲醇水溶液置于超声波发生器上脱气15 min。
2．根据实验条件，将仪器按照仪器的操作步骤，调节至进样状态，待仪器达到平衡时，记录仪基线呈直线，即可进样。
3．依次分别吸取3 μL的四种标淮使用液和未知试液进样，记录各色谱图。
六. 数据及处理
1．记录实验条件
2．测量四种对羟基苯甲酸酯化合物色谱峰的保留时间t r，并填于下表中。
3．测量未知试样色谱图上各组分的峰高h，半峰宽Y1/2，计算各组分的峰面积A 及其含量%c i，并将数据列于下表中。
七. 思考题
1．高效浓相色谱分析采用归一化法定量有何优缺点?本实验为什么可以不用相对质量校正因子?
2．本实验为什么采用反相液相色谱，试说明理由。
3．高效液相色谱分析的流动相为何要脱气，不脱气对实验有何妨碍？。
高效液相色谱分析实验讲义
高效液相色谱分析实验一、实验目的1．了解HPLC仪器的基本构造和工作原理，掌握HPLC的基本操作2．学习苯-甲苯混合物的定性分析方法3．评价色谱柱效4．了解色谱定量操作的主要方法以及各自特点；5．学习未知样品的定量分析方法。
二、实验原理不同组分因在互不相溶的流动相与固定相中的分配比不同，当两相做相对运动时，组分在两相之间反复进行多次分配，最终实现不同组分的分离。
色谱仪器的构成：包括高压输液系统、进样系统、分离系统，检测系统等1．色谱定性分析方法（1）利用保留值与已知物对照定性A 保留时间定性 b 峰高增量定性 C 其他方法定性（保留值经验规律定性，文献保留数据定性）2．色谱定量分析方法⑴校正因子：a绝对校正因子；b 相对校正因子。
⑵常见的色谱定量分析方法主要有：a 归一化法。
特点：简单、方便、准确，但要求所有组分必须全部出峰。
b内标法。
特点：使用相对校正因子定量，结果准确，但操作繁琐，由于需要增加内标物，增大分离的难度。
c 标准曲线法（外标法）。
简单、方便，由于采用绝对校正因子定量，结果受到操作技术因素以及具体色谱条件影响较大。
d 内标标准曲线法。
三、仪器与试剂LC-1000型高效液相色谱仪P3000A-UV3000型高效液相色谱仪甲醇(色谱纯) 二次去离子水苯甲苯苯－甲苯四、高效液相色谱仪操作步骤1. 流动相的预处理用甲醇和二次去离子水配成500 mL (V/V=90:10)的甲醇溶液，用0.45μm 有机滤膜过滤，超声波清洗器脱气10～20 min，装入流动相贮液瓶。
2. 苯-甲苯混合试样和苯、甲苯标样的准备3. P3000A-UV3000型高效液相色谱仪操作a 依次打开六通阀控制电路、高压输液泵和检测器电源开关；b 打开CHTX3000色谱工作站，在仪器控制面板中，设置波长，点击！，并开灯；c打开三通阀，在仪器控制面板中，设置流速为5ml/min, 启动高压泵，排除流路中的气泡。
排气结束后，点击停止按钮，停止高压泵。
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
HPLC讲义
高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯一. 实验目的1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。
2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。
3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。
二. 实验原理高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。
在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。
反之，则称为正相色谱分离系统。
反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。
定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。
分离度（R）的计算公式为：R＝ 2[t(R2)-t(R1)] /1.7*(W1＋W2)式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的半峰宽。
除另外有规定外，分离度应大于1.5。
本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。
它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。
但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。
待测物性质见表1。
表1色谱柱测试条件液，在不同条件下进行HPLC分离检测。
三.仪器与试剂1、仪器Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。
2、试剂甲醇（色谱专用），高纯水四. 实验步骤1、色谱条件色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8）柱温：室温流动相：初始为高纯水：30％，甲醇：70％检测器：DAD检测器;检测波长：220nm；进样体积：100µl定量环，实际注射每次可控制在200µl。
2、待测溶液的配制首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。
高效液相色谱法(HPLC) ppt课件
ppt课件
32
流动相选择该注意的几点问题
1、尽量使用高纯度试剂做流动相，防止微 量杂质长期积聚而损坏色谱柱；
2、避免流动相与固定相发生相互作用而使 柱效下降或损坏柱子；
3、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防 止产生沉淀并在柱中沉积；
4、流动相同时还应满足检测器的需求。
高效液相色谱法 （HPLC）
ppt课件
1
色谱法定义
• 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分 离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测 手段，就成为色谱分析法。
• 色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体， 由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法 （LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在 固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相 色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、 液-液色谱。
阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；
流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液 ；
阳离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；
应用：离子及可离解的化合物、氨基酸、核酸等。
而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分
在最佳条件下得以分离。
ppt课件
10
四、液相色谱分析法的原理
• （二）高效液相色谱的分离过程 •
• 同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固 定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。 它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或 分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶 质得以分离。
HPLC实验讲义(研究生上课)
注意冲洗次序，不能直接用 有机溶剂冲洗
反相离子对色谱法（IPC）— 较强电解质
对于某些易离解的有机酸、有机碱。如生物碱类、儿 茶酚胺类、有机酸类、维生素类和抗生素类。 例：牛磺酸
反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分 与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离。
流动相
B H RSO 3Na BH+ RSO 3 ( BH
乙腈-水
0 20 40 60 80 100
甲醇-水
80 90 100
0 10
20
30
40
50
60
70
四氢呋喃-水
40%乙腈、50%甲醇和30%四氢呋喃洗 脱效果相当。
3.使用三元或四元混合有机溶剂 甲醇-四氢呋喃-水、甲醇-乙腈-水
反相离子抑制色谱——弱电解质
分析弱酸、弱碱或两性化合物等弱电解质物质
+
固定相
_
+
Na + (BH
+ RSO 3 )
RSO 3 )
m
S
离子对
影响保留因子k的因素：
1) 固定相—C18
2）离子对试剂种类：烷基磺酸钠→分析碱 四丁基季铵盐→分析酸 离子对试剂浓度:10~30mmol/L 3）流动相的pH—由于离子对的形成依赖于试样
组分的离解程度。
等度洗脱？ 梯度洗脱？
0.0
0.5
Methyl Paraben
1.0
1.5
2.0
2.5
Butyl Paraben
3.0
色谱基本参数
300
Propyl Paraben
min
保留时间、死时间、调整保留时间 保留体积、死体积、调整保留体积 峰高（峰面积） 峰宽 分离度 分配系数
生化实验讲义高效液相色谱技术(HPLC)word精品文档11页
7 高效液相色谱技术（HPLC）高效液相色谱（HPLC：High Performance Liquid Chromatography ）是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少的工具。
国际市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大的份额，增长速度最快。
高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。
适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。
其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。
目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。
7.1 基本原理流动相固定相流动相A AB CB CBA固定相——柱内填料，流动相——洗脱剂。
HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。
通常，按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类：分配色谱：——分配系数亲和色谱：——亲和力吸附色谱：——吸附力离子交换色谱：——离子交换能力凝胶色谱（体积排阻色谱）：——分子大小而引起的体积排阻分配色谱又可分为：正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。
反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。
用的最多，约占60～70％。
固定相（柱填料）：固定相又分为两类，一类是使用最多的微粒硅胶，另一类是使用较少的高分子微球。
后者的优点是强度大、化学惰性，使用pH范围大，pH=1～14，缺点是柱效较小，常用于第 140 页离子交换色谱和凝胶色谱。
最常使用的全孔微粒硅胶（3～10μm）是化学键合相硅胶，这种固定相要占所有柱填料的80％。
它是通过化学反应把某种适当的化学官能团（例如各种有机硅烷），键合到硅胶表面上，取代了羟基（－OH）而成。
HPLC原理及应用PPT教案
进样器
早期使用隔膜和停流进样器， 装在色谱柱入口处。现在大都 使用六通进样阀或自动进样器。 进样装置要求：密封性好，死 体积小，重复性好，保证中心 进样，进样时对色谱系统的压 力、流量影响小。HPLC进样方 式可分为：隔第23膜页/共4进3页 样、停流进 样、阀进样、自动进样。
六通进样阀
反相HPLC（reversed phase HPLC）： 由非极性固定相和极性流动相所 组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是 十八烷基键合硅胶(ODS柱，Octa Decyltrichloro Silane)，代表性的流动 相是甲醇和乙腈。
第14页/共43页
体积排阻色谱
第9页/共43页
6. 峰高(peak height,h)——峰的最高点至峰底的距离。 7. 峰宽(peak width,W)——峰两侧拐点处所作两条切线与基
线的两个交点间的距离。W=4σ。 8. 标准偏差(standard error,σ)——0.607倍峰高处所对应峰宽
之一半。 9. 半峰峰宽宽。(pWeahk/2w＝id2t.3h5a5tσ。half-height,Wh/2)——峰高一半处的 10. 峰面积(peak area,A)——峰与峰底所包围的面积。 A=＝
HPLC 系 统 ： Waters Alliance HPLC System; Waters 2420 ELSD 层 析 管 柱 ： Waters Carbohydrate Analysis Column 3.9 × 300 mm 移 动 相 ： CH3CN:H2O = 75:25 流 速 ： 1.4mL/min at 35 ℃
超临界色谱——流动相是在接近它的临界温度和压力下 工作的液体
HPLC高效液相色谱实验讲义
自动 进样器
储 液 瓶
溶剂输 送系统
手动 进样阀
色谱柱
数据采集 处理系统
检测器 废液瓶
定量分析
1.归一化法 (Normalized Percent) 2. 外标法 (External Standard) 3. 内标法 (Internal Standard)
定量分析
归一化法定量
将试样中所有组分的含量之和按100％计 算，以它们相应的色谱峰面积为定量参数。如 果试样中所有组分均能流出色谱柱，并在检测 器上都有响应信号，都能出现色谱峰，可用此 法计算各待测组分X的含量。其计算公式如下：
梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制 流动相的组成（如溶剂极性、离子强度和 pH 值等），适用于分析组分数多、性质相差较 大的复杂混合物样品，从而使所有组分都在 适宜条件下获得分离。
4 、检测器
检测器 特点 最低检测限 适用范围
紫外检测器（UV或UVD） 分为:①可变波长型②二 极管阵列检测器
①用于检测有外吸收的物质; ②灵 敏度较高,噪音低,线性范围宽,对流 速和温度波动不灵敏,可用于梯度洗 脱.
用于检测糖、高分子子化合 物、高级脂肪酸、磷脂、维 生素、氨基酸、甘油三酯及 甾体等几十类化合物
4 、检测器
电化学检测器 (ECD) 用于能氧化、还原的有机物质 的检测 1× 10-12g/ml 适用生物胺、酚、羰 基化合物、巯基化合 物等 尤其适合于糖类的检 测
示差折光检测器 (RID) ①属通用型检测器 ,利用组分 10-8g/ml 与流动相折射率之差进行检测 . ②稳定性好 ,操作方便 .③灵敏 度低 ,受环境温度、流动相组 成等波动的影响大 ,不适合梯 度洗脱 化学发光检测器 (CLD) ①高选择性、高灵敏度的新型 检测器 . ②设备简单,自身发 光 ,无需光源 ,价格便宜 Pg级 (10-12)
HPLC原理和操作详解.
高效液相色谱我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。
I．概论 (2)一、液相色谱理论发展简况 (2)二、HPLC的特点和优点 (2)三、色谱法分类 (3)四、色谱分离原理 (3)II．基本概念和理论 (5)一、基本概念和术语 (5)二、塔板理论 (8)三、速率理论（又称随机模型理论） (9)III．HPLC系统 (10)一、输液泵 (11)二、进样器 (13)三、色谱柱 (14)四、检测器 (17)五、数据处理和计算机控制系统 (20)六、恒温装置 (20)IV．固定相和流动相 (20)一、基质（担体） (20)二、化学键合固定相 (22)三、流动相 (23)1．流动相的性质要求 (23)2．流动相的选择 (24)3．流动相的pH值 (24)4．流动相的脱气 (25)5．流动相的滤过 (25)6．流动相的贮存 (26)7．卤代有机溶剂应特别注意的问题 (26)8．HPLC用水 (26)V．HPLC应用 (27)一、样品测定 (27)二、方法研究 (27)附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则 (28)一、对起草单位的要求： (28)二、对复核单位的要求： (28)I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
HPLC方法建立和优化精品PPT课件
AS :用来描述和表征两
种不同的溶质在色谱柱 里的分离过程
As：0.95～1.3（一般）
< 1.5 (可以接受）
2.1 色谱柱的性能指标 5、寿命:色谱柱失效
好 不好 很差
干净样品： 溶液均质，其成分在每次进样之间都能完全流出色谱柱
正常寿命： 1000～2000针（干净样品）
失效 : 1、柱效下降50％ 2、分离度降3/4 3、As>1.5
系Et列OH3 系AMc列eeOt4Hone 系TH列F 5
3.1 溶剂的基础知识
溶剂强度：
极性
水 乙醇
乙腈
二氯甲烷
非极性
正己烷
甲醇 异丙醇
四氰呋喃
乙酸乙脂
3.2 液相色谱的分离度
分离度Rs：
色谱的根本目的是将混合物分离成单一的化合物！
3.3 液相色谱的分离度
❖ 评价一个HPLC方法的标准之一：分离度。 ❖ 下面两个图哪个分离更好些？
HPLC方法建立的步骤
HPLC方法建立的步骤
样品的性质，确定分离目的
1.1 样品具有什么样的性质？
❖ 了解样品的相关情况：
所含化合物的数目； 化学结构（官能团）； 分子量； pKa值； UV光谱图； 被测组分在样品中的浓度范围； 样品的溶解度、沸点及其稳定性； 可能存在的干扰物质及样品的复杂程度等。 要分离的化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化合物、两性化
样品的稳定性、方法的稳定性、线性关系等求证。建立可 靠的稳定的分析方法。 ❖ 解决出现的问题 ❖ 方法的可移植性
1.7 完善HPLC方法
经常出现的问题：
二、色谱柱基础知识 （一）
2.1 色谱柱的性能指标