PCR产物法标记探针

实验步骤

1. 生物素标记

应用bio-11-dUTP部分替代dTTP搀入PCR扩增探针中

1) 配制反应体系

dNTP的组成dATP、dCTP、dGTP各20mmol，dTTP 15mmol，

bio-11-dUTP 5mmol混匀，其他试剂如常规PCR。

2) 25循环后，冻存，取出化冻，趁下层水相尚在冰冻状态，吸尽石蜡油

3) 水相中20mg/ml糖原1ul，pH5.2 2.5MnaAC10ul，220ul无水乙醇。混匀后－20℃过夜

4) 离心取沉淀，冷冻干燥后100ul水或TE复溶。

2. 地高辛标记

应用dig-11-dUTP部分替代dTTP搀入PCR扩增探针中

1) 配制反应体系

dNTP的组成dATP、dCTP、dGTP各200umol，dTTP 130umol，

bio-11-dUTP 70umol混匀，其他试剂如常规PCR。

2) 35循环扩增产物

30 扩增产物纯化与DIG随机标记探针方法相同（仅沉淀时，50ulPCR 反应液中加入5ul4MliCl和150ul冰乙醇）。

注意事项

1. 标记时标记基团在dNTP中占的比例不能太高，因标记基团与dTTP相比具位阻效应，比例太高PCR扩增及以后的杂交都要受到影响。

2. 靶DNA用量不能太高，生物素标记中控制在0.2fmol左右；地高辛标记中可低至0.1ng。

探针标记

核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。第四节非放射性标记的核酸探针放射性标记核酸探针在使用中的限制，促使非放射性标记核酸探针的研制迅速发展，在许多方面已代替放射性标记，推动分子杂交技

术的广泛应用。目前已形成两大类非放射标记核酸技术，即酶促反应标记法和化学修饰标记法。酶促反应标记探针是用缺口平移法，随机引物法或末端加尾法等把修饰的核苷酸如生物素-11-dUTP掺入到探针DNA中，制成标记探针，敏感度高于化学修饰法，但操作程序复杂，产量低，成本高。化学修饰法是将不同标记物用化学方法连接到DNA分子上，方法简单，成本低，适用于大量制备（>50μg）如光敏生物素标记核酸方法，不需昂贵的酶，只在光照10～20min，生物素就结合在DNA 或RNA分子上。非放射性标记核酸探针方法很多，现介绍常用的几种方法如下：一、生物素标记核酸探针方法生物素标记的核苷酸是最广泛使用的一种，如生物素-11-dUTP，可用缺口平移或末端加尾标记法。实验发现生物素可共价连接在嘧啶环的5位上，合成TTP或UTP的类似物。在离体条件下，这种生物素化dUTP可作为大肠杆菌多聚酶I（DNA酶I）的底物掺入带有缺口的DNA或RNA，得到生物素标记的核酸探针。这种标记方法称为缺口平移法。用标记在DNA上的生物素与链霉亲合素-酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记物进行检测。

地高辛标记核酸探针的标记方法

地高辛标记核酸探针的标记方法 Last revision on 21 December 2020

地高辛标记核酸探针的标记方法核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。其化学结构如图1 所示。采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA

探针中。RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。 1 地高辛标记核酸探针的主要标记方法 1. 1 DNA 探针的标记方法 1. 1. 1 PCR 掺入法这种标记方法是通过聚合酶链式反应，在Taq 酶的作用下，将DIG-11-dUTP 掺入到新合成的DNA 链中。以本法标记的探针不但灵敏度高，产量也很高。少量的基因组DNA(1ng～50ng) 便可直接通过PCR 进行扩增、标记。 1. 1. 2 随机引物法用随机引物法可将DIG-11-dUTP 标记于DNA 链上。为得到最佳标记效果，标记前模板DNA 需作线性处理，而且至少要用苯酚-氯仿进行一次抽提，再用乙醇沉淀。100～10000 碱基的模板链均可被有效地标记，但大于10000 碱基的模板链则需要在标记前作限制酶切消化。处理好的模板加入随机引物，按碱基互补原则，随机引物与模板DNA 退火后由Klenow 片段从引物3' 端延伸引物，便可将DIG-11-dUTP 均匀掺入到新合成的DNA 链中。

地高辛标记核酸探针的标记方法

元，是一种类固醇半抗原分子。其化学结构如图1 所示。采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR 法将其掺入到DNA探针中。RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。 1 地高辛标记核酸探针的主要标记方法 1. 1 DNA 探针的标记方法 1. 1. 1 PCR 掺入法这种标记方法是通过聚合酶链式反应，在Taq 酶的作用下，将DIG-11-dUTP 掺入到新合成的DNA 链中。以本法标记的探针不但灵敏度高，产量也很高。少量的基因组DNA(1ng～50ng) 便可直接通过PCR 进行扩增、标记。 1. 1. 2 随机引物法用随机引物法可将DIG-11-dUTP 标记于DNA 链上。为得到最佳标记效果，标

常用核酸探针标记方法

常用核酸探针标记方法 1、切口平移法（nick translation）原理：先用适量的DNase I 在Mg2+存在下，在双链DNA 上打开若干个单链缺口。利用E. coli DNA 聚合酶I 的5'- 3' 核酸外切酶活性在切处将旧链从5’-末端逐步切除。同时DNA 聚合酶I的5'- 3'聚合酶活性的作用下，顺序将dNTP连接到切口的3’-末端-OH上，以互补的DNA 单链为模板合成新的DNA单链。图1 切口平移法原理示意图特点：1）各种螺旋状态（超螺旋、闭环及开环）及线性的双链DNA均可作为缺口平移法的标记底物。但单链DNA和RNA不能采用此方法进标记。双链DNA小片段（>100-200bp）也不是此法标记的理想底物。 2）DNA多聚酶必须是E·Coli DNA多聚酶的全酶。 3）DNA模板要用纯化过DNA

2、随机引物法（random priming）原理：将待标记的DNA探针片段变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡核苷酸为引物，大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（E·Coli DNA polymerase I Klenow Fragment）的催化下，合成与探针DNA互补的DNA链。当反应液中含有标记的dNTP时，即形成标记的探针。图2 随机引物标记法原理示意图特点：1）除了能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA和RNA探针的标记。 2）所得到的标记产物是新合成的DNA单链，而所加入的DNA片段本身并不能被标记。 3）新形成的标记DNA单链的长度与加入寡核苷酸引物的量成反比，因为加入的寡核苷酸数量越多，合成起点也越多，得到的片段的长度也越短。按标准方法得到的标记产物长度一般为200-400bp。

第六章探针制备与标记技术

第六章探针制备与标记技术实验一核酸探针的制备一、原理和用途核酸探针制备的方法很多，经典的方法包括以重组单链噬菌体为模板的单链DNA 探针的合成，利用体外转录原理进行的单链RNA探针的合成，以mRNA为模板进行的cDNA探针的合成，以及寡核苷酸的人工合成；目前更为常用且简便的是双链DNA探针的制备，其来源包括纯化的限制性酶切片段或PCR产物。本实验以M13噬菌体为模板，学习单链DNA探针合成的基本操作。单链DNA探针合成的基本原理是将人工合成的寡核苷酸与重组M13噬菌体中的单链DNA退火结合，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段（简称Klenow酶）对退火引物的延伸作用，催化与模板链互补的标记探针的合成。由于反应产物长度及放射性标记dNTP结合量的均一性不高，通常需要对反应产物进行限制酶切和琼脂糖凝胶电泳分离，以便获得长度一致的双链DNA探针。单链DNA探针特别适合用S1核酸酶或绿豆核酸酶进行的mRNA 51端结构分析，真核基因外显子位置的确定，以液体杂交进行的mRNA定量，无载体序列探针的制备，以及基因或cDNA特定区域的显示等。由于M13噬菌体载体的多克隆部位上游多有lac 基因或T7等启动子序列，根据这些序列合成的寡核苷酸可以作为通用引物，用于任何与噬菌体插入片段互补的单链DNA探针的制备。二、实验材料单链M13噬菌体DNA。三、溶液与缓冲液 1．10 mol/L 醋酸钠 2．1 mol/L DTT 3．0.5 mol/L EDTA，pH 8.0 4．5 mol/L NaCl 5．1：1（V/V）苯酚/氯仿混合液 6．10×Klenow酶缓冲液 7．Klenow酶 8．限制性内切酶及其缓冲液 9．20 mmol/L dCTP、dGTP、dTTP混合液 10．5 pmol/μL M13噬菌体通用引物（溶解于pH 7.6的TE缓冲液中） 11．40 μmol/L和20 mmol/L dATP

地高辛标记探针的Southern 杂交技术

地高辛标记探针的Southern 杂交技术根据核酸变性与复性的特性，特定核苷酸序列的单链DNA或RNA能够在一定条件下与具有互补性的核酸链退火形成双链结构，称之为核酸杂交。将已知的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA进行标记，制成核酸探针，就可以用它检测样品中是否存在同源序列，或确定不同物种之间的亲缘关系，已成为分子生物学中一类重要的检测手段，在科学研究和实践中具有十分广泛的用途。它可用于基因组特定DNA序列的定位，测定相关片段的同源性、从cDNA文库、基因组文库中筛选完整基因等。还可以用于构建DNA分子的酶切图谱和遗传图—指纹分析等。核酸杂交检测都是在滤膜上进行的，常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。其基本过程包括以下几步。首先将待检样品DNA或RNA分子直接点加到滤膜上，或经过凝胶电泳分离再通过毛细管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，这个过程称为核酸印迹（nucleic acid blotting）转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法（dot and slot blotting）、菌落和嗜菌斑印迹法（colony and plaque blotting）；然后将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。最后，经过放射自显影技术或光化学、免疫学技术显示出不同的颜色，根据颜色的有无和深浅判定结果。根据操作方式和检测对象的不同，核酸杂交技术主要有以下几种：斑点杂交技术（Dot blot）、Southern杂交技术（Southern blot）、Northern杂交技术（Northern blot）。前两者用于检测DNA，后者用于检测RNA。本实验主要介绍Southern杂交技术。 1主要内容 1. Southern Blot方法的原理。 2. DNA琼脂糖凝胶电泳。 3. DNA转移至硝酸纤维素膜/尼龙膜及膜处理。 4. 介绍随机引物法标记DNA探针，Southern blot的预杂交、杂交及显色过程。2目的要求掌握Southern blot方法的原理；掌握随机引物法标记DNA探针，印迹法转移DNA 至硝酸纤维素膜及膜处理。 3 实验原理 Southern杂交技术是由Edward M. Southern在1975年首先发明的用于检测DNA 的一种核酸杂交技术，并因此而得名。Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而

地高辛标记探针的Southern印迹方案

地高辛标记探针的DNA印迹方案 Southern blot using DIG Prober (分子生物学实验室) Step I 采用地高辛高效标记混合物(ROCHE) 标记DNA探针 1 以质粒为模板，PCR扩增序列特异性片段，回收片段，并测定浓度浓度测定：将回收产物取1μl稀释5倍，标准分子量的标记物MAKER分别点1μl，2μl，4μl，6μl.然后比较回收产物的条带亮度与MAKER比较后，可以粗略估算浓度。 2 取1μg模板（第1步扩增回收产物）于1.5ml的eppendorf管中，加入灭菌双蒸水至终体积为16μl。 3 沸水浴处理10min后迅速于冰上冷却使DNA变性（1）摇匀DIG-High Prime（vial 1），取4μl加入已热变性的模板DNA中，混匀后，瞬时离心，37℃保温20h，65℃处理10min终止反应。 4取１μl电泳检测，标记后的条带稍大于标记前片断。５标记好的DNA探针－20℃保存。 Step II 基因组DNA酶切 1 提取高质量的基因组DNA，浓度>1μg/μl; 测定浓度的方法同测定探针浓度方法一样。 2 选择合适的内切酶（酶切的DNA量20μg左右。注意考虑到纯化的损失，约30%，酶切DNA浓度过大时，可以考虑多做几管做浓缩）。 50μl酶切反应体系： EcoR I (15U/μl ) 5μl 10×M buffer 5μl gDNA 10μl（约10-20μg） O up to 50μl ddH 2 注：有些内切酶需加BSA，请参照内切酶说明（包括最适酶切温度）。 3 37℃酶切12h （电泳检测），视酶切情况可延长酶切时间，直至酶切完全。65℃保温10min停止酶切反应。

Fish探针标记方法大全

探针标记方法大全 1、DNA的缺口平移法缺口平移是一种快速、简便、成本相对较低以及生产高比活性均一标记DNA的方法。该技术可以制备序列特异的探针。当使用重组质粒探针时，虽然任何形式的双链DNA都可以进行缺口平移标记。但通常使用限制性核酸内切酶将插入片段进行酶切和凝胶电泳纯化后再进行缺口平移标记。此外，用这种探针进行杂交可产生较低的背景信号。 2、DNA的随机引物法这种方法是使用寡核苷酸引物和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段来标记DNA片段。这种方法可代替缺口平移产生均一的标记探针外，还在许多方面优于缺口平移法，比如标记核苷酸在DNA探针中的掺入率可达50％以上。由于在反应过程中加入的DNA片段不被降解，故在随机引物反应中加入的DNA可少于200 ng，甚至10 ng也能有效地标记。DNA片段的大小不影响标记的结果。标记物沿所加入的全长DNA被均等地掺入。标记的探针可以直接使用而不需要去除未掺入的核苷酸；单链双链DNA都可作为随机引物标记的模版。随机引物可用于较小的DNA片段（100~500 bp），而缺口平移法对大DNA片段（>1000 bp）效果最好。随机引物法的主要缺点是产生的标记探针量比缺口平移的要少些，此外环状DNA不能有效地标记，必须先用限制性内切核酸酶线形化或用碱法或DNA酶Ⅰ产生缺口。 3、RNA的体外转录法体外转录法标记RNA探针可用于商品化转录质粒来制备。这些质粒中应该包括SP6、T3、或T7 RNA聚合酶的RNA启动位点和，而这些启动位点则与多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）相邻。 4、RNA的寡脱氧核苷酸法克隆质粒pSP64、pGEM-3、pGEM-4等含邻近MCS的SP6RNA启动子，可作为从DNA寡核苷酸模版产生RNA探针的基础。这两种标记方法产生探针量大，而且产生的探针不受载体序列的影响，所需要的线性化的质粒DNA大约1 ug，但需要高纯度的模板。 5、寡核苷酸的“接尾法” 末端脱氧核苷酸转移酶可将三磷酸脱氧核苷加到DNA分子游离的3’-OH末端。这种脱氧核苷酸连接将在探针3’末端形成一个延伸的“尾巴”。用这种方法可加上许多基因以产生高比活性的探针，适用于基因库中克隆序列的鉴定，基因组DNA样品的点突变检测和原位杂交。 6、5’端寡核苷酸的T4多聚核苷酸激酶法 T4多聚核苷酸激酶可将γ-32P-ATP的γ-磷转移到游离的5’-OH端上。合成寡脱氧核糖核苷酸时，它们通常未被磷酸化，因而在5’端应含有一个羟基。由于探针分子只掺入了一个同位素分子，故探针活性与其长度有关。短寡核苷酸可被高比活性标记，而较长的探针活性则随其长度增加而降低。这种激酶标记方法最常用于DNA序列测定。 7、聚合酶链反应标记法聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）用于标记比活性DNA片段，这种技

核酸标记各种标记物及标记方法

1．核素标记物放射性核素是目前应用最多的一类探针标记物。放射性核素的灵敏度极高，可以检测到10-14～10-18克的物质，在最适条件下可以测出样品中少于1000个分子的核酸含量。常用标记核酸探针的核素有32P、3H、35S，在Southern印迹杂交中以“P最常用。还应根据标记方法的不同选择相应标记方位的核素，一般情况下，大多数标记方法需要的是a—32P，而5，末端标记必须是r-32P。 2．非放射性标记物多年来，科学家们致力于寻找一些安全、可靠、灵敏度高的物质代替放射性核素用于核酸分子杂交，并取得了一定的进展，部分非放射性标记物已在国内外逐步推广使用。其优点是无放射性污染，可以较长时间存放，从而更便于临床诊断等方面的应用。但此类非放射性标记物的缺点是灵敏度及特异性都不太高。根据其检测方法，非核素标记物可分为以下4类。 (1)半抗原：生物素(biotin)和地高辛(DIG)都是半抗原，可以利用这些半抗原的抗体进行免疫学检测，根据显色反应检测杂交信号。这两种物质是目前使用较普遍的非核素标记物。 (2)配体：生物素不仅是半抗原，故可用生物素与亲和素反应进行杂交信号的检测。 (3)荧光素：如FITC、罗丹明类等，可以发出紫荧光进行观察，主要适用于细胞原位杂交。 (4)化学发光探针：一些标记物可与某种物质反应产生化学发光现象，通过化学发光可以像核素一样直接使X线胶片上的乳胶颗粒感光。化学发光探针可能是今后非核素标记物研究的主要方向。三、标记方法体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，3H-尿苷可掺入到RNA中体外标记法：化学标记法：标记物分子上的活性基因与探针分子上的某些基因反应，标记物直接结合到探针分子上酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然后利用酶促法将标记的核苷酸掺入到探针上酶促标记法 (一)切口平移法(nick translation) 1、利用DNaseI在DNA双链上造成单链切口 2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性在切口处将旧链从5′末端